醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)試驗(yàn)室工作導(dǎo)則

1、精品文檔附件醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)（一）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)計(jì)原則。 原則上 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)設(shè)置以下區(qū)域： 試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn) 備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。這 4 個(gè)區(qū)域 在物理空間上必須是完全相互獨(dú)立的，各區(qū)域無論是在空間 上還是在使用中，應(yīng)當(dāng)始終處于完全的分隔狀態(tài)，不能有空 氣的直接相通。 根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域可適當(dāng)合并 。例 如使用實(shí)時(shí)熒光 PCR儀，擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并； 采用樣本處理、核酸提取及擴(kuò)增檢測為一體的自動(dòng)化分析 儀，則標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。各區(qū) 的功能是：1. 試劑儲(chǔ)

2、存和準(zhǔn)備區(qū)：貯存試劑的制備、試劑的分裝和 擴(kuò)增反應(yīng)混合液的準(zhǔn)備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存 和準(zhǔn)備。2. 標(biāo)本制備區(qū)：核酸（RNA DNA提取、貯存及其加入 至擴(kuò)增反應(yīng)管。對于涉及臨床樣本的操作，應(yīng)符合生物安全 二級實(shí)驗(yàn)室防護(hù)設(shè)備、個(gè)人防護(hù)和操作規(guī)范的要求。3. 擴(kuò)增區(qū)：cDNA合成、DNA擴(kuò)增及檢測。4. 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：擴(kuò)增片段的進(jìn)一步分析測定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測序等。(二) 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的空氣流向。 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的空氣流向可按照試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)T標(biāo) 本制備區(qū)T擴(kuò)增區(qū)T擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)進(jìn)行，防止擴(kuò)增產(chǎn)物順 空氣氣流進(jìn)入擴(kuò)增前的區(qū)域?？砂凑諒脑噭﹥?chǔ)存

3、和準(zhǔn)備區(qū)T 標(biāo)本制備區(qū)T擴(kuò)增區(qū)T擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)方向空氣壓力遞減 的方式進(jìn)行?？赏ㄟ^安裝排風(fēng)扇、負(fù)壓排風(fēng)裝置或其他可行 的方式實(shí)現(xiàn)。(三) 工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標(biāo)準(zhǔn)。1. 試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)。(1) 28C和-20 C以下冰箱。( 2)混勻器。(3)微量加樣器(覆蓋 0.2-1000 pl )。( 4)可移動(dòng)紫外燈(近工作臺(tái)面)。( 5)消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加 樣器吸頭。( 6)專用工作服和工作鞋 ( 套)。( 7)專用辦公用品。2. 標(biāo)本制備區(qū)。(1) 2-8 C冰箱、-20 C或-80 C冰箱。( 2)高速離心機(jī)。(3) 混勻器。( 4)水浴箱或加熱模塊。(5)微量加樣器(

4、覆蓋 0.2-1000 pl )。( 6)可移動(dòng)紫外燈(近工作臺(tái)面)。( 7)生物安全柜。( 8)消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加 樣器吸頭(帶濾芯)。( 9)專用工作服和工作鞋 ( 套) 。( 10)專用辦公用品。(11)如需處理大分子 DNA應(yīng)當(dāng)具有超聲波水浴儀。3. 擴(kuò)增區(qū)。( 1 )核酸擴(kuò)增儀。( 2)微量加樣器(覆蓋 0.2-1000 pl )，(視情況定)( 3)可移動(dòng)紫外燈(近工作臺(tái)面)。( 4)消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加 樣器吸頭(帶濾芯)。( 5)專用工作服和工作鞋。( 6)專用辦公用品。4. 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。 視檢驗(yàn)方法不同而定，基本配置如下：(

5、1)微量加樣器(覆蓋 0.2-1000 pl )。( 2)可移動(dòng)紫外燈(近工作臺(tái)面)（ 3）消耗品：一次性手套、加樣器吸頭（帶濾芯）。（4）專用工作服和工作鞋。（5）專用辦公用品。 上述各區(qū)域儀器設(shè)備配備為基本配備，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)根據(jù) 自己使用的擴(kuò)增檢測技術(shù)或試劑的特點(diǎn)，對儀器設(shè)備進(jìn)行必 要的增減。二、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作基本原則（ 一 ） 進(jìn)入各工作區(qū)域應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)T標(biāo)本制備區(qū)T擴(kuò)增區(qū)T擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。（ 二） 各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，不同工作區(qū)域內(nèi)的 設(shè)備、物品不得混用。（ 三） 不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏 色）。工作人員離開各工作區(qū)

6、域時(shí)，不得將工作服帶出。（四）實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)當(dāng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)T標(biāo)本制 備區(qū)T擴(kuò)增區(qū)T擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū) 域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。（ 五） 工作結(jié)束后，必須立即對工作區(qū)進(jìn)行清潔。工作區(qū) 的實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面應(yīng)當(dāng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒 清潔作用。實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面的紫外照射應(yīng)當(dāng)方便有效。由于紫外 照射的距離和能量對去污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可 移動(dòng)紫外燈（254nm波長），在工作完成后調(diào)至實(shí)驗(yàn)臺(tái)上 6090cm內(nèi)照射。由于擴(kuò)增產(chǎn)物僅幾百或幾十堿基對（bp）,對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴(kuò)增片段必須延長照射時(shí) 間，最好是照射過夜。（ 六 ） 實(shí)驗(yàn)室的安全

7、工作制度或安全標(biāo)準(zhǔn)操作程序，所有 操作符合實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求（ GB19489-2008）。三、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室各區(qū)域工作注意事項(xiàng)（ 一 ） 試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)。貯存試劑和用于標(biāo)本制備的消 耗品等材料應(yīng)當(dāng)直接運(yùn)送至試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過擴(kuò) 增檢測區(qū)，試劑盒中的陽性對照品及質(zhì)控品不應(yīng)當(dāng)保存在該 區(qū)，應(yīng)當(dāng)保存在標(biāo)本處理區(qū)。（ 二 ） 標(biāo)本制備區(qū)。由于在樣本混合、核酸純化過程中可 能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，可通過在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條 件，避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的 交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng) 管。對具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，必須在生物安全柜內(nèi)

8、開 蓋，并有明確的樣本處理和滅活程序。（ 三 ） 擴(kuò)增區(qū)。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)當(dāng)盡量減少 在本區(qū)內(nèi)的走動(dòng)。必須注意的是，所有經(jīng)過檢測的反應(yīng)管不 得在此區(qū)域打開。（ 四） 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。核酸擴(kuò)增后產(chǎn)物的分析方法多種 多樣，如膜上或微孔板或芯片上探針雜交方法（放射性核素 標(biāo)記或非放射性核素標(biāo)記） 、直接或酶切后瓊脂糖凝膠電泳、 聚丙烯酰胺凝膠電泳、 Southern 轉(zhuǎn)移、核酸測序方法、質(zhì)譜 分析等。本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意 避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。在使用 PCR-ELISA 方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，必須使用洗板機(jī)洗板，廢 液必須收集至 1 mol/L HCl 中，并且不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傾倒