分子定向進(jìn)化技術(shù)

1、 molecular directed evolution趙亞蘭11234主要內(nèi)容分子定向進(jìn)化技術(shù)的概述及定義分子定向進(jìn)化技術(shù)的概述及定義分子定向進(jìn)化技術(shù)的原理分子定向進(jìn)化技術(shù)的原理分子定向進(jìn)化技術(shù)具體過(guò)程分子定向進(jìn)化技術(shù)具體過(guò)程分子定向技術(shù)的應(yīng)用及展望分子定向技術(shù)的應(yīng)用及展望2 人們?cè)噲D利用結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)和定人們?cè)噲D利用結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)和定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行合理的改造，點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行合理的改造，這些方法難度較大且要在了解蛋白質(zhì)的這些方法難度較大且要在了解蛋白質(zhì)的三維空間的基礎(chǔ)上才能進(jìn)行。而分子定三維空間的基礎(chǔ)上才能進(jìn)行。而分子定向進(jìn)化技術(shù)是在不需了解相關(guān)蛋白的三向進(jìn)化技術(shù)是在不需了

2、解相關(guān)蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)的情況下在維空間結(jié)構(gòu)的情況下在體外模擬體外模擬自然進(jìn)自然進(jìn)化的過(guò)程化的過(guò)程( (隨機(jī)突變、重組和選擇隨機(jī)突變、重組和選擇) )，使，使基因發(fā)生大量變異，并定向選擇出所需基因發(fā)生大量變異，并定向選擇出所需性質(zhì)或功能的蛋白。性質(zhì)或功能的蛋白。3概概 述述 生物在漫長(zhǎng)的時(shí)生物在漫長(zhǎng)的時(shí)間里經(jīng)過(guò)自發(fā)突變間里經(jīng)過(guò)自發(fā)突變 (突變與重組突變與重組)，通，通過(guò)自然選擇，逐漸過(guò)自然選擇，逐漸形成了多樣性的生形成了多樣性的生物。物?；蛟诙虝r(shí)間通過(guò)基因在短時(shí)間通過(guò)人為引發(fā)突變，經(jīng)人為引發(fā)突變，經(jīng)過(guò)人工篩選，形成過(guò)人工篩選，形成滿足人們需要的新滿足人們需要的新功能或者優(yōu)良性能功能或者優(yōu)良性

3、能生物物質(zhì)生物物質(zhì)(酶蛋白酶蛋白)。分子定向進(jìn)化分子定向進(jìn)化 自然進(jìn)化自然進(jìn)化自發(fā)、不定向、自然選擇、慢自發(fā)、不定向、自然選擇、慢人為、定向、人工選擇、快人為、定向、人工選擇、快4一、分子定向進(jìn)化技術(shù)的定義一、分子定向進(jìn)化技術(shù)的定義 分子定向進(jìn)化分子定向進(jìn)化(molecular directed evolution)是在分子水平研究所需生物的是在分子水平研究所需生物的特定基因或蛋白質(zhì)，是在體外模擬特定基因或蛋白質(zhì)，是在體外模擬突變突變、重組重組和和選擇選擇的自然進(jìn)化機(jī)制，使進(jìn)化朝的自然進(jìn)化機(jī)制，使進(jìn)化朝著人們需要的方向發(fā)展其實(shí)質(zhì)，是達(dá)爾著人們需要的方向發(fā)展其實(shí)質(zhì)，是達(dá)爾文進(jìn)化論在分子水平上的延

4、伸和應(yīng)用。文進(jìn)化論在分子水平上的延伸和應(yīng)用。5二、分子定向進(jìn)化技術(shù)的過(guò)程原理二、分子定向進(jìn)化技術(shù)的過(guò)程原理6通常通常通常一個(gè)典型的定向進(jìn)化技術(shù)涉及三步通常一個(gè)典型的定向進(jìn)化技術(shù)涉及三步: : 1.1. 通過(guò)通過(guò)隨機(jī)突變隨機(jī)突變和和( (或或) )基因體外重組基因體外重組創(chuàng)造基創(chuàng)造基 因因多樣性，多樣性，即即將目的蛋白的編碼基因進(jìn)行將目的蛋白的編碼基因進(jìn)行 突突 變或是隨機(jī)重組產(chǎn)生一個(gè)含有多個(gè)基因變或是隨機(jī)重組產(chǎn)生一個(gè)含有多個(gè)基因 的突變體庫(kù)。的突變體庫(kù)。2.2.導(dǎo)入適當(dāng)載體后導(dǎo)入適當(dāng)載體后構(gòu)建突變文庫(kù)構(gòu)建突變文庫(kù)；3.3.通過(guò)通過(guò)高通量的篩選高通量的篩選方法方法，選擇陽(yáng)性突變子。，選擇陽(yáng)性突變

5、子。這個(gè)過(guò)程可重復(fù)循環(huán)這個(gè)過(guò)程可重復(fù)循環(huán)，直至得到預(yù)期性狀的酶。，直至得到預(yù)期性狀的酶。71.基因的體外突變基因的體外突變無(wú)性進(jìn)化：無(wú)性進(jìn)化：易錯(cuò)易錯(cuò)PCR；物理、化學(xué)方法介導(dǎo)的隨機(jī)誘變；物理、化學(xué)方法介導(dǎo)的隨機(jī)誘變；由致突變菌株產(chǎn)生的隨機(jī)突變由致突變菌株產(chǎn)生的隨機(jī)突變。有性進(jìn)化：有性進(jìn)化： DNA改組技術(shù)；改組技術(shù)；隨機(jī)引物體外重組法；隨機(jī)引物體外重組法；重疊延伸法。重疊延伸法。三、分子定向進(jìn)化的具體選擇策略三、分子定向進(jìn)化的具體選擇策略8易錯(cuò)易錯(cuò)PCR(Error Prone PCRError Prone PCR) 利用利用PCR過(guò)程中出現(xiàn)的堿基錯(cuò)配，過(guò)程中出現(xiàn)的堿基錯(cuò)配，對(duì)特定基因進(jìn)行隨

6、機(jī)誘變的技術(shù)。對(duì)特定基因進(jìn)行隨機(jī)誘變的技術(shù)。 9向反應(yīng)體系中摻入核酸類(lèi)似物向反應(yīng)體系中摻入核酸類(lèi)似物(如次如次 黃嘌呤核苷酸黃嘌呤核苷酸)限制其中一種核苷酸的用量，使聚合限制其中一種核苷酸的用量，使聚合 酶優(yōu)先選擇其他三種，從而增加錯(cuò)配酶優(yōu)先選擇其他三種，從而增加錯(cuò)配 率。率。 通過(guò)引物通過(guò)引物5 5端引端引入錯(cuò)配堿基，插入或入錯(cuò)配堿基，插入或 缺失一個(gè)或多個(gè)堿基。這種突變方法缺失一個(gè)或多個(gè)堿基。這種突變方法 是靶向的，突變發(fā)生在是靶向的，突變發(fā)生在DNADNA模板上預(yù)先模板上預(yù)先 確定的位置。確定的位置。向向PCR反應(yīng)體系中引入突變的方法：反應(yīng)體系中引入突變的方法：10 在在TaqDNA聚合

7、酶催化的聚合酶催化的PCR反應(yīng)體反應(yīng)體系中加入一定量的系中加入一定量的Mn2+替代天然的輔助替代天然的輔助因子因子Mg2+，由于，由于TaqDNA聚合酶缺乏校聚合酶缺乏校對(duì)活性對(duì)活性(3 3- -5 5外切酶活性外切酶活性)，其錯(cuò)配率會(huì)，其錯(cuò)配率會(huì)大大增加，通?？梢赃_(dá)到每千堿基對(duì)大大增加，通?？梢赃_(dá)到每千堿基對(duì)1個(gè)突變左右。個(gè)突變左右?？梢酝ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)核苷酸、酶、可以通過(guò)調(diào)節(jié)核苷酸、酶、 鎂離子等鎂離子等的用量，并加入錳離子等來(lái)控制錯(cuò)配的的用量，并加入錳離子等來(lái)控制錯(cuò)配的程度。程度。11連續(xù)易錯(cuò)連續(xù)易錯(cuò)PCR(Sequential error-prone PCR)將第一次將第一次PCR擴(kuò)增擴(kuò)增的有

8、益突變作為的有益突變作為下一次下一次PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增的模板，這樣連續(xù)模板，這樣連續(xù)反復(fù)隨機(jī)誘變，反復(fù)隨機(jī)誘變，使得每次獲得的使得每次獲得的少量突變進(jìn)行積少量突變進(jìn)行積累累而得到更重要而得到更重要的有益突變。的有益突變。12重疊延伸重疊延伸PCR(SOE-PCR)原理：原理：重疊延伸重疊延伸PCR 技術(shù)由于使用了具有技術(shù)由于使用了具有互補(bǔ)末端的引物，使互補(bǔ)末端的引物，使PCR 產(chǎn)物形成產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸，將不同來(lái)源中通過(guò)重疊鏈的延伸，將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來(lái)。可簡(jiǎn)單的擴(kuò)增片段重疊拼接起來(lái)?？珊?jiǎn)單迅速的將兩個(gè)迅速的將兩個(gè)D

9、NA 片段連在一起，片段連在一起，用于融合基因的構(gòu)建。用于融合基因的構(gòu)建。135，5，3，3，5，A基因B基因3，5，abcda.不需要設(shè)計(jì)酶切識(shí)別位點(diǎn)，可將不同來(lái)不需要設(shè)計(jì)酶切識(shí)別位點(diǎn)，可將不同來(lái) 源的源的DNA識(shí)別位點(diǎn)連接起來(lái)構(gòu)建融合基識(shí)別位點(diǎn)連接起來(lái)構(gòu)建融合基 因；因；b.不需要經(jīng)過(guò)接頭處理連接酶，利用不需要經(jīng)過(guò)接頭處理連接酶，利用PCR 拼接基因；拼接基因；c.可進(jìn)行高保真定點(diǎn)、定位突變，并且突可進(jìn)行高保真定點(diǎn)、定位突變，并且突 變和重組可以同時(shí)進(jìn)行；變和重組可以同時(shí)進(jìn)行；d.容易產(chǎn)生隨機(jī)突變，需要對(duì)容易產(chǎn)生隨機(jī)突變，需要對(duì)PCR反應(yīng)條反應(yīng)條 件進(jìn)行優(yōu)化。件進(jìn)行優(yōu)化。 特點(diǎn)特點(diǎn)1516

10、DNA改組技術(shù)改組技術(shù)(DNA shuffling)又稱又稱有性有性PCR，指，指DNA分子的體外重組，分子的體外重組，是基因在分子水平上進(jìn)行有性重組。通是基因在分子水平上進(jìn)行有性重組。通過(guò)改變單個(gè)基因過(guò)改變單個(gè)基因(或基因家族或基因家族)原有的核原有的核苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達(dá)產(chǎn)苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達(dá)產(chǎn)物以新功能。物以新功能。17從突變體基因庫(kù)中分離出來(lái)的DNA片段用脫氧核糖核酸酶I隨機(jī)切割得到的隨機(jī)片段經(jīng)過(guò)不加引物的多次PCR循環(huán)在PCR循環(huán)過(guò)程中，隨機(jī)片段之間互為模板和引物進(jìn)行擴(kuò)增，直到獲得全長(zhǎng)的基因，這導(dǎo)致來(lái)自不同基因片段之間的重組。18基因家族改組技術(shù)基因家族改組技

11、術(shù)(family shuffling)191. DNaseI產(chǎn)生隨機(jī)片段；2. 隨機(jī)片段變性；3. 隨機(jī)片段復(fù)性；4.延伸(重復(fù)2-4步)20幾種不同突變方法產(chǎn)生的突變積累的情況比較21隨機(jī)引物體外重組法隨機(jī)引物體外重組法(RPR) RPR RPR 法是用一套隨機(jī)序列引物法是用一套隨機(jī)序列引物, ,產(chǎn)生產(chǎn)生互補(bǔ)于模板不同位點(diǎn)的短互補(bǔ)于模板不同位點(diǎn)的短DNADNA片段庫(kù)片段庫(kù)( (由于由于堿基錯(cuò)配堿基錯(cuò)配, ,這些短這些短DNADNA片段含有少量的點(diǎn)突片段含有少量的點(diǎn)突變變),),然后進(jìn)行類(lèi)似于然后進(jìn)行類(lèi)似于DNADNA改組的全長(zhǎng)基因改組的全長(zhǎng)基因裝配反應(yīng)裝配反應(yīng), ,獲得突變文庫(kù)。獲得突變文庫(kù)

12、。特點(diǎn)：特點(diǎn)：是可用單鏈?zhǔn)强捎脝捂淒NADNA或或mRNAmRNA作模板、不作模板、不受模板長(zhǎng)度限制。受模板長(zhǎng)度限制。222.突變基因文庫(kù)的構(gòu)建突變基因文庫(kù)的構(gòu)建構(gòu)建基因文庫(kù)首先考慮的因素：構(gòu)建基因文庫(kù)首先考慮的因素：文庫(kù)的質(zhì)量文庫(kù)的質(zhì)量文庫(kù)的代表性文庫(kù)的代表性突變基因的結(jié)構(gòu)完整性突變基因的結(jié)構(gòu)完整性文庫(kù)容易篩選文庫(kù)容易篩選文庫(kù)的大小與特定的篩選容量相適應(yīng)文庫(kù)的大小與特定的篩選容量相適應(yīng)23突變體基因的載體系統(tǒng)突變體基因的載體系統(tǒng)噬菌體載體系統(tǒng)噬菌體載體系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：插入片段的裝載容量大，適合于大片優(yōu)點(diǎn)：插入片段的裝載容量大，適合于大片段的克隆段的克隆構(gòu)建出的基因文庫(kù)質(zhì)量高、代表性構(gòu)建出的基因文庫(kù)

13、質(zhì)量高、代表性好、適合好、適合長(zhǎng)期保存。長(zhǎng)期保存。缺點(diǎn)：可選用的篩選方法較有限缺點(diǎn)：可選用的篩選方法較有限24質(zhì)粒載體系統(tǒng)質(zhì)粒載體系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：體外操作簡(jiǎn)便，優(yōu)點(diǎn)：體外操作簡(jiǎn)便，最大優(yōu)點(diǎn)是能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因文庫(kù)的功能性篩選最大優(yōu)點(diǎn)是能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因文庫(kù)的功能性篩選缺點(diǎn)：是插入片段的載體容量較小，含有缺點(diǎn)：是插入片段的載體容量較小，含有長(zhǎng)片段的重組克隆的群體擴(kuò)增過(guò)程中容易長(zhǎng)片段的重組克隆的群體擴(kuò)增過(guò)程中容易丟失、轉(zhuǎn)化效率普遍較低，不易長(zhǎng)期保存。丟失、轉(zhuǎn)化效率普遍較低，不易長(zhǎng)期保存。25突變體基因文庫(kù)的篩選突變體基因文庫(kù)的篩選特點(diǎn)：篩選方法必須靈敏，可借助相關(guān)儀器特點(diǎn)：篩選方法必須靈敏，可借助相關(guān)儀器實(shí)現(xiàn)高通量

14、篩選，一般根據(jù)目的基因表達(dá)的實(shí)現(xiàn)高通量篩選，一般根據(jù)目的基因表達(dá)的靶蛋白選擇篩選的方法靶蛋白選擇篩選的方法活體篩選法活體篩選法;噬菌體展示法；噬菌體展示法；細(xì)胞表面展示法；細(xì)胞表面展示法；核糖體展示技術(shù)；核糖體展示技術(shù)；26幾種高通量篩選的方法：幾種高通量篩選的方法：1. .突變微生物分離法：突變微生物分離法： 瓊脂板涂布法在特殊條件下培養(yǎng)突變瓊脂板涂布法在特殊條件下培養(yǎng)突變菌菌，通過(guò)宿主菌的生長(zhǎng)情況、培養(yǎng)基顏色、通過(guò)宿主菌的生長(zhǎng)情況、培養(yǎng)基顏色、特定反應(yīng)的出現(xiàn)等判斷是否具有目的基因特定反應(yīng)的出現(xiàn)等判斷是否具有目的基因。2.微球細(xì)胞固定法與數(shù)字成像系統(tǒng)結(jié)合法：微球細(xì)胞固定法與數(shù)字成像系統(tǒng)結(jié)合法

15、： 將單個(gè)細(xì)胞附著在單個(gè)固體珠上，對(duì)將單個(gè)細(xì)胞附著在單個(gè)固體珠上，對(duì)突變體進(jìn)行分離和篩選。突變體進(jìn)行分離和篩選。273.3.噬菌體展示技術(shù)：噬菌體展示技術(shù)： 外源蛋白以融合形式與噬菌體的外殼外源蛋白以融合形式與噬菌體的外殼蛋白共同表達(dá)于噬菌體表面蛋白共同表達(dá)于噬菌體表面,經(jīng)過(guò)“吸附洗脫擴(kuò)增”過(guò)程過(guò)程，可篩選并富集外源肽，可篩選并富集外源肽，進(jìn)而研究其功能。進(jìn)而研究其功能。4.4.流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法：流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法： 細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過(guò)高速流動(dòng)系細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過(guò)高速流動(dòng)系統(tǒng)，排成單行，逐個(gè)通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀統(tǒng)，排成單行，逐個(gè)通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行測(cè)定進(jìn)行測(cè)定。28(1)噬菌體展示技術(shù)噬菌體

16、展示技術(shù)(Phage Display) 突變突變DNA片段插入噬菌片段插入噬菌體或噬菌粒的基因組中體或噬菌粒的基因組中，以以融合蛋白的形式與噬菌體的融合蛋白的形式與噬菌體的外殼蛋白共同表達(dá)于噬菌表外殼蛋白共同表達(dá)于噬菌表面，經(jīng)過(guò)面，經(jīng)過(guò)“吸附吸附洗脫洗脫擴(kuò)擴(kuò)增增”能夠特異吸附產(chǎn)物的層能夠特異吸附產(chǎn)物的層析柱析柱,帶有活性蛋白的噬菌體帶有活性蛋白的噬菌體被分離出來(lái)被分離出來(lái)。 29 有有細(xì)菌細(xì)菌和和噬菌體表面展示噬菌體表面展示技術(shù)，結(jié)合熒光激技術(shù)，結(jié)合熒光激活細(xì)胞篩選儀活細(xì)胞篩選儀(Fluorescence Activated Cell Sorting，F(xiàn)ACS)或流式細(xì)胞儀或流式細(xì)胞儀(flo

17、w cytometry)是是非常有效的高通量篩選方法非常有效的高通量篩選方法 。該技術(shù)是目前惟一。該技術(shù)是目前惟一能夠定量檢測(cè)單細(xì)胞水平和大量突變體酶催化活能夠定量檢測(cè)單細(xì)胞水平和大量突變體酶催化活性的方法。還能夠決定突變體庫(kù)中每個(gè)克隆的功性的方法。還能夠決定突變體庫(kù)中每個(gè)克隆的功能特性能特性 。 細(xì)菌細(xì)胞表面展示技術(shù)細(xì)菌細(xì)胞表面展示技術(shù)(Bacterial CellSurface Display) 30四、分子定向進(jìn)化技術(shù)的應(yīng)用四、分子定向進(jìn)化技術(shù)的應(yīng)用1.在環(huán)境污染治理方面的應(yīng)用在環(huán)境污染治理方面的應(yīng)用 相關(guān)基因通過(guò)多輪相關(guān)基因通過(guò)多輪DNA改組和篩選，分離改組和篩選，分離得到的突變體可提

18、高對(duì)甲基對(duì)硫磷、對(duì)三氯丙得到的突變體可提高對(duì)甲基對(duì)硫磷、對(duì)三氯丙烷、烷、 三氯乙烯、五氯苯酚的降解。三氯乙烯、五氯苯酚的降解。2.農(nóng)業(yè)飼料酶制劑的中的應(yīng)用農(nóng)業(yè)飼料酶制劑的中的應(yīng)用 如木聚糖酶如木聚糖酶(最適最適pH和耐高溫和耐高溫)；高比活低；高比活低pH淀粉酶；耐堿耐高溫高活性的纖維素酶；耐淀粉酶；耐堿耐高溫高活性的纖維素酶；耐高溫的二塘水解酶高溫的二塘水解酶.通過(guò)易錯(cuò)通過(guò)易錯(cuò)PCR和和DNA改組改組技術(shù)均可獲得相應(yīng)能較野生型功能強(qiáng)的酶制劑技術(shù)均可獲得相應(yīng)能較野生型功能強(qiáng)的酶制劑。313. .酶制劑藥物方面的應(yīng)用酶制劑藥物方面的應(yīng)用 主要是對(duì)酶制劑藥物進(jìn)行分子改造，主要提高主要是對(duì)酶制劑藥物

19、進(jìn)行分子改造，主要提高其活性和穩(wěn)定性其活性和穩(wěn)定性4.4.抗生素生產(chǎn)的相關(guān)限速酶活力方面提高抗生素生產(chǎn)的相關(guān)限速酶活力方面提高 如各種抗生素合成路徑中的關(guān)鍵酶活性的提高，如各種抗生素合成路徑中的關(guān)鍵酶活性的提高，從而增加相應(yīng)物質(zhì)產(chǎn)物的產(chǎn)量，這一過(guò)程可以單從而增加相應(yīng)物質(zhì)產(chǎn)物的產(chǎn)量，這一過(guò)程可以單獨(dú)使用易錯(cuò)獨(dú)使用易錯(cuò)pCR技術(shù)也可以結(jié)合技術(shù)也可以結(jié)合DNA重組技術(shù)進(jìn)重組技術(shù)進(jìn)行分子定向進(jìn)化。行分子定向進(jìn)化。32 頭孢菌素頭孢菌素C(CPC) 和和7- 氨基頭孢烷酸氨基頭孢烷酸(7-ACA)分別是工業(yè)半合成生產(chǎn)頭孢菌素類(lèi)分別是工業(yè)半合成生產(chǎn)頭孢菌素類(lèi)抗生素的重要前體和中間體，由于在頂頭抗生素的重要

20、前體和中間體，由于在頂頭孢霉中中直接生產(chǎn)孢霉中中直接生產(chǎn)7-ACA 也存在酶表達(dá)和也存在酶表達(dá)和菌株培養(yǎng)最適條件的矛盾，因此，采用易菌株培養(yǎng)最適條件的矛盾，因此，采用易錯(cuò)錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)技術(shù)對(duì)CPC ?；高M(jìn)行定點(diǎn)突變，?；高M(jìn)行定點(diǎn)突變，從而提高從而提高CPC的轉(zhuǎn)化效率。的轉(zhuǎn)化效率。33頭孢菌素頭孢菌素C(CPC) 戊二酰基戊二?；?7-氨基頭孢烷酸氨基頭孢烷酸 （GL-7-ACA)D-氨基酸氧化酶氨基酸氧化酶頭孢頭孢C氨基?；赴被；?- 氨基頭孢烷酸氨基頭孢烷酸(7-ACA)34易錯(cuò)易錯(cuò)PCR 對(duì)對(duì)CPC ?；高M(jìn)行無(wú)性突變?；高M(jìn)行無(wú)性突變突變重組子的初篩與復(fù)篩突變重組子的初篩與復(fù)篩將易錯(cuò)將易錯(cuò)PCR所得到的基因所得到的基因ecs與適宜的載體連接與適宜的載體連接易錯(cuò)突變子的結(jié)果分析易錯(cuò)突變子的結(jié)果分析35 用易錯(cuò)用易錯(cuò)PCR，用不同濃度的，用不同濃度的Mg2+ 和和Mn2+，應(yīng)，應(yīng)用低保真用低保真DNA聚合酶，以一定的頻率向氨基?；妇酆厦福砸欢ǖ念l率向氨基?；富蚧?ecs)中引入隨機(jī)突變。由于希望獲得錯(cuò)配的中引入隨機(jī)突變。由于希望獲得錯(cuò)配的ecs 基因序列，因此采用了基因序列，因此采用了Mg2+ 濃度濃度7.5 mmol/L、