質(zhì)粒大抽步驟強化版精

1、取100ml (根據(jù)培養(yǎng)菌體的濃度選擇合適的量，低拷貝推薦用200ml過夜培養(yǎng)的 菌液加入離心管，室溫8, 000rpm (8.228*g離心3min收集細菌,儘量吸除上清。注意:菌液較多時可以通過幾次離心將菌體沉澱收集到一個離心管中 ，菌液量以 能夠充分裂解為佳，菌液過多會導致裂解不充分從而降低質(zhì)粒的提取效率。 儘量吸 除上清，為確保上清液全部吸取，請用乾淨的吸水紙吸去瓶壁上的水滴。stepc 1加鷄洗脫液TB打開水浴鍋，將溫度設(shè)置為65 C ,放入洗脫液TB進行水浴加熱茶隔P01加熱洗脫液向留有菌體沉澱的離心管中加入 8ml溶液P1請先檢查是否已加入RNaseA加入RNaseA後的P1溶液

2、須放入4C冰箱保存，使用移液器或渦旋振盪器徹底懸浮細菌細胞沉澱和純度偏低。對於低拷貝質(zhì)粒，加大菌體用量的同時按比例增加 P1、P2、P4 的用量。觀察細菌是否徹底懸浮，可將離心管橫放，看是否有塊狀沉澱。P1的成分:50mMol/L 葡萄糖 +25mMol/L Tris-CI(PH8.0+ 10mMol/L EDTA(PH8.0(絡(luò)合劑。如果菌泥是-20E冰凍保存的,此時混勻較困難，提前加P1放置20min，恢復至室 溫，方便混勻或者用1ml移液槍槍頭從管壁上刮下來；或者37C水浴加熱。混勻的時候，使收集管傾斜，內(nèi)部的液體會上下滾動，加速混勻，且不容易起泡沫用大槍頭stepoa加入溶液P2向離心

3、管中加入8ml溶液P2立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，室溫放置5min。DNA。此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，如果未變得清亮，可能由於菌體過多，裂解不 徹底，應(yīng)減少菌體量。P2的成分：0.2N NaOH+1% （m/VSDSstepoa加入溶液P2向吸附柱CP6中（吸附柱放入50ml收集管中 加入2.5ml的平衡液BL , 8, OOOrpm離心2min ,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（用平衡液處理過的柱子最好立即使用；實驗前使用平衡液BL處理吸附柱，可以 最大限度stepoa加入溶液P2啟動矽基質(zhì)膜，提高效率。05.1向離心管中加入8ml溶液P4立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，

4、至溶 液出現(xiàn)白色分散絮狀沉澱。05.2用大槍頭將絮狀沉澱輕柔地貼壁切碎，直至原先整體的白色絮狀沉澱皆成 為豆腐渣狀。（使得城裂解的效果更加充分，獲取的上清更多；離心後沉澱貼壁更牢， 也方便離心後的過濾，沉澱不會堵塞篩檢程式05.3-0室溫放置10min。05.3-1可以考慮利用10mi n間隙，配好核酸電泳的凝膠。05.412,000rpm轉(zhuǎn)速增大使得沉澱貼壁更牢 離心10min，使白色沉澱離心至管 壁。05.5將全部溶液小心倒入過濾器 CS1中（,避免倒入大量沉澱而阻塞篩檢程式, 慢慢推動推柄過濾，濾液收集在乾淨的50ml的管中（自備，使用滅菌後的50ml離心 管,既節(jié)省白色收集管還可方便計

5、算上清體積 。P4後應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉澱。如果離心後倒入篩檢程式CS1中的溶液有白色沉澱也不會影響過濾。如果菌體過多（100ml ,推薦延長離心時間至20- 30min。P4的成分:5mol/L乙酸鉀+冰乙酸+H2O06.1向濾液中加入0.3倍濾液體積的異丙醇（加入異丙醇過多容易導致 RNA污染，上下顛倒混勻後靜置2min，再轉(zhuǎn)移到活化好的吸附柱 CP6中開始過柱。-OH的親水作用和水結(jié)合,這種親水結(jié)合作用的能力 比DNA及RNA鏈中的親 水基團的結(jié)合能力更強，因此原先跟水結(jié)合的DNA及RNA就相當於被釋放出來， 等同於沉澱。但是相較RNA , DNA鏈中的親水基團結(jié)合水的能力更弱，因

6、此加入 異丙醇後,首先被 析出沉澱”的是DNA鏈當此時異丙醇加入過多，那麼RNA鏈也隨之析出，從而導致了 RNA的污染，影響品質(zhì)。0.3倍體積要嚴格遵 循，因50ml離心管刻度精度不夠，因此在估計時要寧可稍微 少些而勿多?？上葘⒚抗芩?加入的異丙醇的體積算好標在離心管上。06.2室溫8,000rpm離心2min ,將收集管中的液體再次倒回吸附柱內(nèi)再次離心2min以增加吸附率；第二遍離心後倒掉收集管中的廢液再倒入剩餘的已加過異 丙醇 的濾液，再次過柱兩遍。最終棄掉收集管中的廢液後將吸附柱 CP6重新放回收集管 中。CP6的最大容積只有15ml，而之前所加液體的體積為24ml，所以需要分2次過柱

7、;為了增大吸附質(zhì)粒的效率，每次過柱之後需要再重新過一遍07.1向吸附柱CP6中加入10ml漂洗液PW （請先檢查是否已加入無水乙醇8,000rpm離心2min，棄掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。07.2重複操作步驟07.108.1向吸附柱CP6中加入3ml無水乙醇,室溫8,000rpm離心2min，倒掉廢 液。08.2將吸附柱CP6重新放回收集管中,9,000rpm離心5min，目的是將吸附柱 中殘餘的漂洗液去除。08.3將離心後的吸附柱CP6轉(zhuǎn)移到新的收集管中，開蓋晾乾約5mi n，使得其內(nèi)殘留的乙醇充分會發(fā)乾淨。PCR等實驗。為確保下游實驗 不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱CP

8、6開蓋, 置於室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾乾吸附材料中殘餘的漂洗液。stepos一加入洗脫液收集賛粒09.1將吸附柱CP6置於一個乾淨的收集管中,向吸附膜的中間部位懸空加1.2ml洗脫緩衝液TB，室溫放置5min撚後室溫8,000rpm離心2min。09.2第一次離心後再將收集管中的液體倒回吸附柱內(nèi)靜置2min ,室溫12,000rpm 離心 2min 。09.3將收集管中的洗脫液全部移入一個乾淨的1.5ml的EP管，長期保存應(yīng)置於-20E冰箱，以防止DNA降解。注意:為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重複步 驟13.洗脫液的PH值對於洗脫液有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證

9、其PH值在7.5-8.0範圍內(nèi)，PH值低於7.0會降低洗脫效率。洗脫緩衝液用量的多少主要是依1ml，體積據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)以及實驗所需要的濃度來確定。洗脫緩衝液體積不少於 過小影響回收效率?？蛇x步驟（如果需要更高濃度的質(zhì)粒，可進行如下操作：每1ml洗脫液加入1.42ml異丙醇以及0.42ml 5M NaCI（客戶自備，混勻，室溫放 置 5min , 8,000rpm （8,228*g離心 10min ,小心棄上清。加入0.5ml的70%乙醇洗滌沉澱，室溫8,000rpm （8,228*g離心5min ,小心棄乙 醇。重複步驟15.空氣中乾燥沉澱約5-10min,根據(jù)需要用適當體積的TB緩衝液溶解沉

10、澱。產(chǎn) 品簡介本試劑盒採用獨特的矽膠模吸附技術(shù)，高效專一地結(jié)合質(zhì)粒DNA。同時採用特殊的溶液P4和篩檢程式CS1，可有效的去除內(nèi)黴素、蛋白等雜質(zhì)；整個提取 過程僅需1h，方便快捷。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒 DNA可適用於各種常規(guī)操 作，包括酶切、PCR、測序、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染多種細胞等實驗。推薦每次菌液使用量：高拷貝使用量為100ml，得率一般在5001500卩乳右；低拷貝質(zhì)粒推薦使用 量為200ml，得率一般在200600卩乳右；低拷貝質(zhì)粒推薦使用量為200ml，得率 一般在200600卩g左右.注意事項：請務(wù)必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項。 溶液P1在使用前先加入RNase A （將試劑盒中提

11、供的RNase A全部加入），混 勻，置於2-8E保存。第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標籤的說明現(xiàn)在漂洗液PW中加入無水乙醇。使用前先檢查平衡液BL、溶液P2和P4是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉澱，如 有結(jié)晶或者 沉澱現(xiàn)象，可在37C水浴中加熱幾分鐘，即可恢復澄清。注意不要直接接觸溶液P2和P4,使用後應(yīng)立即蓋緊蓋子。使用篩檢程式時請將推柄小心緩 慢地從過濾管中抽出，避免濾膜因壓力而鬆動。提取的質(zhì)粒量與細菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)粒拷貝數(shù)等因素有關(guān)。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼箪?0kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，同時按比例增加 P1、P2、P4的用量；洗脫緩衝液推薦在 6570C 水浴中預熱?？蛇m當延長吸附和洗脫時間，以提高提取效率。實驗前使用平衡液BL處理吸附柱，可以最大限度啟動矽基質(zhì)膜，提高