琥珀酸脫氫酶的提取與活力測定的研究進展

1、琥珀酸脫氫酶的提取與活力測定的研究進展【摘要】【摘要】 琥珀酸脫氫酶是線粒體的一種標志酶，是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，可為真核細胞線粒體和多種原核細胞需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子， 其活性一般可作為評價三竣酸循環(huán)運行程度的指標。 本文從琥珀酸脫氫 酶的提取、純化及活性檢測方法等兒方面介紹了琥珀酸脫氫酶的研究進展情 況。【關(guān)鍵詞】鍵詞】琥珀酸脫氫酶線粒體三竣酸循環(huán)琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase,簡稱 SDH),黃素酶類，是 線粒體內(nèi)膜的結(jié)合酶，屬膜結(jié)合酶，是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之 一，可為真核細胞線粒體和多種原核細胞需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子，為線

2、 粒體的一種標志酶。作為參與三竣酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，琥珀酸脫氫酶是反映線粒 體功能的標志酶(marker enzyme)之一，其活性一般可作為評價三竣酸循環(huán)運 行程度的指標1,對于評價精子線粒體功能、研究致奶牛酮缺乏癥病理過程等 具有重要意義23。本文從琥珀酸脫氫酶的提取、純化、性質(zhì)及其測定方法等兒方面回顧并介紹了琥珀酸脫氫酶的研究進展情況。1琥珀酸脫氫酶的提取與生理意義琥珀酸脫氫酶的提取與生理意義琥珀酸脫氫酶存在于所有有氧呼吸細胞，和線粒體膜牢固結(jié)合，是三竣酸循環(huán)中唯一與內(nèi)膜結(jié)合的酶，是脫氫酶中最重要的酶。迄今為止，已從 多種原核和真核組織中分離純化出這種酶，為該酶的酶學研究奠定了基礎。作 為膜

3、內(nèi)酶，琥珀酸脫氫酶與具有脂雙層結(jié)構(gòu)的線粒體膜結(jié)合得比較緊密，很難 溶解下來，而且其一旦離開膜后，暴露在空氣中會很快失活，因此其提純難度 很大。1930 年我國著名生物化學家王應睞、鄒承魯、汪靜英等開展對膜蛋口琥 珀酸脫氫酶的研究，經(jīng)過反復實驗最后以正丁醇抽提法成功地把琥珀酸脫氫酶 從鼠肝組織線粒體膜上溶解下來，得到了高純度的水溶性琥珀酸脫氫酶，其活 力比同期國外報道者高出 1 倍以上，從而奠定了我國在琥珀酸脫氫酶研究領域 的領先地位4。其后，Davis等(1971、1977)使用 NaC104 從牛心線粒體溶 解下此酶56； Tsukaho Hattori和 Tadashi Asahi (19

4、82)選用離子型去垢 劑脫氧膽酸鈉從番薯根線粒體提取 SDH7h Suraveratum等(2000)對惡性瘧 原蟲的琥珀酸脫氫酶進行了純化8；夏玉鳳等（2000）以玉米黃化苗為生物材 料，通過差速離心獲得線粒體，使用超聲波將其破碎，用 2%Triton X-100 溶 膜，超速離心，硫酸鍍沉淀，DEAE-C32 層析純化琥珀酸脫氫酶9；辛明秀等 （2004）用常規(guī)酶學方法從嗜冷酵母（Y18）中分離純化出有催化活性的琥珀酸 脫氫酶10。琥珀酸脫氫酶是直接連在電子傳遞鏈上的，氫受體是 FAD 而不是NAD+,它使琥珀酸氧化為延胡索酸過程中所產(chǎn)生的 FADH2 與酶結(jié)合，將來自FADH2 的兩個電

5、子直接傳遞給酶的 Fe3+1112。現(xiàn)有研究表明，琥珀酸脫氫 酶由 a、0 兩個亞基組成，a 亞基相對分子質(zhì)量為 70.0X103,含有 FAD 和兩 個鐵硫簇；B 亞基相對分子質(zhì)量為 27.0X103,含有一個鐵硫簇1314。2琥珀酸脫氫酶的常用測定方法琥珀酸脫氫酶的常用測定方法琥珀酸脫氫酶活力測定方法 LI詢主要有五種。2. 1 硫酸甲酯吩嗪（PMS）反應法1316琥珀酸脫氫酶能通過一系列人工電子受體， 如與 PMS（吩嗪二甲酯硫酸鹽） ， DCPIP（2, 6-二氯酚靛 酚）等發(fā)生反應催化琥珀酸的氧化，而借助這些中間產(chǎn)物的顏色變化，通過分 光光度計檢測即可加以定量反映， 其反應式為： S

6、uecinate+PMSFumarate +PMSH2：PMSH2+DCPIP-PMS+DCPIPH2。 DCPIP 呈藍色， 標準的吸收光譜在 600nm 處，這種色澤可因其還原而漸次變淡，從而 600nm處的光密度的變化與 DCPIP 含量成正比，測定 2. 6-DPIP 的還原速度可以推算出 SDH 的活力。一分子 DCPIP 被還原，即代表一分子琥珀酸被氧化。故可測定此反應系統(tǒng)在 600nm處 的吸收光度變化， 來計算 SDH的活性。 SDH活性計算：（標準一測定） /標準 =Umol/min/mgo2.2鐵氤化鉀K3Fe （CN） 6還原法以鐵氤化鉀 K3Fe（CN）6和琥珀酸鈉為底

7、物， 使琥珀酸脫氫酶催化反應將鐵氤化鉀還原為亞鐵氤化鉀 K4Fe（CN） 6, K4Fe （CN） 6再與 Fe3 +作用生成普魯士藍，在 700nm 波長測定吸光 值，以檢測普魯士藍之生成量，作為琥珀酸脫氫酶的還原力，吸光值愈高表示 琥珀酸脫氫酶活力愈強。2.3TTC（氯化三苯四氮醴）法 無色 TTC（2, 3, 5-氯化三苯基四 醴）作為人造受氫體，它在細胞呼吸過程中接受氫，還原成三苯基甲膳（TF）。后者以紅色晶體的形式存在于細胞內(nèi)，采用有機溶劑（如甲苯、乙酸乙醋、 三氯中烷、 丙酮或乙醇等） 進行萃取。 萃取液測定 485nm 吸光度后， 以 TTC還原量表示脫氫酶活性，根據(jù)標準曲線計算

8、 TF生成量，進而求出 TTC-脫氫 酶活性。2.4MTT法 MTT 是一種黃顏色的染料?；罴毎€粒體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原 MTT,同時在細胞色素 C 的作用下生成藍色(或藍紫色)不溶 于水的甲腌(Formazana),經(jīng)異丙醇作用顆粒溶解顯色。在通常情況下，甲騰 生成量與活細胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)光密度 570nm處 0D值推測出活細胞的數(shù) 目。2.5NBT (氯化硝基四氮醴藍)法17 NBT 易溶于水， 呈淡黃色，以BT為受氫體，接受山琥珀酸鈉鹽被酶作用而脫下的氫，進而形成紫藍色的 沉淀，于反應體系中加入 PMS,混勻，37C 保溫 30min,之后加入 TCA終止反 應。加異丙醇溶

9、解顯色，混勻，即可于 548nm測 0D值。規(guī)定：30min 內(nèi) 548nm 下 0D值為 1. 0時的酶量為 1個活力單位。比活力二活力單位數(shù)/毫克蛋白?！緟⒖嘉墨I】【參考文獻】1李勤報，梁厚果.輕度水分脅迫的小麥幼苗中與呼吸有關(guān)的兒種酶活性變化J.植物生理學報，1988, 14 (3) : 217222.2 薛小萍，商學軍，傅健，等.精子線粒體琥珀酸脫氫酶的檢測及意義 J.中華男科學，2003, 9 (8) : 601 603.3 柴春彥，劉國艷，石發(fā)慶.銅缺乏奶牛琥珀酸脫氫酶的組化特征J.中國 獸醫(yī)雜志，2002, 38 (2) : 57.4 王應睞同志生平介紹-李伯良同志在王應睞教授遺

10、體告別儀式上的悼詞 R.生命的化學，2001, 21 (3) : 176177.5 Davis K A, Hatefi Y Succinate dehydrogenase 1 purification, molecularproperties and substructureJ Biochemistry 1971, 10 (13) : 25092516.6一 Davis K A, Hatefi Y, Cravford I P Purification, molecular properties and aminoacid composition of the subunits of Rhodo

11、spirillom rubrum succinatedehydrogenaseJZ Archives of Biochemistry and Biophysics, 1977, 180： 459464.7 Tsukaho Hattori, Tadashia sahi The presense ot two torms of succinatedehydrogenase in sweet potato root mitochondriaJ Plant Cell Physiol,1982, 23 (3) :515523.8鄭春福惡性瘧原蟲琥珀酸脫氫酶的純化及其生化特征J國外醫(yī)學寄生 蟲病分冊，20

12、00, 27 (6) : 270271 夏玉鳳，孫新立，馮小燕，等.琥珀酸脫氫酶的純化研究J.河北師范大 學學報,2000, 24 (4) : 519521.10辛明秀， 周培瑾.冷活性琥珀酸脫氫酶的特性J.北京師范大學學報，2004, 40(1) ： 108113.1L Stryer L BiochemistryM Beijing:PekinUniv Press, 1992 口蝦姑琥珀酸脫氫酶(SDH)同工酶的組織特25 (3) : 14314513 王鏡巖，朱圣庚，徐長法.生物化學M.北京：高等教育出版社,2002, 9.14 辛明秀，周培瑾.冷活性琥珀酸脫氫酶的特性J北京師范大學學報, 2004,40 (1) ： 108113.15 J. H. Cherry 植物分子生物學實驗指導J 科學出版社,197916 周家聲， 尤偉， 劉義.蜂膠醇提物對大鼠肝臟線粒體氧自山基損傷的保護 作用J錦州醫(yī)學院學報,2005, 26 (5)