高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-ESI-MS MS)檢測(cè)人血漿中羅紅霉素濃度

1、Application Note: CM0026高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-ESI-MS/MS檢測(cè)人血漿中羅紅霉素濃度郭蓓寧 1 郁繼誠(chéng)1 張菁1 曹?chē)?guó)英1 施耀國(guó)1 劉飛2(1 復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院抗生素研究所, 上海200040，2 賽默飛世爾科技應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室Key Words 羅紅霉素 高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法 血藥濃度摘 要建立了人血漿中羅紅霉素的高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS檢測(cè)方法。血漿樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白后，反相液相色譜分離凈化后進(jìn)行質(zhì)譜分析, 采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(SRM進(jìn)行檢測(cè)，羅紅霉素和內(nèi)標(biāo)物克拉霉素的檢測(cè)離子對(duì)分別為m/z 837.5m/z 679.5和

2、m/z 748.5m/z 158.1。羅紅霉素在101,000 ng/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r20.999，最低定量限(LLOQ為10 ng/ml 。在人血漿基質(zhì)中，高、中、低濃度及LLOQ (800、400、30和10 ng/ml四個(gè)添加水平下，羅紅霉素的平均提取回收率為96.7 %，日內(nèi)及日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 4.5 和 8.2 。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明血漿樣品室溫下放置24h 或處理后放置12h 、80 放置3周及-80凍融3次對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。結(jié)果表明，該方法樣品處理簡(jiǎn)單、靈敏、特異性高，為羅紅霉素臨床藥代動(dòng)力學(xué)等研究提供了簡(jiǎn)捷、準(zhǔn)確的分析測(cè)定方法。關(guān)鍵詞 羅紅霉素，高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法

3、，血藥濃度Determination of roxithromycin in human plasma using liquid chromatography electrospray ionization tandam mass spectrometryGUO Bei-Ning, ZHANG Jing, YU Ji-Cheng, CAO Guo-Ying，SHI Yao-Guo(Institute of Antibiotics, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, ChinaAbstract To establish a

4、method for determination of roxithromycin in human plasma by LC-ESI-MS/MS. The plasma samples were applied to a C18 column interfaced with a triple quadrupole tandem mass spectrometer after pretreated with acetonitrile. Positive electrospray ionization was employed as the ionization source. The anal

5、yte and I.S. clarithromycin were detected by the use of selected reaction monitoring (SRM of the transitions m/z 837.5m/z 679.5 for roxithromycin and m/z 748.5m/z 158.1 for I.S, respectively. The method was linear in the concentration range of 10-1,000 ng/ml for plasma roxithromycin samples. The low

6、er limit of quantification (LLOQ was 10 ng/ml. The mean extraction recovery of roxithromycin was 96.7. The intra- and inter-day relative standard deviationfor roxithromycin plasma samples at LLOQ and three QC concentrations (30, 400 and 800 ng/ml across six validation runs was less than 4.5% and 8.2

7、%, respectively. A rapid and sensitive LC-MS/MS method was developed and validated for the determination of roxithromycin in human plasma. It can be applied to evaluate the pharmacokinetics of roxithromycin. Key words roxithromycin, LC-MS/MS, concentration1引言羅紅霉素(Roxithromycin為14元環(huán)新的半合成大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，是紅霉素

8、14元環(huán)9位酮基為O-(2-甲氧基 甲基肟所取代，其抗菌活性與紅霉素相仿或略差，但血藥濃度為大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素中相對(duì)較高，在扁桃體、肺、前列腺及其他泌尿生殖道組織中的藥物濃度可達(dá)有效治療水平，臨床主要用于敏感菌引起的呼吸道感染包括鼻竇炎、中耳炎、支氣管炎及肺炎、皮膚軟組織感染以及衣原體所致的泌尿生殖道感染。有關(guān)羅紅霉素的血藥濃度測(cè)定, 國(guó)外多采用高效液相電化學(xué)(HPLC-EC檢測(cè)1-2，國(guó)內(nèi)多采用微生物方法3-5和高效液相色譜紫外檢測(cè)法(HPLC-UV 6，但由于羅紅霉素原形藥物和代謝物都有活性, 微生物法專(zhuān)屬性不高；采用高效液相色譜紫外檢測(cè)法, 由于羅紅霉素在近紫外端210 nm 處有最大吸收

9、，內(nèi)源性物質(zhì)常有干擾，最低檢測(cè)限僅為0.25 mg/L；也有作者7采用柱前衍生化后熒光檢測(cè)的方法減少內(nèi)源性物質(zhì)干擾，但存在靈敏度低和操作繁瑣的問(wèn)題，相對(duì)來(lái)說(shuō)LC-MS 方法8更有優(yōu)勢(shì)。本文建立的血漿中羅紅霉素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS測(cè)定法，方法簡(jiǎn)單、靈敏，血樣需要量及進(jìn)樣量少，分析時(shí)間短，實(shí)用性強(qiáng)，可用于臨床藥代動(dòng)力學(xué)等研究。2 實(shí)驗(yàn)部分2.1 儀器、試劑和材料高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS儀由Waters Alliance 2690高效液相色譜儀（美國(guó)Wa t e r s 公司）和T S Q Quantum Discovery三級(jí)四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)，Thermo

10、Fisher Scientific公司 組成，Xcalibur 2.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Millipore 純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore 公司）； METTLERAE240 分析天平(上海Mettler 公司 ；N-EVAPTM112氮吹儀(美國(guó)Organomation 公司 ；ABBOTT 離心機(jī)(德國(guó)Hettich 公司 ；-80 超低溫冰箱(美國(guó)Thermo 公司 。藥物濃度測(cè)試用對(duì)照品：羅紅霉素，批號(hào)30351-200303，含量946 U/mg， 購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；克拉霉素，批號(hào)33386-255-3，含量990 g/mg ，由Abbott 公司提供；乙腈（色譜純），購(gòu)自S

11、igma 公司；甲酸銨（分析純），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸（分析純），購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；空白血漿取自健康受試者。2.2 LC-MS/MS條件氮?dú)饬飨聯(lián)]干，殘?jiān)?00 L流動(dòng)相溶解，5 L進(jìn)樣分析。3 結(jié)果與討論3.1 LC-MS/MS條件的選擇克拉霉素是羅紅霉素的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，較紅霉素穩(wěn)定性好，以克拉霉素為內(nèi)標(biāo)保證了方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性；血漿樣品直接用乙腈蛋白沉淀，方法簡(jiǎn)單，樣品需要量少，適合大批量生物樣品濃度的檢測(cè)。在本試驗(yàn)的LC-MS/MS條件下, 羅紅霉素和內(nèi)標(biāo)物克拉霉素的保留時(shí)間分別在1.49 min 和1.41 min, 峰形良好，分析時(shí)間僅為3 min。電噴霧

12、電離源正離子模式（ESI+），羅紅霉素分子離子m/z 837.5產(chǎn)生的碎片離子中，以碎片離子m/z 679.5的信號(hào)最強(qiáng)且穩(wěn)定，克拉霉素分子離子m/z 748.5 產(chǎn)生的信號(hào)較強(qiáng)且穩(wěn)定的碎片離子為m/z 158.1，因此選擇的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM ）離子對(duì)為羅紅霉素m/z 837.5m/z 679.5，克拉霉素 m/z 748.5 m/z 158.1，見(jiàn)圖1。3.2 方法學(xué)考察處理后，室溫下分別放置0 h、3 h、6 h、9 h和12 h，以0 h為基準(zhǔn)，放置12 h后羅紅霉素回收率為90.9102.1 %；在80 低溫冰箱中放置3周后，羅紅霉素回收率為90.598.0 %；經(jīng)80 凍融3次后

13、，羅紅霉素回收率為93.8106.7 %。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，該血漿樣品室溫下放置24h 或處理后放置12h 、80 放置3周及-80 凍融3次對(duì)羅紅霉素的測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。4 結(jié) 論本文建立的血漿中羅紅霉素的高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS檢測(cè)法，簡(jiǎn)單、靈敏、實(shí)用性強(qiáng)，可用于藥代動(dòng)力學(xué)研究和特殊情況下的藥物濃度監(jiān)測(cè)。 References1. Birkett D J, Robson R A, Grgurinovich N, Tonkin A. Ther. Drug Monit., 1990, 12 (1: 6571.2. Denotes-Mainaird F M, Vinc

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