黃色須腹菌液體菌劑保存溫度及活性研究

1、黃色須腹菌液體菌絲菌劑保存溫度及活性研究馬仕波，葉建仁收稿日期：2013-06-23 修回日期：基金項(xiàng)目：國家林業(yè)局林業(yè)行業(yè)公益性項(xiàng)目No.201004061；國家“十二五”科技支撐項(xiàng)目(2012BAD19B0703)作者簡介：馬仕波 (1988-)，男，碩士。*通訊作者（Corresponding Author）：葉建仁，男，教授，博士生導(dǎo)師。(南京林業(yè)大學(xué) 森林資源與環(huán)境學(xué)院， 江蘇 南京210037)摘要：選擇有代表性的胞外酶進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)TTC脫氫酶與菌絲活力呈現(xiàn)出極顯著的正相關(guān)，說明TTC脫氫酶酶活值的大小可以反映菌絲菌劑活力的高低。4時(shí)菌絲的絮狀形態(tài)和活性能較好的保存下來，有利于液

2、體菌絲菌劑的田間應(yīng)用。所以液體菌絲菌劑的保存溫度以4為宜。關(guān)鍵詞：黃色須腹菌，保存溫度，菌絲活性中圖分類號(hào)：S718.81 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：AStudy on storage temperature and mycelium activity of Rhizopogon luteous liquid mycelium agentsMA Shi-bo, YE Jian-ren*(College of Forest Resources and Environment Nanjing Forestry University, Nanjing 210037)Abstract：It measured thr

3、ee typical extracellular enzyme activity. TTC dehydrogenase was significantly related to hyphal activity at 0.01 level. The TTC dehydrogenase activity could better reflect the dynamic strength of the fertilizer should be used as inocula vitality flag. In 4, the floc form of mycelium could be preserv

4、ed, which was conducive to liquid mycelium agents direct application in the field. So, it should be appropriate to save liquid mycelium agents in 4.Key words：Rhizopogon luteous；Storage temperature；Enzyme activity液體菌劑的活性指標(biāo)是外生菌根菌菌劑的保存效果的重要體現(xiàn)，目前用于檢測外生菌根真菌菌劑的活性指標(biāo)研究還鮮有報(bào)道 Rossi M J, Souza J A R, Oliveira

5、V L. Inoculum production of the ectomycorrhizal fungus Pisolithus microcarpusin an airlift bioreactor. Applied Microbiology and Biotechnology . 2002:175-181。黃色須腹菌菌絲發(fā)酵液能產(chǎn)生胞外酶，而且方便測定，本實(shí)驗(yàn)研究保存過程中的三種典型胞外酶活性，確定菌絲體活性的指標(biāo)，為黃色須腹菌液體菌絲菌劑的菌絲活性檢測提供理論依據(jù) Luciana da Silva Rodrigues, Maria Catarina Megumi Kasuya, Arn

6、aldo Chaer Borges. Viability of ectomycorrhizal fungus mycelium entrapped in calcium alginate gelJ ,1999:2326-2329 。同時(shí)研究菌絲的保存溫度條件，以確定黃色須腹菌液體菌絲菌劑的最佳保存溫度。1材料與方法1.1材料1.1.1實(shí)驗(yàn)材料發(fā)酵罐發(fā)酵所得的黃色須腹菌菌絲體。1.1.2試劑葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、維生素B1、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸、聚乙烯醇、聚乙二醇、瓊脂、馬鈴薯、有機(jī)硅消泡劑、對(duì)硝基磷酸鈉、對(duì)硝基酚、鄰苯二酚、濃硫酸、乙酸乙酯、TTC、連二亞硫酸鈉。1.1.3儀器搖床、恒溫

7、培養(yǎng)箱、電子分析天平、pH計(jì)、超凈工作臺(tái)、立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋、粉碎機(jī)、恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱、上海國強(qiáng)自動(dòng)攪拌新概念高級(jí)液體發(fā)酵罐。1.2試驗(yàn)方法1.2.1酸性磷酸酶的測定取發(fā)酵液菌絲若干，用濾紙吸干發(fā)酵液，稱取1g菌絲樣品，用5mL研磨緩沖液在研缽中冰浴研磨成漿，再用5mL研磨緩沖液沖洗，轉(zhuǎn)移至離心管中，在20000rpm下離心10min。吸出上清液，即為酶粗提取液。放在冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｈ∶敢?.5mL，加水至1mL，然后加入緩沖液1mL和對(duì)硝基酚磷酸鈉溶液0.1mL。空白對(duì)照用1mL研磨緩沖液代替酶制劑。充分混勻后，放在30恒溫箱中保溫10min，不時(shí)搖動(dòng)。10min后，加入1mL0.5mo

8、lNaOH溶液，充分混合，終止反應(yīng)，并使對(duì)硝基酚呈黃色。在400nm波長下測吸光度A。以每毫克種子每分鐘水解底物的nmol數(shù)表示。 式中0.019為pH=14時(shí)，對(duì)硝基酚的mol吸光系數(shù)，即對(duì)硝基酚的濃度為1mol/L時(shí)的吸光度；3.1為0.0031×1000，反應(yīng)混合液的體積為3.1，將mol化為nmol乘上1000；V為酶制劑總體積；V1為每次用酶體積。1.2.2多酚氧化酶的測定0.1 mol/L 鄰苯二酚 2ml，加入 0.05mol/L pH6.0 的磷酸緩沖液 2ml，再加 0.5ml 酶液，28保溫 30min，測 400 nm 波長處的 OD 值。定義每分鐘引起 0.0

9、1個(gè)吸光度的增加所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。1.2.3 TTC脫氫酶的測定取發(fā)酵液菌絲若干，用濾紙吸干發(fā)酵液，稱取2g菌絲于研缽中，加入6mL 0.5%TTC，在35下保溫2h，后加2滴濃硫酸阻止反應(yīng)，取出菌絲，用濾紙吸干TTC溶液，放入研缽中，加入4 mL乙酸乙酯，充分研磨菌絲。用移液槍吸出紅色液體，并用乙酸乙酯洗菌絲到無紅色液體出現(xiàn)，將洗滌液一并移到 25mL 刻度中，并定容至 15mL，以乙酸乙酯為參比，在 485nm 下測其吸光值。定義每克干物每小時(shí)引起 0.01 個(gè)吸光度的變化所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：在小燒杯中加入0.4ml pH為7.5 的 0.5%

10、TTC 溶液，20ml 的乙酸乙酯和少量還原劑連二亞硫酸鈉，然后混合搖動(dòng)使生成紅色的 TF，用移液槍分別吸取紅色溶液 0.25、0.5、1.0、1.5 和 2.0ml，加入乙酸乙酯定容至 5ml，在 485nm 處測相應(yīng)的光密度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。TTC脫氫酶活性的定義：一定量的鮮菌絲，在一定溫度和 pH 下，與 TTC 溶液反應(yīng)單位時(shí)間內(nèi)還原所生成的 TF 量(1U=1gTF/h/m)。1.2.4菌絲活力測定將不同保存時(shí)間的菌絲菌劑接種到PDA固體平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)120h后用十字交叉法測定菌絲生長的直徑，計(jì)算菌絲日均生長速率。1.2.5溫度對(duì)菌絲菌劑保存的影響設(shè)定-20、4、25三個(gè)溫度梯度的

11、保存條件，每隔20d對(duì)保存的樣品進(jìn)行取樣無菌操作接入PDA固體平板上，測定菌絲活力。2結(jié)果與分析2.1保存過程中酸性磷酸酶酶活變化酸性磷酸酶(acid phosphatase，AcPase)是溶酶體特有的酶 曹慧娟.植物學(xué)(第二版)M.北京:中國林業(yè)出版社,1989:31，酸性磷酸酶在菌根真菌菌絲侵染林木形成菌根的過程中發(fā)揮重要作用 金輝,許忠祥,陳暉等. 虎頭蘭菌根中酸性磷酸酶的定位及活性變化J. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2007(04):156-160，酸性磷酸酶是一種真菌比較常見的胞外酶 宋勇春,李曉林,馮固等. 菌根際及菌絲酸性磷酸酶活性的簡易測試J. 科學(xué)通報(bào). 2000(02):187

12、-191 ，不同保存時(shí)間下的菌液酸性磷酸酶活性測定結(jié)果圖1表明， 酸性磷酸酶活性隨著保存時(shí)間的延長呈現(xiàn)M型的變化規(guī)律，酶活在保存60d和100d時(shí)與最開始保存時(shí)的酶活值基本相當(dāng)，在0-60d和60-100d期間均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并且兩個(gè)期間酶活的最大值也基本一致。圖1不同保存時(shí)間下的酸性磷酸酶酶活變化Fig.1 Enzyme activity of acid phosphatase at different save time 2.2保存過程中多酚氧化酶酶活變化多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,簡稱PPO)是兒茶酚氧化酶和漆酶的統(tǒng)稱。1973年， Kubowi

13、tz在Warburg實(shí)驗(yàn)室中第1次分離出多酚氧化酶 謝春艷,賓金華,陳兆平等. 多酚氧化酶及其生理功能J. 生物學(xué)通報(bào). 1999(06):15-17。多酚氧化酶常常代表著很多時(shí)期很多物種都生命的活性。不同保存時(shí)間下的菌液TTC脫氫酶活性測定結(jié)果圖4-2表明， 多酚氧化酶活性隨著保存時(shí)間的延長都有下降的趨勢，一開始時(shí)下降幅度較小，到保存兩個(gè)月后酶活值下降幅度較大，至80d時(shí)基本失活。圖2不同保存時(shí)間下多酚氧化酶酶活變化Fig.2 Enzyme activity of polyphenol oxidase at different save time2.3保存過程中TTC脫氫酶酶活變化

14、TTC脫氫酶也是一種典型的胞外酶 黃志龍. 食用菌菌種質(zhì)量檢測技術(shù)J. 中國食用菌,2006,25(5):29-30.，常常用于檢測種子的活力。TTC-脫氫酶是最直接反應(yīng)菌種活力大小的物質(zhì)，原則上說，菌齡越大，菌種活力越低 彭林. 金針菇菌種質(zhì)量檢測技術(shù)研究D.福建農(nóng)林大學(xué),2010。不同保存時(shí)間下的菌液TTC脫氫酶活性測定結(jié)果圖3表明， TTC脫氫酶活性隨著保存時(shí)間的延長都有下降的趨勢，下降幅度較多酚氧化酶酶活值下降幅度大，在常溫下酶活在80d左右就降到接近0，基本失活。圖3不同保存時(shí)間下TTC脫氫酶酶活變化Fig.3 Enzyme activity of TTC dehydrogenase

15、 at different save time2.4不同保存時(shí)間下的菌絲活力菌絲日均生長速率是菌絲活力最直觀的表現(xiàn)，測定不同保存時(shí)間下菌絲日均生長速率結(jié)果圖4表明，菌絲的日均生長速率在保存的100d時(shí)間內(nèi)呈下降的趨勢，在開始的60d內(nèi)菌絲日均生長速率下降幅度不是很大，在60-80d期間下降幅度較大，保存100d時(shí)，菌絲的生長速率變得十分緩慢了。圖4不同保存時(shí)間下菌絲日均生長速率Fig.4 Average growth rate of mycelium at different save time2.5三種酶活性與菌絲活力的相關(guān)性分析從三種酶酶活與菌絲活力的相關(guān)性分析的表1可以看出，酸性磷酸酶的

16、活性與菌絲活力沒有表現(xiàn)出相關(guān)性，而多酚氧化酶和TTC脫氫酶與菌絲活力的表現(xiàn)出相關(guān)的變化趨勢，都呈一定的正相關(guān)性，特別是TTC脫氫酶與菌絲活力呈現(xiàn)出極顯著的正相關(guān)。因此，可以用TTC脫氫酶活性作為菌絲菌劑老化的衰老標(biāo)志，反映菌劑活力的強(qiáng)弱。表1三種酶酶活與菌絲活力的相關(guān)性分析Tab.1 Correlation Analysis of between enzyme activity and mycelium activity酶活酸性磷酸酶多酚氧化酶TTC脫氫酶Pearson Correlation0.080.664*0.883*Sig. (2-tailed)0.3140.0150.002N1515

17、15 注：*為極顯著相關(guān)性，*為顯著相關(guān)性。2.6溫度對(duì)液體菌絲菌劑保存的影響溫度是菌絲存活的一個(gè)重要因素 王淑芳,卜慶梅,徐魯?shù)? 平菇液體菌種保存溫度及有效期試驗(yàn)J. 食用菌. 2007(03):22-24，常溫下黃色須腹菌液體菌絲液能保存80100天，而保持穩(wěn)定恒定進(jìn)行保存溫度的選擇試驗(yàn)(表4-2)表明，在溫度 劉貴巧. 食用菌液體菌種的保存期與保存溫度的關(guān)系試驗(yàn)初報(bào)J. 食用菌. 2003(04):16 、 孟昭武,邢瑛,張憲云,祁海玲. 香菇液體菌種保存溫度與有效期初探J. 食用菌. 1989(05):18控制在25的保存條件下，菌絲代謝相對(duì)旺盛，存活時(shí)間只有不到三個(gè)月的時(shí)間，而在4

18、和-20的保存條件下，菌絲的存活時(shí)間均超過了一年，但是-20保存條件下，液體菌絲菌劑成為固體透明的冰塊了，如果要進(jìn)行條件應(yīng)用，還必須先進(jìn)行解凍，不利于菌劑的直接使用，而4時(shí)菌絲的絮狀形態(tài)等能較好的完整保存，有利于液體菌絲菌劑的直接田間應(yīng)用。所以液體菌絲菌劑的保存溫度以4為宜。表2不同溫度條件下菌絲的存活時(shí)間Tab.2 The living time of mycelium indifferent temperature溫度()254-20存活時(shí)間(d)80>365>3653結(jié)論菌絲活力是外生菌根菌絲制劑產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵所在，菌根真菌在營養(yǎng)類型上是屬于異養(yǎng)型生物，纖維素、半纖維素、淀粉、果膠質(zhì)、木質(zhì)素等高分子碳源，必須經(jīng)菌絲分泌相應(yīng)的胞外酶，將其降解為簡單碳化物后才能被吸收并轉(zhuǎn)化為自身的營養(yǎng)物質(zhì)，滿足自身的生長發(fā)育需要 薛振文,應(yīng)國華,呂明亮等. 褐環(huán)粘蓋牛肝菌液體發(fā)酵過程中菌絲活力研究J. 食用菌. 2010(04):12-13 。胞外酶酶量大小和酶活高低，視不同種屬的菌根真菌有所不同。用不同的基質(zhì)和所處的生理發(fā)育階段有所不同。選擇測定有代表性的胞外酶進(jìn)