蛋白質(zhì)提取與制備的原理和方法

1、蛋白質(zhì)提取與制備蛋白質(zhì)種類很多，性質(zhì)上的差異很大，既或是同類蛋白質(zhì)，因選用材料不 同，使用方法差別也很大，且又處于不同的體系中，因此不可能有一個(gè)固左的程序適用各類蛋 白質(zhì)的分離。但多數(shù)分離工作中的關(guān)鍵部分基本手段還是共同的，大部分蛋白質(zhì)均可溶于水、 稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機(jī)溶劑中。因 此可采用不同溶劑提取、分離及純化蛋白質(zhì)和酶。蛋白質(zhì)與酶在不同溶劑中溶解度的差異，主要取決于蛋白分子中非極性疏水基團(tuán)與極性親水 基團(tuán)的比例，其次取決于這些基團(tuán)的排列和偶極矩。故分子結(jié)構(gòu)性質(zhì)是不同蛋白質(zhì)溶解差異的 內(nèi)因。溫度、pH、離子強(qiáng)度等是影響蛋白質(zhì)溶解度的外界條件

2、。提取蛋白質(zhì)時(shí)常根據(jù)這些內(nèi)外 因素綜合加以利用。將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)提取出來。并與英它不需要的物質(zhì)分開。但動(dòng)物材料中的 蛋白質(zhì)有些可溶性的形式存在于體液（如血漿、消化硫等）中，可以不必經(jīng)過提取直接進(jìn)行分 離。蛋白質(zhì)中的角蛋白、膠原及線蛋白等不溶性蛋白質(zhì)，只需要適當(dāng)?shù)娜軇┫慈タ扇苄缘陌殡S 物，如脂類、糖類以及英他可溶性蛋白質(zhì)，最后剩下的就是不溶性蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)經(jīng)細(xì)胞 破碎后，用水、稀鹽酸及緩沖液等適當(dāng)溶劑，將蛋白質(zhì)溶解出來，再用離心法除去不溶物，即 得粗提取液。水適用于白蛋白類蛋白質(zhì)的抽提。如果抽提物的 pH 用適當(dāng)緩沖液控制時(shí)，共穩(wěn)定 性及溶解度均能增加。如球蛋白類能溶于稀鹽溶液中，脂蛋白可用稀

3、的去垢劑溶液如十二烷基硫酸鈉、洋地黃皂昔（Digitonin）溶液或有機(jī)溶劑來抽提。英它不 溶于水的蛋白質(zhì)通常用稀堿溶液抽提。蛋白質(zhì)類別和溶解性質(zhì)白蛋白和球蛋白：溶于水及稀鹽、稀酸、稀堿溶液，可被 50%飽和度硫酸彼析出。真球蛋白：一般在等電點(diǎn)時(shí)不溶于水，但加入少量的鹽、酸、堿則可溶解。擬球蛋白：溶于水，可為 50%飽和度硫酸彼析出醇溶蛋白：溶于7080%乙醇中，不溶于水及無水乙醇?xì)さ鞍祝涸诘入婞c(diǎn)不溶于水，也不溶于稀鹽酸，易溶于稀酸、稀堿溶液精蛋白：溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀組蛋白：溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀硬蛋白質(zhì)：不溶于水、鹽、稀酸及稀堿綴合蛋白（包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白

4、、脂蛋白、血紅蛋白、金屬蛋白、黃素蛋白和氮苯蛋白等）：此類蛋白質(zhì)溶解性質(zhì)隨蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)結(jié)合部分的不同而異，除脂蛋白外, 一般可溶于稀酸、稀堿及鹽溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，則脂溶性占優(yōu)勢(shì)，如脂肪部分 被包用于分子之中，則水溶性占優(yōu)勢(shì)。蛋白質(zhì)的制備是一項(xiàng)十分細(xì)致的工作。涉及物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)的知識(shí)很廣。近年來雖然有 了不改進(jìn)，但英主要原理仍不外乎兩個(gè)方面: 一是利用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別，把它們分配于可用機(jī)械方法分離的兩個(gè)或幾個(gè)物相 中，如鹽析、有機(jī)溶劑提取、層析和結(jié)晶等: 二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場(chǎng)的作用使各組分分配于不同區(qū)域而達(dá)到分離的目 的，如電泳、超離心、超

5、濾等。由于蛋白質(zhì)不能溶化，也不能蒸發(fā)，所能分配的物相只限于固 相和液相，并在這兩相間互相交替進(jìn)行分離純化。制備方法可按照分子大小、形狀、帶電性質(zhì)及溶解度等主要因素進(jìn)行分類。按分子大小和形態(tài) 分為差速離心、超濾、分子篩及透析等方法：按溶解度分為鹽析、溶劑抽提、分配層析、逆流 分配及結(jié)晶等方法；按電荷差異分為電泳、電滲析、等電點(diǎn)沉淀、離子交換層析及吸附層析等: 按生物功能專一性有親合層析法等。由于不同生物大分子結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同，分離方法也不一樣。即同一類生物大分子由于 選用材料不同，使用方法差別也很大。因此很難有一個(gè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的方法對(duì)任何蛋白質(zhì)均可循用。 因此實(shí)驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行充分調(diào)查研究，查閱有關(guān)文獻(xiàn)

6、資料，對(duì)欲分離提純物質(zhì)的物理、化學(xué)及生物 學(xué)性質(zhì)先有一泄了解，然后再著手進(jìn)行實(shí)驗(yàn)工作。對(duì)于一個(gè)未知結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的試樣進(jìn)行創(chuàng)造性 的分離提純時(shí)，更需要經(jīng)過各種方法比較和摸索， 才能找到一些工作規(guī)律和獲得預(yù)期結(jié)果。 其 次在分離提純工作前，常須建立相應(yīng)的分析鑒左方法，以正確指導(dǎo)整個(gè)分離純化工作的順利進(jìn) 行。高度提純某一生物大分子，一般要經(jīng)過多種方法、步驟及不斷變換各種外界條件才能達(dá)到 目的。因此，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程方法的優(yōu)劣，選擇條件效果的好壞，均須通過分析鑒泄來判明。3樓 物理方法主要通過各種物理因素的作用，使組織細(xì)胞破碎的方法。I反復(fù)凍融法于冷藏庫或干冰反復(fù)于零下 1520C使之凍固，然后緩慢地融解，

7、如此反 復(fù)操作，使大部分細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)顆粒破壞。由于滲透壓的變化，使結(jié)合水凍結(jié) 產(chǎn)生組織的變性，冰片將細(xì)胞膜破碎，使蛋白質(zhì)可溶化，成為粘稠的濃溶液， 但脂蛋白凍結(jié)變性。II冷熱變替法將材料投入沸水中，于 90C左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即置于冰浴中使之迅速冷 卻，絕大部分細(xì)胞被破壞。II【超聲波法暴壺于 910千周聲波或 10500 千周超聲波所產(chǎn)生的機(jī)械振動(dòng)，只要有設(shè) 備該法方便且效果也好，但一次處理量較小。應(yīng)用超聲波處理時(shí)應(yīng)注意避免溶 液中氣泡的存在。處理一些超聲波敏感的蛋白質(zhì)酶時(shí)宜慎重。IV加壓破碎法加一泄氣壓或水圧也可使細(xì)胞破碎?；瘜W(xué)及生物化學(xué)方法I有機(jī)溶媒法粉碎后的新鮮材料在 0C 以下加入

8、510倍量的丙酮，迅速攪拌均勻，可破 碎細(xì)胞膜，破壞蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合。蛋白質(zhì)一般不變性，被脫脂和脫水成為 干燥粉末。用少疑乙瞇洗，經(jīng)濾紙干燥，如脫氫酶等可保存數(shù)月不失去活性。 II自溶法將待破碎的鮮材料在一立 pH和適當(dāng)?shù)臏囟认拢?利用自身的蛋白酶將細(xì)胞破 壞，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。比較穩(wěn)左，變性較難，蛋白質(zhì)不被分解而可溶化。 利用該法可從胰臟制取竣肽酶。自體融解時(shí)需要時(shí)間，需加少疑甲苯、氯仿等。 應(yīng)防止細(xì)菌污染。于溫室 30C 左右較早溶化。自體融解過程中 PH顯著變化，隨 時(shí)要調(diào) pH.自溶溫度選在 04C,因自溶時(shí)間較長(zhǎng)，不易控制，所以制備活 性蛋白質(zhì)時(shí)較少用。III酶法與前述的自體融

9、法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去變性蛋白質(zhì)。但值得提 出的是溶菌酶處理時(shí)，它能水解構(gòu)成枯草菌等菌體膜的多糖類。能溶解菌的酶 分布很廣。尤英卵白中含疑高，而多易結(jié)晶化。lg菌體加 110陀溶菌酶，p H6.27.Olh內(nèi)完全溶菌。于生理食鹽水或 0. 2mol蔗糖溶液中溶菌，雖失去細(xì) 胞膜，但原形質(zhì)沒有脫岀。除溶菌酶外，蝸牛酶及纖維素酶也常被選為破壞細(xì) 菌及植物細(xì)胞用。表面活性劑處理較常用的有十二烷基磺酸鈉、氯化十二烷基毗淀及去氧膽酸鈉等。此外一些細(xì)胞膜較脆弱的細(xì)胞，可把它們置于水或低滲緩沖劑中透析將細(xì) 胞脹破。2、細(xì)胞器的分離制備某一種生物大分子需要采用細(xì)胞中某一部分的材料，或者為了純化某 一特

10、左細(xì)胞器上的生物大分子，防止其他細(xì)胞組分的干擾，細(xì)胞破碎后常將細(xì) 胞內(nèi)各組分先行分離，對(duì)于制備一些難度較大需求純度較高的生物大分子是有 利的。尤其近年來分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、遺傳工程等學(xué)科和技術(shù)的發(fā)展， 對(duì)分布在各種細(xì)胞器上的核酸和蛋白質(zhì)的研究工作日益增多，分離各種細(xì)胞器 上的各類核酸和特異性蛋白質(zhì)已成為生物大分子制備工作重要內(nèi)容之一。各類 生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的分布是不同的。DNA 幾乎全部集中在細(xì)胞核內(nèi)。RNA 則大 部分分布于細(xì)胞質(zhì)。各種酶在細(xì)胞內(nèi)分布也有一立位宜。因此制備細(xì)胞器上的 生物大分子時(shí)，預(yù)先須對(duì)整個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和各類生物大分子在細(xì)胞內(nèi)分布匹有所 了解。以肝細(xì)胞為例，蛋白質(zhì)、酶及核

11、酸在肝細(xì)胞內(nèi)分布情況為： 細(xì)胞核： 精蛋白、組蛋白、核酸合成酶系 RNA占總量 10喘左右 DA幾乎全部粒線體：電子傳遞、氯化磷酸化、三竣酸循環(huán)、脂肪酸氧化、氨基酸氧化、腮合成等酶系 RNA 占總量 5$左右 DNA 微量 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（微粒體）： 蛋白質(zhì)合成酶系、疑化酶系 RNA占總量 50%左右溶酶體： 水解酶系（包括核酸酶、磷酸脂酶、組織蛋白酶及糖昔及糖昔酶等） 高爾基氏體：糖昔轉(zhuǎn)移酶、粘多糖及類固醇合成酶系細(xì)胞膜： 載體與受體蛋白、特異抗蛋、ATP 酶、環(huán)化腺昔酶、5 -核昔酸酶、 琥珀酸脫氫酶、匍萄糖-6-磷酸酶等，細(xì)胞液喀嚨和嚓吟代謝、氨基酸合成酶系、可溶 性蛋白類 RNA （主要為 t

12、RNA）占總30%.細(xì)胞器的分離一般采用差速離心法。 細(xì)胞經(jīng)過破碎后， 在適當(dāng)介質(zhì)中進(jìn)行差速 離心。利用細(xì)胞各組分質(zhì)量大小不同，沉降于離心管內(nèi)不同區(qū)域，分離后即得 所需組分。細(xì)胞器的分離制備、介質(zhì)的選擇十分重要。最早使用的介質(zhì)是生理 鹽水。因它容易使亞細(xì)胞顆粒發(fā)生聚集作用結(jié)成塊狀， 沉淀分離效果不理想， 現(xiàn)一般改用蔗糖、 Ficoll（種蔗糖多聚物）或匍萄糖-聚乙二醇等髙分子溶液。4 樓1.水溶液提取大部分蛋白質(zhì)均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中。因此蛋白質(zhì)的提取一 般以水為主。稀鹽溶液和緩沖溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)立性好、溶度大，也是提取蛋白 質(zhì)的最常用溶劑。以鹽溶液及緩沖液提取蛋白質(zhì)經(jīng)常注意下面幾個(gè)因

13、素。 鹽濃度等滲鹽溶液尤以 0. 020. 05mol/L 磷酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液常用。0. 15mol/L 氯化鈉溶液應(yīng)用也較多。如 6-磷酸葡萄糖脫氫酶用 0. lmol/L 碳酸氫鈉液 提取等。有時(shí)為了螯合某些金屬離子和解離酶分子與英他雜質(zhì)的靜電結(jié)合，也 常使用枸椽酸鈉緩沖液和焦磷酸鈉緩沖液。有些蛋白質(zhì)在低鹽濃度下濃度低， 如脫氧核糖核蛋白質(zhì)需用 lmol/L以上氯化鈉液提取。總之，只要能溶解在水溶 液中而與細(xì)胞顆粒結(jié)合不太緊密的蛋白質(zhì)和酶，細(xì)胞破碎后選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度 及 PH,般是不難提取的。只有某些與細(xì)胞顆粒上的脂類物質(zhì)結(jié)合較緊的，需 采用有機(jī)溶劑或加入表面活性劑處理等方法提取。

14、PH值蛋白質(zhì)提取液的 PH值首先應(yīng)保證在蛋白質(zhì)穩(wěn)定的范圍內(nèi)，即選擇在偏離等 電點(diǎn)兩側(cè)。如堿性蛋白質(zhì)則選在偏酸一側(cè)，酸性蛋白質(zhì)選擇偏堿一側(cè)，以增大 蛋白質(zhì)的溶解度，提高提取效果。如細(xì)胞色素 C屬堿性蛋白質(zhì)，常用稀酸提取, 肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質(zhì)，用稀堿提取。某些蛋白質(zhì)或酶與其分 物質(zhì)結(jié)合常以離子鍵形式存在，選擇 PH36范圍對(duì)于分離提取是有利的。 溫度多數(shù)酶的提取溫度在 5C以下。少數(shù)對(duì)溫度耐受性較高的蛋白質(zhì)和酶，可適 當(dāng)提髙溫度，使雜蛋白變性分離且也有利于提取和進(jìn)一步純化如胃蛋白酶等 及許多多肽激素類，選擇 3750C 條件下提取，效果比低溫提取更好。此外提取酶時(shí)加入底物或輔酶

15、， 改變酶分子表面電荷分布， 也能促進(jìn)提取 效果。2. 有機(jī)溶劑提取有機(jī)溶劑提取用于提取蛋白質(zhì)的實(shí)例至今是不多的。但一些和脂結(jié)合較牢或 分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)，不溶于水、稀鹽或稀堿液中，可用不同比例 的有機(jī)溶劑提取。從一些粒線體（Mitochondria）及微粒體（Microsome）等含 多量脂質(zhì)物質(zhì)中提取蛋白質(zhì)時(shí)，采用 Morton 的丁醇法效果較好。因丁醇使蛋白 質(zhì)的變性較少，親脂性強(qiáng)，易透入細(xì)胞內(nèi)部，與水也能溶解 10%,因此具有脂質(zhì) 與水之間的表而活性作用，可占據(jù)蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合點(diǎn)，也阻礙蛋白質(zhì)與脂 質(zhì)的再結(jié)合，使蛋白質(zhì)在水中溶解能力大大增加。丁醇提取法的 pH及溫度選擇 范

16、用較廣（pH310,溫度-2至 40C）。國內(nèi)用該法曾成功地提取了琥珀酸脫 氫酶。丁醇法對(duì)提取堿性磷酸脂酶效果也是十分顯著的。胰島素既能溶于稀酸、 稀堿又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中。以 60-70%的酸性乙醇提取效果最好，一 方而可抑制蛋白質(zhì)水解酶對(duì)胰島素的破壞，同時(shí)也達(dá)到大量除去雜蛋白的目的。3. 表而活性劑的利用對(duì)于某些與脂質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)和酶，也有采用表而活性劑如膽酸鹽及十二 烷基磺酸鈉等處理。表而活性劑有陰離子型（如脂肪酸鹽、烷基苯磺酸鹽及膽酸鹽等），陽離子 型（如氧化節(jié)烷基二甲基彼等）及非離子型（Triton X-100、Tirton X-ll4. 吐溫 60及吐溫 80） 等。 非離

17、子型表而活性劑比離子型溫和， 不易引起酶失活, 使用較多。對(duì)于膜結(jié)構(gòu)上的脂蛋白和結(jié)構(gòu)，己廣泛采用膽酸鹽處理，兩者形成 復(fù)合物，并帶上凈電荷，由于電荷再排斥作用使膜破裂。近年來研究膜蛋白使 用表而活性劑的稀溶液提取時(shí)，較喜歡用非離子型表面活性劑。4.對(duì)提取物的保護(hù)在各種細(xì)胞中普遍存在著蛋白水解酶，提取時(shí)要注意防止由它引起的水解。前面所講的降低提取溫度英目的之一也是防止蛋白水解酶的水解。多數(shù)蛋白水 解酶的最適 PH在 35 或更高些，因在較低 PH條件下可降低蛋白質(zhì)水解酶引起 的破壞程度。低 pH可使許多酶的酶原在提取過程中不致激活而保留在酶原狀 態(tài)，不表現(xiàn)水解活力。加蛋白質(zhì)水解酶的抑制劑也同樣起

18、保護(hù)作用，如以絲氨 酸為活性中心的酶加二異丙基氟磷酸，以兢基為中心的酶加對(duì)氯汞苯甲酸等。 提取溶液中加有機(jī)溶劑時(shí)也能產(chǎn)生相類似的作用。蛋白水解酶的性質(zhì)變化很大, 上述條件均視具體對(duì)象而變化。200S-3-26 16:21有一些蛋白含兢基，這些猛基可能是活性所必需。在提取這種蛋白不要帶 入金屬離子和氧化劑。 前者可往提取液中加金屬螯合劑如 EDTA,后者可加入還 原劑如抗壞血酸。有某些蛋白質(zhì)帶一些非共價(jià)鍵結(jié)合的配基。提取時(shí)要注意保 護(hù)，不要使酸基丟失。蛋白質(zhì)提取與制備的方法：1.分離純化的原則從破碎材料或細(xì)胞器提出的蛋白質(zhì)是不純的，需進(jìn)一步純化。純化包括將 蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)分開，將各種不同的蛋白

19、質(zhì)分開。選擇提取條件時(shí)，就要考 慮盡量除去非蛋白質(zhì)。一般總是有其它物質(zhì)伴隨混入提取液中。但有些雜質(zhì)（如 脂肪）以事先除去為宜。先除去便于以后操作。常用有機(jī)溶劑提取除去。對(duì)于異類物質(zhì)，提純蛋白質(zhì)和酶時(shí)常混有核酸或多糖，一般可用專一性酶 水解，有機(jī)溶劑抽取及選擇性部分沉淀等方法處理。小分子物質(zhì)常在整個(gè)制備 過程中通過多次液相與固相轉(zhuǎn)化中被分離或最后用透析法除去。而對(duì)同類物質(zhì) 如酶與雜蛋白、RNA、DNA 以及不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)、酶、核酸之間產(chǎn)分離，情況 則復(fù)雜得多。主要采用的方法有鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法，等電點(diǎn)沉淀法、吸 附法、結(jié)晶法、電泳法、超離心法及柱層析法等。英中鹽析法、等電點(diǎn)法及結(jié) 晶法用于

20、蛋白質(zhì)和酶的提純較多，有機(jī)溶劑抽提和沉淀用于核提純較多，柱層 析法、梯度離心法對(duì)蛋白質(zhì)和核酸的提純應(yīng)用十分廣泛。如前所述，蛋白質(zhì)的 分離純化較難，而且其本身的性質(zhì)又限制了某些方法的使用，因此要研究目的 物的微細(xì)特征，巧妙的聯(lián)用備種方法并進(jìn)行嚴(yán)密的操作，同時(shí)有必要了解精制 各過程的精制程度和回收率。具有活性的蛋白質(zhì)可利用吸收光譜等物理性質(zhì)或 以相當(dāng)于單位氮活性增加為尺度進(jìn)行追蹤。苴他蛋白質(zhì)可用電泳、超離心、層 析、擴(kuò)散及溶解等測(cè)定純度。如結(jié)晶核糖核酸酶經(jīng)層析分為兩個(gè)成分?？梢妼?duì) 確定蛋白質(zhì)結(jié)晶純度尚無最終的尺度。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)即或純凈的標(biāo)準(zhǔn)品，有極微戢 的不純物時(shí)，也會(huì)給實(shí)驗(yàn)帶來較大的影響。不穩(wěn)立的蛋

21、白質(zhì)，如分離 SH-酶時(shí) 使用試劑及緩沖液等， 要確認(rèn)不含重金屬離子 （特級(jí)試劑也需檢龍） 。蛋白質(zhì)純 化的操作如脫鹽、濃縮干燥等均與低分子化合物不同，必須經(jīng)過獨(dú)特的繁瑣操 作。蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互分離主要利用它們之間的并種性質(zhì)的微小差別。諸如 分子形狀、分子量大小、電離性質(zhì)、溶解度、生物功能專一性等。蛋白質(zhì)提取 液中，除包含所需要的蛋白質(zhì)（或酶）夕卜，還含有苴它蛋白質(zhì)、多糖、脂類、 核酸及肽類等雜質(zhì)。雜質(zhì)除去的方法有：A. 核酸沉淀法該法可用核酸沉淀劑和氯化徭、硫酸魚精蛋白或鏈監(jiān)素等。必要時(shí)也可用 脫氧核糖核酸酶除去核酸。 即在粗勻漿中加入少量 DNase,于 4C 保溫 3060min,可使

22、DNA 降解為足夠小的碎片，以致不影響以后的純化。B. 醋酸鉛沉淀法利用醋酸鉛沉淀劑除去雜蛋白。 因這些沉淀劑也常常使需要的酶 （或蛋白質(zhì)）緩緩變性而失去活性，所以用這類試劑時(shí)應(yīng)迅速進(jìn)行鹽析，使樣品與這類試劑 脫離接觸。C. 調(diào) pH值或加熱沉淀法利用蛋白質(zhì)酸堿變性性質(zhì)的差異除去雜蛋白。利用蛋白質(zhì)的熱變性的溫度 系數(shù)差異，可在一泄的 PH下將蛋白提取液加熱到一泄的溫度，使對(duì)熱不穩(wěn)左的 雜蛋白性沉淀而除去。D. 選擇性變性法利用各種蛋白質(zhì)穩(wěn)左性的不同，可用選擇性變性法來除去雜蛋白。例如胰 蛋白爾及細(xì)胞色素 C等少數(shù)特別穩(wěn)左的酶，甚至可用 2.旅三氯醋酸處理，此時(shí) 其它雜蛋白均變性而沉淀，而胰蛋白

23、酶和細(xì)胞色素 C則仍留在溶液中。E. 透析法小分子物質(zhì)常在整個(gè)制備過程中多次液相與固相互轉(zhuǎn)化中被分離，或最后 用透析法除去。F. 利用溶解度不同的純化方法2.鹽析法鹽析法對(duì)于許多非電解質(zhì)的分離純化均適合。對(duì)蛋白質(zhì)和酶的提純應(yīng)用也 最早。至今還廣泛使用，一般粗抽提物經(jīng)常利用鹽析法進(jìn)行粗分。也有反復(fù)用 鹽析法得到純的蛋白質(zhì)的例子。英原理是蛋白質(zhì)在低鹽濃度下的溶解度隨鹽液 濃度升高而增加（鹽溶，與離子強(qiáng)度 101 間成比例增加）。球蛋白當(dāng)鹽濃度不 斷上升時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度又以不同程度下降并先后析出（鹽析）（離子強(qiáng)度 I210）。這是由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的電荷的極性基團(tuán)有靜電引力。當(dāng)水 中加入少量

24、鹽時(shí)，鹽離子與水分子對(duì)蛋白質(zhì)分子一的極性基團(tuán)的影響，使蛋白 質(zhì)在水中溶解度增大。但鹽濃度增加一泄程度時(shí)，水的活度降低，蛋白質(zhì)表而 的電荷大量被中和，水化膜被破壞，于是蛋白質(zhì)相互聚集而沉淀析出。鹽析法 是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在一左濃度鹽溶液中溶解度降低程度不同達(dá)到彼此分離的方 法。6樓 鹽的選擇如上所述，蛋白質(zhì)在水中溶解度取決于蛋白質(zhì)分子上離子基團(tuán)周用的水分 子數(shù)目，即取決于蛋白質(zhì)的水合程度。因此，控制水合程度，也就是控制蛋白 質(zhì)的溶解度?？刂品椒ㄗ畛Ｓ玫氖羌尤胫行喳}。主要有硫酸彼、硫酸鎂、硫酸 鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。苴中應(yīng)用最廣的是硫酸彼，它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而 溶解度大（25C時(shí)飽滿和溶解度為 4

25、.Imol,即 767g/l;0C 時(shí)飽滿和溶解度為 3.9 mol,即 676g/l） o 在這一溶解度范囤內(nèi)，許多蛋白質(zhì)均可鹽析岀來，且硫酸錢價(jià) 廉易得，分段效果較其它鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。應(yīng)用硫酸彼時(shí)對(duì)蛋白氮 的測(cè)泄有干擾，另外緩沖能力較差，故有時(shí)也應(yīng)用硫酸鈉，如鹽析免疫球蛋白， 用硫酸鈉的效果也不錯(cuò)，硫酸鈉的缺點(diǎn)是 30C 以下溶解度太低。其它的中性鹽 如磷酸鈉的鹽析作用比硫酸彼好，但也由于溶解度太低，受溫度影響大，故應(yīng) 用不廣。氯化鈉的溶解度不如硫酸彼，但在不同溫度下它的溶解度變化不大，這是方便之處。 它也是便宜不易純化的試劑。硫酸鞍濃溶液的 PH常在 4. 55. 5 之間，市

26、售的硫酸彼還常含有少量游離硫 酸,PH值往往降至 4. 5以下，當(dāng)用英他 PH值進(jìn)行鹽析時(shí)，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié).確定沉淀蛋白質(zhì)所需硫酸彼濃度的方法將少量樣品冷卻到 05C,然后攪拌加入固體硫酸錢粉末，見蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉 淀時(shí)，禽心除去沉淀，分析上淸液確立所要蛋白質(zhì)的濃度，如它仍在溶液中則 棄去沉淀，再加更多的硫酸彼于上淸液中，直到產(chǎn)生蛋白質(zhì)沉淀時(shí)止。以所要 提取的蛋白質(zhì)在溶液中的濃度對(duì)硫酸錢濃度作圖，得沉淀曲線，找出蛋白質(zhì)開 始沉淀的濃度。如不考慮收率， 飽和度區(qū)間可取得窄一些， 使純度高一些。鹽析時(shí)注意的幾個(gè)問題：(1) 鹽的飽和度：不同蛋白質(zhì)鹽析時(shí)要求鹽的飽和度不同。分離幾個(gè)混合組成 的蛋白質(zhì)

27、時(shí)，鹽的飽和度常由稀到濃漸次增加。每出現(xiàn)一種蛋白質(zhì)沉淀進(jìn)行離 心或過濾分離后，再繼續(xù)增加鹽的飽和度，使第 2種蛋白質(zhì)沉淀。例如用硫酸鞍 鹽析分離血漿中的蛋白質(zhì)飽和度達(dá) 20 弔時(shí)，纖維蛋白原首先析岀：飽和增至 28 33%時(shí)，優(yōu)球蛋白析出；飽和度再增至 3350%時(shí)，擬球蛋白析出：飽和度大于 50%以上時(shí)淸蛋白析出。用硫酸彼不同飽和度分段鹽析法，可從牛胰酸性提取液 中分離得到 9 種以上蛋白質(zhì)及酶。(2) PH值：pH值在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)溶解度最小易沉淀析岀。因此鹽析時(shí)除個(gè) 別特殊情況外，pH 值常選擇在被分離的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近。由于硫酸披有弱酸 性，它的飽和溶液的 pH值低于 7,如所要蛋白質(zhì)

28、遇酸易變性則應(yīng)在適當(dāng)緩沖液 中進(jìn)行。(3) 蛋白質(zhì)濃度：在相同鹽析條件下蛋白質(zhì)濃度愈髙愈易沉淀。使用鹽的飽和 度的極限也愈低。如血淸球蛋白的濃度從 0.5%增至 3.0 弔時(shí),需用中性鹽的飽和度 的最低極限從 29%遞減至 24%.某一蛋白質(zhì)欲進(jìn)行兩次鹽析時(shí)，第 1 次由于濃度較 稀，鹽析分段范國較寬，第 2次則逐漸變窄.例如膽堿酯酶用硫酸彼鹽析進(jìn)時(shí)，第 1 次硫酸讓飽和度為 35%至 60%,第 2 次為 40%至 60$.蛋白質(zhì)濃度髙些雖然對(duì)沉淀有 利，但濃度過高也易引起雜蛋白的共沉作用.因此，必須選擇適當(dāng)濃度盡可能避 免共沉作用的干擾。(4) 溫度： 由于濃鹽液對(duì)蛋白質(zhì)有一泄保護(hù)作用，鹽

29、析操作一般可在室溫下進(jìn) 行。至于某些對(duì)熱特別敏感的酶，則宜維持低溫條件。通常蛋白質(zhì)鹽析時(shí)對(duì)溫 度要求不太嚴(yán)格。但在中性鹽中結(jié)晶純化時(shí)，溫度影響則比較明顯。(5) 脫鹽： 蛋白質(zhì)用鹽析法分離沉淀后，常需脫鹽才能獲得純品。脫鹽方法最 常用的是透析法。透析法所需時(shí)間較長(zhǎng)，常在低溫下進(jìn)行并加入防腐劑避免微 生物污染。透析使用前必須處理，方法是將透析袋巻于 0. 5mol/LEDTA 溶液中煮 0. 5h,棄去溶液,用蒸霜水洗凈，置 50%甘油中保存?zhèn)溆?。也可用分子篩層析， 常用 SephadexG-25柱層析法， 上樣不要超過床體積的 20%。此外，有些金屬離子能和蛋白質(zhì)形成較為專一的結(jié)合而使蛋白質(zhì)沉

30、淀。這 雖不是典型的鹽析，但在制備蛋白質(zhì)中有許多成功的例子。鋅離子在特左 pH下 與胰島素結(jié)合形成沉淀就是這種例子。7樓 蛋白質(zhì)從懸浮液中沉淀出來的速度極慢，必須用強(qiáng)力離心來促進(jìn)這個(gè)過程。3.有機(jī)溶劑分離純化法有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力, 導(dǎo)致溶解度降低。有機(jī)溶劑與水作用能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，使蛋白質(zhì)在一定 濃度的有機(jī)溶劑中沉淀析出。常用的有機(jī)溶劑是乙醇和丙酮，由于有機(jī)溶劑的 加入易引起變性失活，尤其乙醇和水混合釋放熱呈:，操作一般宜在低溫下進(jìn)行, 且在加入有機(jī)溶劑時(shí)注意攪拌均勻以免局部濃度過大。用此法所析出的沉淀一 般比鹽析法易過濾或離心沉降。分離后的蛋

31、白質(zhì)沉淀應(yīng)立即用水或緩沖液溶解, 以降低有機(jī)溶劑的濃度。操作時(shí)的 pH值大多數(shù)控制在待沉淀蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附 近。有機(jī)溶劑在中性鹽存在時(shí)能增加蛋白質(zhì)的溶解度，減少變性和提高分離的 效果。一般在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)添加中性鹽的濃度在 0. 05mol 左右,過多不僅耗費(fèi) 有機(jī)溶劑，而且可能導(dǎo)致沉淀不好沉淀的條件一經(jīng)確定，就必須嚴(yán)格控制，才能 得到重復(fù)性結(jié)果有機(jī)溶劑濃度通常以有機(jī)溶劑和水容積比或用百分濃度素示. 故操作條件比鹽析法嚴(yán)格。許多有機(jī)溶劑，如碳鏈較長(zhǎng)的醇，它溶于水，但有限度。英量大到一左程 度后則分成兩相，一相以水為主，一相以有機(jī)溶劑為主。某些第 3組分的存在可 以改變兩相的比例和組成。有許多蛋白

32、質(zhì)在兩相中均能溶解，形成分配。在同 一個(gè)兩相的溶劑系統(tǒng)中，不同的蛋白質(zhì)有不同的分配系數(shù)。根據(jù)這一原理，操 作全部機(jī)械化的有逆流分溶。 因要求實(shí)驗(yàn)室溫度恒眾且操作也繁雜， 雖一直有 人在用但很不普遍。分配層析也是應(yīng)用這一原理，但在分離純化蛋白質(zhì)工作中 用得不多，主要是因?yàn)槎鄶?shù)蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中，特別是在易與水分相的溶劑 中溶解度小且易變性。4.疏水層析： 是近年發(fā)展的新方法。 它利用蛋白質(zhì)表面有一部分疏水性，與帶有疏水性的載體在髙鹽濃度時(shí)結(jié)合。洗脫時(shí)將鹽濃度逐漸降低，蛋白質(zhì)因 疏水性不同而逐個(gè)地先后被洗脫而純化。此法能分離英它一些方法不易純化的 蛋白質(zhì)。利用分子形狀和大小不同的分離方法蛋白質(zhì)形狀

33、有細(xì)長(zhǎng)的如纖維，有密實(shí)的如圓球，形狀很不相同。蛋白質(zhì)的 分子量從 6000左右開始，有各種大小，大的可以大到幾百萬。利用這些差別， 有幾種方法可用來分離蛋白質(zhì)。5.凝膠層析屬最常用的蛋白質(zhì)分離方法。系混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)裝有凝膠作為固左相 的層析柱時(shí)，混合物中各物質(zhì)因分子大小不同而被分離的技術(shù)。所指凝膠從廣 義上說是一類具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，如天然物質(zhì)中的馬鈴萼淀粉 及瓊脂糖凝膠，人工合成品的匍聚糖凝膠及帶離子交換基團(tuán)的葡聚糖凝膠等。 把適當(dāng)?shù)哪z顆粒裝填到玻璃管中制成層析柱，于柱內(nèi)加入欲分離的混合物， 然后用大量蒸鐳水或其它稀溶液洗柱，由于混合物中各物質(zhì)的分子大小和形狀 不同，在洗柱

34、過程中，分子量最大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間的 空隙最先流出柱外。分子量最小的物質(zhì)因能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而受阻滯，流速緩慢, 致使最后流出柱外。整個(gè)過程和過濾相似，故又名凝膠過濾、凝膠滲透過濾、 分子篩過濾等。由于物質(zhì)在分離過程中的阻滯減速現(xiàn)象，有人也稱之為阻滯擴(kuò) 散層析、排阻層析等。凝膠過濾是分子篩的一種，在介紹凝膠過濾法之前，首先介紹分子篩的由 來。McBain(1928)提岀了分子篩的概念。后來發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象在許多地方都存在。 Synge與 Tiselins (1950)在解釋凝膠層中的電泳和電滲現(xiàn)象時(shí)引用了分子篩 的概念。此后發(fā)現(xiàn)在柱層析中也有這種現(xiàn)象，于是許多工作者嘗試了一系列適

35、用于生物高分子分離純化用的分子篩。至 1959年 Porath與 Flodim 找到部分水 解的葡聚糖凝膠將其交聯(lián)，得到了商品爼為交聯(lián)匍聚糖(Sephadex)的分子篩。 該分子篩具有許多良好的性能，在蛋白質(zhì)的分離分析中已被廣泛采用。Lathe -與 Ruthven(1956)曾利用分子篩效應(yīng)測(cè)定過分子大小與分子量。Flo din與 Granath (1961)發(fā)現(xiàn)不同分子量的匍聚糖級(jí)分，其凝膠過濾行為與分子 量大小有關(guān)。Andrew (1962)發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)中也有類似的性質(zhì).此后經(jīng)過不少人的 實(shí)際應(yīng)用，完善了這一方法，形成一個(gè)可靠的測(cè)定髙分子分子量的方法。8 樓凝膠層析是 60年代初發(fā)展起來的

36、一種快速而又簡(jiǎn)便的分離技術(shù)。由于設(shè)備 簡(jiǎn)單、操作方便和不需要有機(jī)溶劑，以及對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分離效果，所 以目前它已被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)及醫(yī)藥學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛應(yīng) 用。A. PH 值與沉淀蛋白質(zhì)或酶原理相同，結(jié)晶的溶液 PH值一般選擇在被結(jié)晶的蛋白質(zhì) 或酶的等電點(diǎn)附近，以利于晶體的析出。B. 溫度除少數(shù)情況外，通常選擇低溫條件進(jìn)行。低溫條件對(duì)蛋白質(zhì)和酶不僅溶解 度低且不易變性。在中性鹽溶液中結(jié)晶時(shí)，溫度可在 oc至室溫范國內(nèi)選擇，在 有機(jī)溶劑中結(jié)晶一般要求溫度較低。C. 晶種不易結(jié)晶蛋白質(zhì)和酶如糜蛋白酶，往往加入微量的糜蛋白酶結(jié)晶可導(dǎo)致大 量結(jié)晶的形成。有時(shí)用玻璃輕輕摩擦容器壁也

37、可達(dá)到此目的。需加晶種才能形 成結(jié)晶的蛋白質(zhì)或酶，大多數(shù)結(jié)晶收率都不高。D. 金屬離子有些蛋白質(zhì)和酶結(jié)晶時(shí)還需加入金屬離子，如鐵蛋白在硫酸彼溶液中結(jié)晶 時(shí)，加入少量鎘離子才形成菱狀結(jié)晶，烯醇化酶也常加入汞鹽后形成結(jié)晶。E. 結(jié)晶時(shí)間在結(jié)晶條件比較適合的情況下，在幾小時(shí)甚至幾分爼即可獲得結(jié)晶。但有 些情況需數(shù)天甚至數(shù)月才能結(jié)晶完全，視齊種蛋白質(zhì)和酶的具體情況不同而龍。 蛋白質(zhì)和酶的結(jié)晶大多數(shù)是針狀、棒狀、片狀，有的為八而體或立方體的菱狀 結(jié)晶。結(jié)晶的大小與結(jié)晶時(shí)間及條件有關(guān)。6.蛋白質(zhì)的干燥干燥是將潮濕的固體、半固體或濃縮液中的水分(或溶劑)蒸發(fā)除去的過 程。根據(jù)水分在固體中分布情況可分為表而水

38、分、 毛細(xì)管水分和被膜所包國的 水分 3種。表而水分附著于固體表而，蒸發(fā)時(shí)完全址露于外界空氣中，干燥最快、 最均勻。毛細(xì)管水分存在于固體極細(xì)孔隙的毛細(xì)管中，水分子逸出比較困難， 蒸發(fā)時(shí)慢并需較髙溫度。膜包 I刑的水分如細(xì)胞中被細(xì)胞質(zhì)膜所包附的水分，需 經(jīng)緩慢擴(kuò)散至膜外才能蒸發(fā)最難除去。被干燥的物質(zhì)貝濕度與周圍空氣的濕度 是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系，暴壺于大氣中的物質(zhì)是不會(huì)絕對(duì)干燥的。若使被干燥的 物質(zhì)所含水分低于周羽空氣中水分，則必須放在嚴(yán)密封蓋的容器中進(jìn)行干燥。 用這種方法可得到含水雖極低的干燥樣品，生物大分子制備得到所需的產(chǎn)品后, 為了防止變質(zhì)易于保存和運(yùn)輸，常需要干燥處理，最常用的方法是冷凍干燥

39、和 真空燥，某些無活性核酸、微生物酶制劑和酪蛋白等工業(yè)產(chǎn)品則較多地應(yīng)用 噴霧干燥、氣流干燥等直接干燥法。(1) 真空干燥在相同溫度下，被干燥物質(zhì)所含水分或溶劑由于周用空氣壓力的降低蒸發(fā) 速度增加。真空度愈高，溶劑沸點(diǎn)愈低，蒸發(fā)愈快。英原理與真空濃縮(或稱 減壓濃縮)相同。真空干燥適用于不耐髙溫、易氧化物質(zhì)的 F 燥和保存，整個(gè) 裝置包括下燥器、冷凝器、及貞空泵 3 部分。干燥器頂部連接一帶活塞的管道接 通冷凝器，氣化后的蒸氣由此管道通過冷凝管凝聚，冷凝器另一端連接真空泵, 干燥器內(nèi)常放一些干燥劑如五氧化二磷、無水氯化鈣等，以便干燥保存樣品。(2) 冷凍真空干燥冷凍真空干燥除利用真空干燥原理外，

40、同時(shí)增加了溫度因素。在相同的壓 力下，水蒸氣壓隨溫度的下降而下降。在低溫下低壓下冰很容易升華為氣體。 操作時(shí)通常將等干燥的液體冷凍到冰點(diǎn)以下使之變成固體，然后在低溫低壓下 將溶劑變成氣體而除去。干燥后的產(chǎn)品具有疏松、溶解度好、保持天然結(jié)構(gòu)等 優(yōu)點(diǎn)，適用于務(wù)類生物大分子的干燥保存。樣品干燥時(shí)先在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪成薄層(厚度不超過 lcm的液體)，置于低溫冰箱內(nèi)凍固。另在真空干燥器內(nèi)用兩個(gè)培養(yǎng)皿分別放置固體氫氧化鈉和五氧化二磷，貞 空干燥上端抽氣通過五氧化二磷干燥管與真空泵相連。當(dāng)放進(jìn)等待干燥的凍塊后，立即封閉干燥器，開動(dòng)真空泵，纟 1：510h 后得冷凍干燥品。也可將待干燥物質(zhì)置于圓底容器中，然后浸入

41、干冰-乙醇混合而成的冷卻劑中，容器內(nèi)液體迅速凍成固體，抽真空后等干燥凍塊的水分子升華變成氣體，經(jīng)過冷凝器凝結(jié)為霜。冰凍的樣品逐漸失去水分變成疏松的干燥粉末。上述操作關(guān)鍵在于真空泵的髙真空度及管道的口徑要合適。9 樓(3)噴霧干燥噴霧干燥是將液體通過噴灑裝置噴成霧滴后，與干燥介質(zhì)(通常為熱空氣) 直接接觸干燥的方法。由于液體分散為霧滴時(shí)，直徑通常只有 1200 um大小, 與熱空氣接觸而大， 水分蒸發(fā)很快。 在 100C的熱空氣中只需不到 1 秒的時(shí)間即 可干燥。因 T燥時(shí)間短和水分蒸發(fā)時(shí)吸收熱疑，使液滴及其附近的空氣溫度較 低，故工業(yè)上常用。7.樣品貯藏保存保存方法和生物大分子穩(wěn)泄性有很大關(guān)系，生物大分子的貯藏保存可分為 干態(tài)和液態(tài)貯藏兩種。但不論是干態(tài)或液態(tài)貯藏均應(yīng)避免長(zhǎng)期眾壺于空氣中防 止微生物的污染。溫度對(duì)生物大分子的穩(wěn)左性影響很大，低溫保存在大多數(shù)情 況下是有利的。(1) 干態(tài)貯藏干燥的制品一般比較穩(wěn)定，如制品含水量很低，要低溫情況下物質(zhì)大分子 活性可在數(shù)月甚至數(shù)年無顯著變化。貯藏方法也很簡(jiǎn)單，只將干燥后的樣品置 于干燥容器內(nèi)(內(nèi)裝有干燥劑)密封，保存于 04C 冰箱中即可。有時(shí)為了取 樣方便和避免取樣時(shí)樣品吸水和污染，可先將樣品分裝于許多小瓶中，每次用 時(shí)只取岀 1 瓶。(2) 液態(tài)貯藏液態(tài)貯藏的優(yōu)點(diǎn)是使樣品免去干燥這一步驟，生物大分