腫瘤病理診斷新技術(shù)免疫組化技術(shù)免疫組化技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于

1、腫瘤病理診斷新技術(shù)一、 免疫組化技術(shù)免疫組化技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于病理診斷，不僅在解決疑難病例診斷方面起著重要作用， 隨著人們醫(yī)療風(fēng)險意識的增強， 許多普通的病例也常常需要免疫組化進一步證實， 因此成為 病理科醫(yī)生常規(guī)工作中不可缺少的重要工作、常規(guī)手段。在小活檢病理檢查中免疫組化技術(shù)能明確地顯示癌細胞的存在（如胃粘膜活檢中的印戒 細胞癌） ，可使微小癌、微小轉(zhuǎn)移灶（淋巴結(jié)及骨髓） 、甚至不易察覺的病變得以確診。通過乳腺癌激素受體（ER、PR）的檢測，免疫組化技術(shù)在指導(dǎo)臨床治療方面已起到了 重要的作用。通過檢測針對腫瘤基因產(chǎn)物（ C-erbB2 、 P53、 ALK 、 CD117 等）的抗體還將

2、進一步為分子靶向治療提供重要的參考依據(jù)。細胞增殖核抗原（Ki-67 ）等免疫組化染色可為腫瘤的預(yù)后提供依據(jù)。免疫組化技術(shù)的局限性：至今無絕對特異的抗體！相當(dāng)多的腫瘤缺乏特異的抗原表達； 同一種抗原常?？稍诙喾N腫瘤中表達， 不少腫瘤又由于分化太差或細胞分子結(jié)構(gòu)改變而不表 達相關(guān)的抗原。 不同抗體滴度有不同的陽性結(jié)果； 內(nèi)源性生物素造成假陽性， 如肝細胞癌等； 缺乏免疫組化的標準化（同一實驗室及不同實驗室間結(jié)果的一致性）；定量結(jié)果的判斷等還存在不少的問題尚待解決，如 ER 受體，有的實驗室只要有陽性腫瘤細胞就視為陽性，而有 的實驗室則要至少 20細胞陽性才視為陽性，陽性標準往往是隨意確定的，未經(jīng)臨

3、床病理 研究證實。如何正確應(yīng)用免疫組化呢 ? 要得到正確、 有價值的免疫組化結(jié)果， 免疫組化實驗室規(guī)范、 合適的技術(shù)操作 （包括組織固定、 抗原修復(fù)、 檢測系統(tǒng)、 各類試劑的質(zhì)量保證、 染色技術(shù)等） 是最重要的基礎(chǔ)保證， 但病理科醫(yī)生在組織塊的選擇、 抗體的選擇、 結(jié)果的判斷等方面也起 著不容忽視的作用。二 分子病理學(xué) 這是繼電鏡、免疫組化之后的第三個浪潮。其優(yōu)點是反應(yīng)特異、敏感，檢測靶信號本 質(zhì)上不同，DNA 檢測溫度固定影響小。 采用的方法包括 PCR、濾膜雜交（斑點、印跡轉(zhuǎn)移），原位雜交、熒光原位雜交（FISH ）、顯微切割技術(shù)、比較基因組雜交、生物芯片（基因芯片、 蛋白質(zhì)芯片、組織芯片

4、）等。分子病理學(xué)檢測內(nèi)容包括腫瘤基因（癌基因、 抑癌基因 /原癌基因 ）、點突變、 染色體重排（易位、倒轉(zhuǎn) 過表達 /新的雜合基因） 、基因擴增和缺失等。分子病理學(xué)檢測為腫瘤定性、 分類、預(yù)后判斷可起到重要的幫助。顯微切割技術(shù)是 90 年代出現(xiàn)的一項新技術(shù)，這項技術(shù)對腫瘤、細胞生物學(xué)及分子生物 學(xué)研究有巨大的推動作用。 該技術(shù)能夠在顯微鏡下， 從組織切片上切下小片組織或單個細胞， 用這些切下的材料進行 PCR 擴增，能夠得到同類細胞，甚至單個細胞的基因，這樣研究結(jié) 果更為準確。組織芯片又稱組織微陣列（ tissue microarray ） , 是 1998 年在 cDNA 微陣列的基礎(chǔ)上發(fā)

5、明的一種特殊的生物芯片，是繼基因芯片和蛋白芯片之后生物芯片家族的又一新成員。組織芯片的原理是根據(jù)不同需要， 利用特殊的儀器， 將多個（病例） 小組織片高密度的、 整齊的排列固定在某一固相載體上（載玻片、硅片、聚丙烯或尼龍膜等），而制成微縮的組織切片。 其最大潛在作用是將基因、 蛋白水平的研究與組織形態(tài)學(xué)相結(jié)合，使應(yīng)用同一實驗指標，同時快速研究大量不同組織樣本（高通量、多樣本）的設(shè)想成為現(xiàn)實，減少了實驗誤 差，幾十倍、上百倍的提高組織病理學(xué)研究的效率，節(jié)約實驗材料和試劑，同時使實驗結(jié)果有更可靠的可比性；對于原始病理資料的保存和大量樣本的回顧性研究具重要的意義。組織芯片的應(yīng)用范圍：研究目的基因在不

6、同病變(腫瘤)間的表達差異；尋找疾病新基因，疾病(腫瘤)中新基因、突變體與基因多態(tài)性的檢測，藥物的篩選；疾病的病理診斷； 質(zhì)量控制等。原位雜交-是在一定的生物結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之上的核酸雜交，這種結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)可以是一條染色體、 一個細菌、更大的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是細胞和組織。故此雜交的共同點是有明確的結(jié)構(gòu) 基礎(chǔ)，可反映基因雜交的準確部位。免疫組化技術(shù)在腫瘤病理診斷中的應(yīng)用一、免疫組織化學(xué)的工作原理1、已知的特異性抗體或抗原能特異性結(jié)合通過化學(xué)反應(yīng)使標記于結(jié)合后的特異性抗體上的顯示劑，如酶，金屬離子、同位素等，顯示一定的信號(如：顏色)借助顯微鏡、熒光顯微鏡或電子顯微鏡觀察其顏色變化，從而在抗原抗體結(jié)合部位確定組織、細

7、胞結(jié)構(gòu)二、應(yīng)用范圍：(1) 提高病理診斷準確性(2) 對疾病的預(yù)后和治療的意義(3) 對腫瘤增生程度的評價(4) 微小病灶的發(fā)現(xiàn)微小癌，微小病灶(如羊水栓塞)(5) 指導(dǎo)腫瘤的治療(6) 惡性淋巴瘤及白血病的診斷及分型(7) 病原微生物的檢測1上皮性腫瘤標記物(1) 共同的標記物角蛋白 *(cytokeratin/keratin, CK/KER)*共有 20 種亞型，高分子量角蛋白見于復(fù)層鱗狀上皮，低分子量角蛋白見于腺上皮。橋粒蛋白 *(desmoplankin)*分布于上皮細胞間的連接部位，是一種很好的上皮細胞標記，此外，凡有細胞連接的非上皮細胞也可以表達，如腦膜瘤、尤文肉瘤、顆粒細胞瘤、精

8、原細胞瘤。(2) 存在于大部分上皮細胞內(nèi)的標記物上皮膜抗原(epithelial membra nous an tige n, EMA)*大多數(shù)上皮性腫瘤，常與角蛋白聯(lián)合應(yīng)用*腺上皮性腫瘤，漿細胞瘤，大細胞淋巴瘤，漿細胞骨髓瘤，腦膜瘤均有表達。(3)選擇性存在于某些上皮細胞內(nèi)的標記物癌胚抗原(carci no embryo nic an tige n, CEA)*是內(nèi)胚層來源的上皮性腫瘤分化標記物，見于腺癌及某些鱗癌，鑒別腺癌(+)與間皮瘤(-)。但血細胞來源的腫瘤(綠色瘤、髓細胞白血病)、惡性纖維組織細胞瘤均呈陽性反應(yīng)。甲胎蛋白(a-fetoprotein,AFP)肝細胞癌，生殖細胞性腫瘤，

9、如內(nèi)胚竇瘤，睪丸胚胎癌有交叉反應(yīng)。前列腺特異性抗原(prostatic specific antigen, PSA)前列腺上皮及其來源的腫瘤，也可從轉(zhuǎn)移性腫瘤中鑒別出前列腺癌結(jié)腸癌相關(guān)抗原(CA19-9)胃腸道腫瘤，胰腺癌卵巢癌抗原(CA125)卵巢、子宮、乳腺癌2(1) 間葉細胞及腫瘤共同標記物波形蛋白*(vimentin, VIM)間葉組織、良、惡性腫瘤*缺乏特異性，配合其他更有鑒別力的標記物仍有價值。(2) 肌細胞，肌上皮及腫瘤標記物結(jié)蛋白(desmin , DM)肌細胞及其腫瘤(橫紋肌肉瘤/平滑肌肉瘤)肌紅蛋白(myoglobin , MG)橫紋肌，心肌細胞及其腫瘤肌球蛋白(myosi

10、n)橫紋肌特異性標記物，但不敏感肌肉特異性肌動蛋白(ms-acti n, MSA,CMA,HHF35)平滑肌，橫紋肌、肌上皮，肌纖維母 細胞平滑肌肌動蛋白(SM-actin/SMA)對平滑肌較特異(3) 內(nèi)皮細胞及腫瘤標記物第忸因子相關(guān)抗原(factor 忸-related antigen, F 忸 RAg)血管內(nèi)皮細胞及其腫瘤CD31 血管肉瘤 上皮樣血管內(nèi)皮瘤特異性較強CD34 內(nèi)皮細胞，血管良惡性腫瘤， kapposi 肉瘤*胃腸道間質(zhì)腫瘤 70%病例為 CD34 陽性*100%病例 CD117 陽性(4) 組織細胞標記物CD68(Kp-1)全組織細胞標記物，如惡性纖維組織細胞瘤無明確特

11、異性a-抗糜蛋白酶(a-antichymotrypsin AACT)具有組織細胞分化的腫瘤，如惡纖組a-抗胰蛋白酶(a-antitrypsin,AAT)*組織細胞及其腫瘤*肝細胞癌，具有肝細胞癌分化的生殖細胞腫瘤，如內(nèi)胚竇瘤，亦標記膠質(zhì)細胞瘤溶菌酶(lysazyme , lys)組織細胞及其腫瘤，其特異性不如 AAT3.淋巴造血組織標記物(1) 共同標記物白細胞共同抗原(leukocyte common antigen, LCA)CD45全白細胞標記，血白細胞，單核細胞，肥大細胞，各種淋巴瘤；漿細胞及R-S 細胞，不表達 LCA(2) T 淋巴細胞標記物CD45RO(UCHL-1、CD3 CD

12、43 (L60/Leu-27) T 細胞淋巴瘤(3) B 淋巴細胞標記物CD20(L26)、CDW75(LN1) CD19 B 細胞淋巴瘤(4) 霍奇金 R-S 細胞標記物CD15+(Leu-M1)、CD30*(BerH2)+霍奇金淋巴瘤(非淋巴細胞為主型)CD20+ CDW75、CD30-/+、CD15- EMA+霍奇金淋巴瘤(淋巴細胞為主型)*CD30 粒細胞、單核細胞、上皮細胞、R-S 細胞均有表達，某些未分化大細胞淋巴瘤(+)(5) 組織細胞原性淋巴瘤標記物CD68 MAC387 AAT AACT +*CD 意為分化群(cluster of differentiation, CD)，是

13、白細胞相關(guān)抗原的國際分類系統(tǒng)，現(xiàn)已規(guī)定了 147 種白細胞抗原，由此也有相應(yīng)抗體的命名。4.神經(jīng)源性腫瘤標記物(1) 膠質(zhì)細胞標記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillory acidic protein, GFAP)星形細胞瘤，各種膠質(zhì)瘤，室管膜瘤，可與腦膜瘤鑒別(2) 少突細胞與雪旺細胞標記物髓鞘堿性蛋白(MBP)神經(jīng)鞘瘤S-100 蛋白*神經(jīng)鞘瘤，少突膠質(zhì)細胞瘤，星形細胞瘤，副節(jié)瘤*S-100 還對黑痣、黑色素瘤、軟骨性腫瘤、脂肪腫瘤呈陽性反應(yīng)(3) 神經(jīng)細胞及神經(jīng)內(nèi)分泌細胞標記神經(jīng)微絲(neurofilament, NF)神經(jīng)細胞及其腫瘤，如神經(jīng)母細胞瘤、嗜鉻細胞瘤神經(jīng)特異性烯

14、醇化酶 (neuron specific enolase, NSE)*嗜鉻粒(chromograninA,ChrA)突觸素(synaptophysin,syn)NSE 是神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤首選的標記物，而NSE chr、syn 三者均是 APUDom 標記物，見于嗜鉻細胞瘤，副節(jié)瘤、PNET/尤文肉瘤、類癌、Merkel 細胞瘤、甲狀腺髓樣癌、肺小細胞癌等。NSE 還與某些乳腺癌、大細胞淋巴瘤呈陽性反應(yīng)。(4) 黑色素細胞標記物人類黑色素瘤抗體 HMB45 S-100 蛋白黑色素瘤和透明細胞肉瘤呈陽性反應(yīng)，HMB45 特異性強，但不及 S-100 敏感。5 內(nèi)分泌刖癇標記物垂體激素垂體細胞及其腫瘤

15、，分泌性APUD 腫瘤(“異位”激素)促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、生長激素(GH)、泌乳素(LH)、促甲狀腺激素(TSH)甲狀腺球蛋白(TGB)甲狀腺上皮腫瘤降鈣素(CT)甲狀腺髓樣癌及 C 細胞增生胰島細胞相關(guān)激素及胃腸道激素胰島細胞瘤、胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤胰島素(insulin) 、胃泌素(gastrin)、生長抑素(somatostatin) 、高血糖素(glucogen) 胰多肽(pancreatic peptide)、蛙皮素(bombsin)、小腸 血管活 性多肽(vasoactive in test inal polypeptide, VIP)、P 物質(zhì)血清素(seratonin

16、) APUD 腫瘤睪丸酮睪丸及卵巢性索間質(zhì)腫瘤人類絨毛膜促性腺激素(hCG)、人類胎盤泌乳素(hPL):滋養(yǎng)細胞腫瘤及具有滋養(yǎng)葉成 分的生殖細胞源性腫瘤6 細胞外基質(zhì)標記物膠原蛋白 （collagen）I型膠原骨肉瘤n型膠原軟骨肉瘤川型膠原纖維肉瘤w型膠原 基底膜特異性抗原，血管源性腫瘤v型膠原廣泛存在于全身層粘蛋白 （laminin, LN） 為基底膜連接蛋白，用于腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移機制研究 纖維連接蛋白（fibronectin FN） 作為間質(zhì)腫瘤標記物，也用于腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移研究七、癌基因標記物主要癌基因，其活化方式和相關(guān)人類腫瘤四、舉例說明（一） 、肉瘤： Vimentin+ Cytokera

17、tin- LCA- 1、惡黑： HMB45+ ， S-100+ ， Melon-A+ ，2、肌源性肉瘤： HHF35 （ Actin ）+ ，Desmin+3 、平滑肌肉瘤： Actin（sm）+4、橫紋肌肉瘤： Myoglobin+ ，Myosin+ ， MyD1+5、惡纖組： CD68+ ， Lysozyme+6 、滑膜肉瘤： Cytokeratin+7、惡性間皮瘤： Calretinin+ ， Mesotheliol cell+8、原始神經(jīng)外胚瘤： CD99+ ， Neuroblestoma+9 、惡性神經(jīng)鞘瘤，脂肪肉瘤： S-100+ 10、血管肉瘤： F8+ ， CD34+ ， CD

18、31+（二） 、淋巴瘤： LCA+ ， Vinentin ， Cytokeratin-1、CD20 （ B 細胞）、CD3 （ T 細胞）、LCA 為一線抗體；2 、有大的異型腫瘤細胞時有大異型淋巴細胞時加 CD30+ （何杰金細胞或間變大細胞淋巴瘤）、ALK+ （間變大細胞淋巴瘤）;有大異型上皮樣細胞巢時，加 CK+ （癌）、 HMB45+ （惡黑）；伯基特淋巴瘤， Ki67 100% 陽性。3 、有漿樣分化漿細胞肉瘤（CD20- , CD3-陰性）：用K、入鏈只有其中一種陽性；CD20 陽性，有漿樣分化，診斷為漿樣分化 B 細胞淋巴瘤。4、主要是中小異型淋巴細胞套區(qū)淋巴瘤： CD5+ ， Cyclin D1+ ，CD10- ； 濾泡性淋巴瘤與反應(yīng)性濾泡鑒別： Bcl-2+ 為濾泡性淋巴瘤（ CD10+