蛋白質(zhì)純化實驗室

1、蛋白質(zhì)純化實驗室實驗手冊祁超2007 年 10 月第一章 外源基因在大腸桿菌中的表達一、通過聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）將靶基因亞克隆到質(zhì)粒載體上（一） PCR 引物設(shè)計的基本原則與PCR 反應(yīng)組分和條件1. PCR 引物設(shè)計的基本原則（ 1）引物與靶基因間配對的堿基一般為15-20。（ 2）引物堿基盡可能隨機分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象，引物G + C含量宜在45-55%左右。（ 3）引物內(nèi)部不應(yīng)形成二級結(jié)構(gòu)，兩個引物之間尤其在3末端不應(yīng)有互補鏈存在。（ 4）引物的堿基順序不應(yīng)與非擴增區(qū)域有同源性?？捎糜嬎銠C進行輔助檢索分析。（ 5）引物3 末端一般以單個C 或 G 結(jié)尾。2. PCR 反應(yīng)

2、組分和條件PCR反應(yīng)體系一般選用50屋體積，其中含有：10 x Reaction buffer, 5 仙 l2 個引物，各 12.5-25 pmol （終濃度各 0.25-0.50 仙 mol/L）4 種底物（dATP + dCTP + dGTP + dTTB ,各 200 仙 mol/L模板DNA, 100 ng左右Taq DNA 聚合酶，2.5-3 UPCR 反應(yīng)條件一般為：（ 1） 94，5 分鐘（ 2） 94變性30-60 秒（ 3） 50-55退火30-60 秒（ 4） 70-72延伸30-60 秒（ 5） 72 5-10 分鐘共進行 25-35 次循環(huán)。循環(huán)是步驟(2)和(4)(二

3、 ) 質(zhì)粒 DNA 的小量制備1、傳統(tǒng)方法( 1)用滅菌牙簽挑單菌落于3 ml LB 培養(yǎng)液中，37培養(yǎng)過夜。(2)在每個EP管中倒入1 ml左右的過夜培養(yǎng)物，6,000 rpm離心1分鐘以收 集菌體。(3)將菌體重懸于100仙4c預(yù)冷的溶液I中，并加入200小斷配制白溶液II,蓋緊管口，快速顛倒離心管6-7 次，然后，冰浴5 分鐘。(4)加150叱4c預(yù)冷白溶液III,倒置5-6次以混合內(nèi)容物，然后，冰浴 5分 鐘。(5) 12,000 rpm離心10分鐘后，小心吸取上清至另一 EP管中。( 6)加2 倍體積的無水乙醇，振蕩混合，并在室溫放置5 分鐘。(7) 12,000 rpm離心5分鐘后

4、，移去上清，并用70%乙醇漂洗DNA沉淀。DNA 沉淀自然干燥，并溶于20膜雙蒸水或1XTE緩沖液(10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 中。2. Promega 公司 Wizard Plus 小量 DNA 純化方法-離心方案(適用于產(chǎn)品A1330， A1340， A1460 及 A1470)(1) 12,000 rpm離心1分鐘，以沉淀1-10 ml過夜培養(yǎng)物。(2)用 250；! l Cell Resuspension Solution充分懸浮大腸桿菌細胞。(3)力口 250 仙 l Cell Lysis Solution ,倒置 5-6 次混合。(

5、4)力口 10 川 Alkaline Protease Solution ,倒置 5-6 次混合，室溫放置 5 分鐘。(5)力口 3501 Neutralization Solution ,倒置 5-6 次混合。( 6)室溫，最高轉(zhuǎn)速離心10 分鐘，回收上清。( 7)將離心柱插入收集管中。( 8)將上清倒入離心柱中。( 9)室溫，最高轉(zhuǎn)速離心1 分鐘，倒掉流穿液，將離心柱重新插入收集管中。(10)力口 750；! l Wash Solution(加乙醇)，最高轉(zhuǎn)速離心1分鐘，倒掉流穿液，將離心柱重新插入收集管中。(11)重復(fù)步驟(10)(用 250 仙 l Wash Solution )。(

6、12)室溫，最高轉(zhuǎn)速離心2 分鐘。( 13)將離心柱插入一個無菌的1.5 ml 微量離心管中。(14)在離心柱中加 50-100 n l Nuclease-Free Water ,室溫，最高轉(zhuǎn)速離心 1 分鐘。(15) DNA容液保存在-20 C備用。(三 ) 質(zhì)粒 DNA 的中量制備1. 在100 ml含100仙g/ml氨葦青霉素的LB培養(yǎng)液中加入1 ml pET-15b/Novablue甘油菌，37 c培養(yǎng)過夜；2. 4C , 4,000 rpm離心10分鐘以收集菌體；在菌體用3 ml溶液I (50 mmol/L葡 萄糖， 25 mmol/L Tris, pH 8.0, 10 mmol/L

7、 EDTA, pH 8.0) 充分懸浮后，加入6 ml 溶液II (0.2 mol/L NaOH, 1% SDS),并倒置混合，冰浴 5-10分鐘；3. 加入 4.5 ml 溶液 III ( 60ml 5 mol/L 乙酸鉀，11.5 ml 冰乙酸和28.5ml 水) ，輕搖混合，冰浴10 分鐘；4. 4，12,000 rpm 離心 20分鐘，小心吸取上清至另一個50 ml 離心管中；加入 0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10分鐘；5. 室溫，10,000 rpm離心10分鐘以沉淀 DNA ;6. 在沉淀用70%乙醇漂洗，自然干燥，并溶于0.3 ml 的 TE (10 mmol/L Tri

8、s, 1mmol/L EDTA, pH 8.0)緩沖液中，然后轉(zhuǎn)入 EP管中；7. 加入等體積的5 mol/L LiCl, 室溫， 10,000 rpm 離心 10 分鐘以沉淀大分子RNA 分子；8. 回收上清，加入等體積的異丙醇，室溫放置10 分鐘， 12,000 rpm 離心 5分鐘以沉淀DNA；9. DNA 沉淀用70%乙醇漂洗，然后，自然干燥；10. DNA沉淀溶于200仙含50-100叱g/ml胰RNA酶的TE緩沖液中，在37c 保溫 30 分鐘；11. 加入等體積的13% PEG8000/1.6 mol/L NaCl, 室溫放置5分鐘； 12,000 rpm離心 10 分鐘以沉淀D

9、NA；12. 小心移去上清，DNA沉淀溶于200屋TE （pH 8.0）緩沖液中，并用酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）抽提一次；小心將上層溶液轉(zhuǎn)移到一個干凈的EP管中，并加入0.1 體積的 3mol/L NaAc （pH 5.2）和 2 倍無水乙醇，混勻，-40放置30 分鐘；13. 12,000 rpm 離心 5 分鐘以沉淀DNA； DNA 沉淀用70%的乙醇漂洗，自然干燥，并溶于100小TE緩沖液中。最后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳對DNA進行定 量和純度鑒定。（四） DNA（ PCR 產(chǎn)物或質(zhì)粒）的酶切1. 一般在15-20以體積中酶切0.2-1仙的DNA,可根據(jù)實際情況，按比例放大酶切反

10、應(yīng)的體積和DNA 的量。2. 一般用7-8 u的限制性內(nèi)切酶酶切 1 Ng的DNA,酶:DNA的比率應(yīng)小于 25u/以防止 star activity。3. 限制性內(nèi)切酶一般保存在50%的甘油中，而大于5%的甘油可能會引起staractivity 或抑制酶切反應(yīng)。因此，在酶切反應(yīng)體系中，甘油的濃度一般應(yīng)小于5%，也就是說，限制性內(nèi)切酶的體積應(yīng)小于酶切反應(yīng)總體積的1/10。4. 對于雙酶切反應(yīng)，可考慮在同一種緩沖液中進行，一般要求任一一種限制性內(nèi)切酶的活性不低于其最大活性的50%。5. 酶切反應(yīng)的時間一般為2-3 小時。如果酶切不完全，可適當延長酶切反應(yīng)的時間。（ 五）從瓊脂糖凝膠或PCR 反應(yīng)

11、物中回收DNA （用 Promega 公司的Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System 適用于產(chǎn)品A9280、A9281 及 A9282）1 .從瓊脂糖凝膠中切下含DNA的膠條，并放入一潔凈的EP管中。按每10 mg 膠條加10 n l的Membrane Binding Solution,漩渦震蕩，并在50-60C保溫直到膠條完全溶解；對于PCR 反應(yīng)物，可直接加等體積的Membrane Binding Solution 混合。2 . 將 SV 微柱插入收集管中，并將上述溶液加入SV 微柱，室溫放置1 分鐘。3 . 10,000 g離心1分鐘，丟棄流穿液，重新將

12、微柱插入收集管中。4 .加700履Membrane Wash Soluton, 10,000 g離心1分鐘，丟棄流穿液，重新將微柱插入收集管中。5 .用 500 履 Membrane Wash Solution 重復(fù)步驟 4, 10,000 g離心 5分鐘。6 . 小心將微柱插入一潔凈的EP 管中。7 .在微柱中加50川Nuclease-FreeWater,室溫放置1分鐘，10,000 g離心1 分鐘。8 . 丟棄微柱，將DNA 儲存在4或-20。（六） PCR 產(chǎn)物或 DNA 酶切片斷與質(zhì)粒載體的連接1. 常規(guī)方法一般在10仙反應(yīng)體系中，加酶切并回收的質(zhì)粒載體50-100仙g左右及1仙的T4

13、 DNA連接酶（3-5 u/葭1按PCR產(chǎn)物或DNA酶切片斷摩爾數(shù)與載體摩爾數(shù)比約為 3:1 的比例進行連接。連接反應(yīng)在13-16保溫過夜。2. 快速連接方法可以通過連接Kit進行。例如，對于Takara公司的連接Kit,可在載體與插入 片段的混合液（5膜）中加入5 1 Kit溶液，16 C保溫2小時即可。（七）大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備1. 單菌落接種于3 ml LB 培養(yǎng)液中，37過夜培養(yǎng)。2. 取 2 ml 過夜培養(yǎng)物接種于200 ml LB 培養(yǎng)液中，并且， 當 37培養(yǎng)至OD600為 0.4左右時，轉(zhuǎn)移至250 ml 離心管中，立即冰浴30分鐘。3. 在 4，3,600 rpm 離心

14、10分鐘，棄上清，加4預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl 2溶液 10 ml, 輕搖以充分懸浮細胞。4. 轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，在4C, 3,500 rpm離心7分鐘，小心棄上清。5. 加 5 ml 預(yù)冷的 0.1 mol/L CaCl2 ， 輕搖離心管以充分懸浮細胞；冰浴 2小時后，加4預(yù)冷的80%甘油至終濃度為15%，混勻分裝，并保存于-70。（八）用質(zhì)粒或連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞1. 常規(guī)方法一般用2-3仙連接反應(yīng)物與200膜大腸桿菌菌株感受態(tài)細胞混合，冰浴 30分鐘；42熱激90秒，冰浴2 分鐘；加0.5-0.8 ml 的 LB 培養(yǎng)液，37，150-200 rpm振蕩培養(yǎng)6

15、0 分鐘；低速離心以沉淀細胞，并移去大部分上清；用移液器吹吸混勻細胞，在9 cm直徑的平板涂布100-200膜細胞懸液，并在37c保溫過夜。2. 快速轉(zhuǎn)化方法用2-3仙連接反應(yīng)物與200膜大腸桿菌菌株感受態(tài)細胞混合，冰浴 10分鐘， 42熱激90 秒，冰浴2 分鐘，然后涂布在含有適宜抗生素的平板上。（九）轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定1. 通過 Promega 公司 pGEM-T Vector System 的藍/白斑篩選（1）在含有適當抗生素90 mm LB瓊脂平板中央滴加40履2% X-gal （用二甲 基甲酰胺配制）和7屋20% IPTG.。如用150 mm平板，則加100屋2% X-gal和20

16、膜 20% IPTG。（ 2）用涂布棒使溶液均勻地分散在整個平板的表面。然后，在37保溫1 小時，使全部液體消失。（ 3）將pGEM-T Vector-插入片斷連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞涂布在上述平板的表面，37保溫過夜。其中，白色菌落表明：細胞中的質(zhì)粒含有插入片斷；藍色菌落表明：細胞中的質(zhì)粒不含有插入片斷。2. 轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA 的酶切鑒定用滅菌牙簽挑單菌落于3 ml 含有適宜抗生素的LB 培養(yǎng)液中，37振蕩過夜培養(yǎng)。吸取1 ml 過夜培養(yǎng)物進行質(zhì)粒DNA 的小量抽提，用限制性內(nèi)切酶酶切檢驗質(zhì)粒 DNA 中是否有插入片斷。3. 以菌落為模板的PCR 鑒定用滅菌吸頭挑取少許單菌落細胞，點在P

17、CR 管的底部。然后，加入其他PCR組分， 進行正常的PCR 反應(yīng)（其中， PCR 循環(huán)前的反應(yīng)參數(shù)為：95保溫10分鐘） ，DNA 中是否有插入片斷。二、 Stratagene 公司的 QuikChange TM 定點突變方法為了保證高的突變效率，DNA 模板的用量要小，DNA 聚合酶的保真度要高，PCR 的循環(huán)數(shù)要少。（1） 突變引物的設(shè)計1 .對于每一個突變，需合成兩條互補的引物，并且引物應(yīng)通過 PAGE純化。2 .引物的長度為25-45個堿基，其Tm值應(yīng)大于或等于78CoTm = 81.5 + 0.41 （%GC） - 675/N - % mismatch, N 為引物的長度。3 .

18、突變堿基應(yīng)當位于引物的中間。4 . 引物的 GC 含量應(yīng)大于或等于40%，并且應(yīng)當以一個或多個C 或 G 結(jié)尾。（2） PCR 相關(guān)參數(shù)1 .小抽或中抽的質(zhì)粒DNA均可用作DNA模板。對于50履反應(yīng)體系，DNA 模板的用量為10-100 ng,最適用量應(yīng)通過實驗來確定。2 .引物應(yīng)過量，一般可配成100 ng/仙l,用量為3-5屋。3 . PCR 反應(yīng)條件為：95 C, 1 分鐘；50-55 C ,1-2 分鐘；68 C , 2 minutes/kb of plasmid length。4 . 對于單個堿基的改變，退火溫度為55，循環(huán)數(shù)為12 次；對于兩個或三個堿基的改變，或者單個氨基酸的缺失

19、或插入，退火溫度為50 或 55，循環(huán)數(shù)為16次；對于多個氨基酸的缺失或插入，退火溫度為50或 55，循環(huán)數(shù)為18 次。（3） 三） DNA 模板的去除PCR反應(yīng)后，取10履反應(yīng)物走1%瓊脂糖凝膠電泳，以檢測目標產(chǎn)物的量和 純度。如果目標產(chǎn)物的量和純度符合要求，則在剩余反應(yīng)物中加1仙限制性內(nèi)切酶DpnI （10-20 u/屋）,37保溫2-3小時以酶解模板 DNA。（四）轉(zhuǎn)化取3屋Dpn酶切反應(yīng)物轉(zhuǎn)化200仙大腸桿菌感受態(tài)細胞。(五) 突變基因的鑒定突變基因通過DNA 測序鑒定。三、檢測外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達如果靶基因亞克隆在含有T7 啟動子的表達載體(如質(zhì)粒載體pET-22b 和pET

20、-15b等)上，那么重組質(zhì)粒應(yīng)轉(zhuǎn)化入 入DE3溶源菌菌株 如BL21(DE3)、 JM109(DE3)及Qrigami B(DE3)等中，以進行靶基因的表達。(1) 溶菌酶-DNase I-反復(fù)凍融裂解菌體法1 . 單菌落接入4ml LB 培養(yǎng)液中，過夜培養(yǎng)。再以 1:20轉(zhuǎn)接至 2管 4 ml LB 培養(yǎng)液中，當OD600為0.6-0.8時，一管加IPTG誘導(dǎo)，另一管不加IPTG作對照。2 .離心收集菌體，每管加 Binding buffer 100 膜，DNase I (2,000 u/ml) 10 屋， 溶菌酶(2 mg/ml) 5屋。菌體充分懸浮后，在-20C放置20分鐘，室溫融化，如

21、此 反復(fù)凍融8-10 次。3 .吸取20履 加入一潔凈的EP管中，12,000 rpm離心10分鐘，上清和沉淀分別進行SDS-PAGE 電泳，以判斷靶蛋白質(zhì)主要以溶解形式還是以包涵體形式存在。(2) 超聲波裂解菌體法1. 單菌落接入4 ml LB 培養(yǎng)液中，過夜培養(yǎng)。其中2 ml 過夜培養(yǎng)物用于菌種保存和DNA測序，另外2 ml過夜培養(yǎng)物接入100 ml LB培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)。當OD600 為 0.6-0.8時，加 IPTG 誘導(dǎo)表達3-4小時。2. 4 C , 5,000 rpm離心10分鐘收集菌體，用5 ml Binding buffer充分懸浮細胞， 超聲波破碎細胞(功率：120 W左右

22、，間歇時間：10秒，工作時間：3秒，破碎次 數(shù)： 40-50 次) 。3. 吸取20履 加入一潔凈的EP管中，12,000 rpm離心10分鐘，上清和沉淀分別進行SDS-PAGE 電泳，以判斷靶蛋白質(zhì)主要以溶解形式還是以包涵體形式存在。(3) SDS-煮沸裂解菌體法1 .單菌落接入4ml LB培養(yǎng)液中，37c培養(yǎng)。當OD600為0.6-0.8時（約需3-4小時） ，吸取 2 ml 加入另一空的培養(yǎng)管中。其中，一管加IPTG 誘導(dǎo)，另一管不加IPTG 作為對照。2 .吸取1 ml培養(yǎng)物加入潔凈的EP管中，10,000 rpm離心1分鐘收集菌體。在 菌體管中加20仙l水和20膜2X loading

23、 buffer,沸水浴中維持3-5分鐘。3 .用SDS-PAGE電泳分析上述樣品，以判斷靶蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達量。四、用大腸桿菌生產(chǎn)13C- 15N 標記的蛋白質(zhì)1. 用于生產(chǎn)13C-15N 標記蛋白質(zhì)的組合培養(yǎng)基（每升）K2HPO4 3H2。： 10.375克KH 2PO4： 4.375克15NH4Cl： 0.5克MgSO4 7H2O: 50 毫克NH4FeSC4 - 6H2O: 7 毫克鹽酸硫胺：10 毫克（母液濃度為10 毫克/毫升）13C-葡萄糖：2.5克氨芐青霉素：100毫克（母液濃度為100毫克/毫升）除15NH4Cl、13C-葡萄糖及氨葦青霉素外，其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；

24、2.5克葡萄糖溶于25 毫升蒸餾水中，并單獨滅菌；對鹽酸硫胺和氨芐青霉素采用過濾除菌；葡萄糖、鹽酸硫胺及氨芐青霉素在培養(yǎng)前加入。2. 在大腸桿菌細胞中合成13C-15N 標記的蛋白質(zhì)將來自 LB 平板上的單菌落（含有重組質(zhì)粒）接入 2-3 毫升組合培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)12 小時（例如，從9:00-21:00） ，然后接入100毫升組合培養(yǎng)基中；過夜培養(yǎng)后，分別接入三個330毫升（在1 升三角瓶中）組合培養(yǎng)基中；當37培養(yǎng)至CD600=0.6-0.7時，力口 IPTG至終濃度為1 mmol/L ,并繼續(xù)培養(yǎng)4小時，以誘導(dǎo)13C-15N 標記蛋白質(zhì)的合成。第二章 蛋白質(zhì)的純化和鑒定1、 用Ni

25、2+親和層析柱純化可溶性蛋白質(zhì)1. 30 ml的過夜培養(yǎng)物加入300 ml (在1升三角瓶中) 含有100叱g/m氯葦青霉素的LB 培養(yǎng)液中，在37 振蕩培養(yǎng)。2. 當OD600達至ij 0.6-1.0時，力口 IPTG至終濃度為1 mmol/L進行誘導(dǎo)表達，培養(yǎng)物繼續(xù)保溫4 小時以進行目標蛋白質(zhì)的累積。3. 4 C , 5,000 rpm離心10分鐘收集菌體。對于500 ml菌液中的菌體，用20-30ml 的 start buffer 充分懸浮。4. 在冰浴條件下，用超聲波破碎細胞(條件為：工作時間3 秒，間歇時間10秒，總次數(shù)120-200) 。5. 4 C, 12,000 rpm離心20

26、分鐘以去除細胞碎片，上清與 Ni2+親和層析柱混 合。6. 上樣后， 分別用 start buffer (20 mmol/L Tris, pH 7.8, 0.5 mol/L NaCl) 和 wash buffer ( 20 mmol/L Tris, pH 7.8, 0.5 mol/L NaCl, 50-100 mmol/L 咪唑)洗脫雜蛋白 質(zhì)，用 elution buffer( 20 mmol/L Tris, pH 7.8, 0.5 mol/L NaCl, 0.5 mol/L 咪唑)洗脫 目標蛋白質(zhì)。2、 通過Ni2+親和層析柱純化包涵體蛋白質(zhì)1) 5,000 rpm離心15 min。棄培養(yǎng)

27、基，按每500 ml菌體加入20 ml緩沖液A。2) 震蕩混勻，加入 200 l 100 mmol/L PMSF。 超聲破碎200次 (功率為200 W，工作時間為3 s,間隙時間為10 s) 0 12,000 rpm離心20 min。3) 棄上清，沉淀再加入5 ml緩沖液A洗滌1次。12000rpm離心20min。加入 6ml鹽酸月瓜溶液，4c靜置過夜。12000rpm離心20min。按以下步驟處理：(1)用緩沖液B平衡Ni agarose柱。(2)將鹽酸月瓜處理的蛋白質(zhì)溶液上 Ni agarose柱。4) 用約10 倍床體積的含25 mmol/L 咪唑的緩沖液C 洗脫。5) 用約10 倍床

28、體積的含40 mmol/L 咪唑的緩沖液C 洗脫。6) 用約 5 倍床體積的含400 mmol/L 咪唑的緩沖液C 解析下目標蛋白質(zhì)。緩沖液A : Tris Cl (pH8.0) 50 mmol/ LEDTA0.5 mmol/ LNaCl0.4 mmol/ LMgCl5 mmol/ L甘油 5%鹽酸胍溶液：鹽酸胍6 mol/ LTris Cl (pH8.0)50 mmol/ L甘油5%緩沖液B：Tris Cl (pH 7.9) 10 mmol/ L甘油10%NaCl0.5 mmol/ L緩沖液C：Tris Cl (pH 7.9) 20 mmol/ L甘油20%KCl100 mmol/ L3、

29、透析袋與超濾膜的使用注意事項緩沖液置換或濃縮?？捎妹擕}層析柱、透析袋或超濾膜對蛋白質(zhì)溶液進行脫鹽、對于透析脫鹽，宜采用逐漸降低鹽濃度的方式進行。(一)透析袋使用注意事項1. 應(yīng)帶上一次性薄膜手套操作透析袋。2. 透析袋一般剪成10-20 cm 的小段。3. 新透析袋應(yīng)在2% (w/v)碳酸氫鈉和1 mmol/L (pH8.0) EDTA中煮沸10分鐘， 然后用蒸餾水清洗干凈，再用 1 mmol/L (pH8.0) EDTA 中煮沸 10 分鐘。 冷卻后，4保存于20%的乙醇中。4. 用過的透析袋需用蒸餾水徹底清洗干凈，然后浸于20%的乙醇中，在4保存?zhèn)溆?。超濾膜使用注意事項1. 不要用手直接拿

30、超濾膜，應(yīng)用平頭鑷子小心夾取超濾膜的邊緣。2. 在4，10%-20%的乙醇中保存，不要冰凍。3. 使用過的超濾膜應(yīng)進行再生處理(放在培養(yǎng)皿中，在脫色搖床上進行)，具體方案如下:(1) 蒸餾水漂洗2 分鐘。(2) 用 0.1 mol/L NaOH 漂洗 10分鐘。(3) 用蒸餾水漂洗以除去NaOH。(4) 70%乙醇浸泡5 分鐘。(5) 用蒸餾水漂洗2 分鐘，再保存于10%-20%的乙醇中。4. 光面向上。5. 應(yīng)避免超濾pH 小于 3.0或 pH 大于 13的溶液。6. 不能與下列溶液混用：( 1) 胺( 2) 大于10%的磷酸溶液。( 3) 大于0.5%的酚溶液。( 4) 大于0.01 mo

31、l/L 的鹽酸。四、蛋白質(zhì)濃度的測定蛋白質(zhì)的濃度用BCA Protein Assay Kit (pierce 公司 ) 測定，以牛血清白蛋白為標準。具體方案如下：1. 用 Kit 中的牛血清白蛋白標樣配制成下列不同濃度的標準溶液：2,000 g/ml, 1,500g/ml、1,000 g/mk 750 g/ml、500 g/ml、250 g/ml、125 g/ml 及 25 g/ml (0 g/ml=空 白溶液) 。在這里，配標準溶液所用的稀釋劑應(yīng)與待測樣品的相同。2. 將 50 體積的 BCA 試劑 A 與 1 體積的試劑B 充分混合，從而配成工作溶液。工作溶液最好在測定的當天配制。3. 分

32、別將 0.15 ml 標準溶液、待測樣品及空白溶液與3 ml 工作溶液在5 ml 離心管中混合，37保溫30 分鐘。然后，迅速用冰浴冷卻所有的管。4. 用蒸儲水調(diào)零，在562 nm處測定樣品的光密度值（最好在 10分鐘內(nèi)完成）。5. 從標準溶液和所測樣品的562 nm 光密度值中減去空白溶液的相應(yīng)吸收值，即得到凈吸收值。然后，以牛血清白蛋白濃度為橫坐標，以相應(yīng)的562 nm 凈吸收值為縱坐標作標準曲線。用標準曲線判定每個未知樣品的濃度。第三章DNA-蛋白質(zhì)相互作用研究方法一、 凝膠遷移率變動實驗（gel shift or electrophoretic mobilityshift assay）

33、凝膠遷移率變動實驗又稱凝膠滯留法（gel retardation assa»或遷移率改變法（ mobility shift assay） ，是檢測DNA 結(jié)合蛋白的一種簡單迅速而又靈敏可靠的實驗方法。凝膠遷移率變動實驗的基本原理是：當 DNA 結(jié)合蛋白與相應(yīng)的DNA 片斷或寡核苷酸結(jié)合而形成DNA- 蛋白質(zhì)復(fù)合物后，使DNA 片段的分子量及電荷發(fā)生改變，因而在聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中其電泳遷移率發(fā)生改變，通常較游離的DNA 片段的泳動速率慢得多，在放射自顯影X 光膠片上形成一較游離DNA 片斷滯后的帶型。DNA 片段的制備DNA片段的長度一般要求在300 bp一下。DNA片斷過大，在

34、聚丙烯酰胺凝膠DNA 片斷泳動速度的輕微改變不易監(jiān)測到。1. 對于 DNA 酶切片段，需用牛小腸堿性磷酸酶（CIAP ）去除 DNA 片段中的5? 磷酸，具體方案如下：在40履體系中，力口 1膜CIAP （0.1 U/履）,37 c保溫15分鐘，56c保溫15分鐘；再用CIAP 處理一次；用苯酚/氯仿抽提一次，向上清中加入5 mol/L NaCl 至終濃度為0.2 mol/L,以及兩倍體積無水乙醇，-20C過夜；12,000 rpm離心5分鐘以 沉淀DNA。DNA 溶于雙蒸水中。2. 對于合成的單鏈DNA 片斷，需要退火，具體方案如下：將兩條互補的單鏈DNA片斷分別溶解于雙蒸水中，在EP管中等

35、摩爾數(shù)混合后, 放入100水中，自然冷卻到37以下。（2） DNA 片段的標記1. 在一個潔凈的EP 管中，分別加入下列組分：DNA 片段 5-6 pmolT4多聚核甘酸激酶10X Buffer 1小-32PATP （3,000 Ci/mmol, 10 仙 Ci/ 仙 l） 2 仙 l或-32PATP （5,000 Ci/mmol, 10 仙 Ci/ 小）3 仙 l加水至總體積為9履T4多聚核甘酸激酶（5-10 u/仙l） 1屋2. 混勻，37保溫10分鐘。3. 力口 1膜 0.5 mol/L EDTA 終止反應(yīng)。（3） 游離產(chǎn)PATP的去除1 . 對于小于18 bp 的 DNA 片斷，可用G

36、-25 離心柱去除其中未結(jié)合的產(chǎn)PATP。2 . 對于大于18 bp 的 DNA 片斷，可用乙醇沉淀的方法去除其中未結(jié)合的-32PATP,具體方案如下：加 0.5倍體積的7.5 mol/L 乙酸銨和兩倍體積的無水乙醇，-70放置30分鐘；12,000 rpm離心5分鐘以沉淀DNA ; DNA溶于50仙l雙蒸水中，即為32P標記的 DNA片斷溶液。32P標記的DNA片斷溶液可放在密閉的鉛罐中，并保存在-20C備 用。遷移率變動實驗32P標記DNA片斷的量一般為0.1-1 ng,可根據(jù)具體情況適當增減，以能形成 清晰的滯后帶而游離DNA帶又不過濃為宜；蛋白質(zhì)的量為0.1-10 Ng,應(yīng)進行預(yù)實 驗

37、摸索出適宜的蛋白質(zhì)加入量。以能形成清晰的滯后帶，而又有適量的游離DNA帶殘存為宜。3 . 在無菌的EP 管中建立下列反應(yīng)：反應(yīng) 1（負對照）：7仙l雙蒸水4 n l Gel Shift Binding 5 x Buffer0仙l蛋白質(zhì)溶液9叱l總體積反應(yīng) 2（正對照）：祖l雙蒸水5 n l Gel Shift Binding 5 x Buffer膜蛋白質(zhì)溶液9仙l總體積反應(yīng)3（專一性競爭物）：l雙蒸水6 n l Gel Shift Binding 5 x Buffer膜蛋白質(zhì)溶液1仙l未標記的DNA片斷（5-6 pmol）9叱l總體積2 .室溫放置5-10分鐘，然后在上述每個反應(yīng)管中分別加 1小32P標記的DNA 片斷。3 . 室溫放置20