淺論乳腺癌中Ezrin表達特點及臨床病理意義

1、淺論乳腺癌中Ezrin表達特點及臨床病理意義               作者：范婕 史威 張林西 李海軍 金春亭 武欣 郭穎【摘要】  目的：探討 Ezrin在乳腺癌中的表達特點及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)S-P法檢測62例乳腺癌組織中Ezrin的表達情況。結(jié)果：Ezrin異常陽性表達率在乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌、浸潤性導(dǎo)管癌中分別為30%、75%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在乳腺癌中,Ezrin異常表達與臨床TNM分期、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相

2、關(guān)(P0.05)，而與患者年齡、發(fā)生部位無關(guān)(P0.05)。結(jié)論：Ezrin表達水平提高提示癌組織具有更高的浸潤、侵襲能力和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險，檢測 Ezrin有望成為判斷乳腺癌患者預(yù)后的新指標(biāo)或治療腫瘤轉(zhuǎn)移的一個靶點。 【關(guān)鍵詞】  乳腺腫瘤；Ezrin；腫瘤轉(zhuǎn)移；免疫組織化學(xué)   【ABSTRACT】  Objective:To investigate the expression of Ezrin in human breast cancer,and study its expression and clinical significance in b

3、reast cancer.Methods:The expressions of Ezrin in all specimens were detected by SP immunohistochemistry.Statistical analysis of the results was performed using SPSS 15.0 for windows statistical package.Results:The abnomal positive expressing rates of Ezrin in groups of intraductal carcinoma and inva

4、sive ductal carcinoma were separately 30% and 75%，the differences had significant statistical significance(P0.05).The overexpression of Ezrin in breast carcinoma had some relationship with the clinical TNM staging and axillary lymph nodes metastasis(P0.05),but had no relationship with age and locati

5、on(P0.05).Conclusion:High expression level of ezrin in breast cancer suggests more aggressive and higher risk of lymph node metastasis.Ezrin may be an indicator in judging prognosis of breast cancer.The results may lead to development of a therapeutic modality in future clinic.   【KEY WORD

6、S】  Breast Neoplasms,Ezrin,Neoplasm Metastasis,Immunohistochemistry   乳腺癌是威脅婦女健康和生命的常見惡性腫瘤之一。近年來，我國的乳腺癌發(fā)病率一直呈上升趨勢。腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征，也是導(dǎo)致腫瘤患者治療失敗及患者死亡的主要原因。因此，研究乳腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移，探討乳腺癌的相關(guān)預(yù)后因素具有重要的臨床意義。Ezrin為膜細胞骨架連接蛋白（memberance cytoskeleton cross linker protein），是一個82kDa的磷酸化蛋白，其編碼基因為Villin2

7、，定位于染色體6q25.2-q261。Ezrin是最近發(fā)現(xiàn)的一個嶄新的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。Ezrin的過量表達已被證實與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)2,3。本研究采用免疫組化S-P法檢測Ezrin的表達，以探討其在乳腺癌中表達的意義及其與乳腺癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。    1  材料與方法   1.1  標(biāo)本來源  收集河北北方學(xué)院病理教研室 2002-012004-04月期間存檔的乳腺癌術(shù)后送檢標(biāo)本共計62例，均為女性，年齡2573歲,平均年齡50.89歲。所有病例術(shù)前均未行放、化療，其中臨床分期期16例，期31例，+期15

8、例；有腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例25例，無腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例 37例。所有病例臨床資料完整，標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)處理后石蠟包埋，連續(xù)切片，厚4m，HE染色，由2位資深病理醫(yī)師重新光鏡下觀察確診。   1.2  試劑與方法   Ezrin鼠抗人單克隆抗體（克隆號：3C12）,工作液濃度150，購自Lab Vision Neomarker公司,S-P試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。石蠟切片經(jīng)脫蠟、梯度水化后，置10mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)中，熱平臺修復(fù)抗原，使溫度保持在98以上持續(xù)12min，自然冷卻至室溫。3%過氧化氫室

9、溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。正常山羊血清封閉非特異性抗原30min后，吸去多余血清，滴加小鼠抗人Ezrin單克隆抗體，4放置過夜。枸櫞酸鹽緩沖液（PBS）洗5min×3次后，滴加生物素化二抗，37放置30min；PBS洗5m in×3次后，滴加S-P，37放置30min。DAB顯色；蘇木素復(fù)染；中性樹脂封片。以肺組織陽性切片作為Ezrin陽性對照，以PBS替代一抗作為陰性對照。   1.3  評定標(biāo)準(zhǔn)   Ezrin陽性表達在細胞膜和細胞漿內(nèi)，呈棕黃色顆粒，按染色強度和陽性表達細胞數(shù)比例，參考 Li等的分

10、級標(biāo)準(zhǔn)：-，無表達；+，50%細胞陽性表達或染色較淺；+,50%細胞陽性表達且深染。+為異常陽性表達。   1.4  統(tǒng)計學(xué)處理   試驗數(shù)據(jù)采用 SPSS15.0進行統(tǒng)計學(xué)分析：2檢驗將各組試驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，當(dāng)P0.05認為差異具有顯著性。   2  結(jié)果   Ezrin表達陽性多表現(xiàn)在癌細胞的胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒，呈灶性或彌漫分布，大小不一，著色輕重不同，部分病例癌細胞細胞膜上也有表達。核膜均未見著色，細胞核被蘇木素染為藍色。62例乳腺癌組織中，有42例Ezrin異常表達，異常表達率為

11、67.7%。50歲組Ezrin異常表達率為63.6%低于50歲組異常表達率72.4%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(2=0.54 P=0.588)。右乳異常陽性率高于左乳異常陽性率，但差異無顯著性(P=0.788)。乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌組Ezrin異常陽性率(30%)與浸潤性導(dǎo)管癌組(75%)比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(2=7.77,P=0.009),提示乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌進展為浸潤性導(dǎo)管癌時Ezrin發(fā)揮作用。在不同臨床TNM分期組中異常陽性表達率不同,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(2=6.82 P=0.033)。同時,Ezrin異常表達與腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(2 =5.06,P=0.029)(見表1)。表 1  Ezri

12、n表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系            3  討論   腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移一般分為三個步驟：粘附改變、基質(zhì)降解和遷移。細胞的遷移需要極性化、伸展、粘附、去粘附和退縮等復(fù)雜事件的協(xié)調(diào)配合。許多蛋白質(zhì)參與細胞遷移的調(diào)節(jié)。Ezrin為膜細胞骨架連接蛋白，是連接細胞膜和細胞骨架之間的ERM(ezrin-radixin-moesin)家族成員之一。Ezrin可表達于各型上皮細胞及某些非上皮細胞，在不同組織與細胞的表達提示著Ezrin有著廣泛的生理功能。它在細

13、胞中有兩種存在狀態(tài)：當(dāng)Ezrin自身的N端和C端相互作用而使蛋白處于折疊狀態(tài)，此時它為休眠狀態(tài)。在某些因素的作用下，其梭基端一關(guān)鍵的與其激活有關(guān)的磷酸化位點被磷酸化，使蛋白展開而同胞膜和細胞骨架發(fā)生作用，此時處于激活狀態(tài)。最初簡單的認為ERM只起到連接細胞膜蛋白和肌動蛋白的功能，后來發(fā)現(xiàn)其參與許多重要的細胞復(fù)合體和特化的細胞表面結(jié)構(gòu)域的形成，以及分子在此結(jié)構(gòu)上的定位。近年來研究發(fā)現(xiàn)Ezrin在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色。很多類型的腫瘤中都有Ezrin的異常表達3，5,6。其通過改變腫瘤細胞極性及細胞運動、調(diào)節(jié)腫瘤細胞間粘附及細胞與細胞外基質(zhì)粘附、參與腫瘤細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而在腫瘤發(fā)展、浸潤

14、和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。   Yu等 及Khanna等在兩個獨立研究均采用了基因芯片這種最新的大通量篩查差異基因表達的方法對兩種腫瘤（橫紋肌肉瘤和骨肉瘤）高轉(zhuǎn)移性和低轉(zhuǎn)移性變異細胞株的研究。發(fā)現(xiàn)Ezrin在轉(zhuǎn)移的細胞克隆中都過量表達。將全長Villin2基因轉(zhuǎn)染至低轉(zhuǎn)移細胞株能明顯增強細胞的肺轉(zhuǎn)移能力。說明Ezrin的過表達有助于腫瘤的轉(zhuǎn)移。更重要的是，應(yīng)用Ezrin顯性負性變異體，反義RNA或DNA干擾的實驗研究，證實Ezrin的過表達不僅是腫瘤轉(zhuǎn)移進展的充分條件，而且也是其必要條件。對多種實體瘤的研究9,10發(fā)現(xiàn)，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中Ezrin高表達，而不伴有淋巴

15、結(jié)轉(zhuǎn)移者則低表達，并且其表達與患者的預(yù)后明顯相關(guān)。本試驗對手術(shù)切除的人乳腺癌組織應(yīng)用免疫組化的方法檢測Ezrin的表達，結(jié)果表明Ezrin在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌細胞中異常表達，表達率（75%）明顯高于導(dǎo)管內(nèi)癌組織（30%），二者差別有統(tǒng)計學(xué)意義，提示乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌進展為浸潤性導(dǎo)管癌時，Ezrin發(fā)揮作用。Ezrin異常表達與乳腺癌 TNM分期也密切相關(guān)（2 =6.82,P=0.033）(r=0.326,P=0.01),在期樣本中,只有43.8%(7/16)出現(xiàn)Ezrin異常表達，在期樣本中，則有 71.0%(22/31)出現(xiàn)Ezrin異常表達，而在+期樣本中,有高達 86.7%(13/15)出現(xiàn)Ez

16、rin異常表達。更有意義的是，Ezrin表達與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。從本組數(shù)據(jù)可以看出，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一組乳腺癌組織中Ezrin異常表達率（84%）明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（56.7%），（2 =5.06,P=0.029）兩者差別有統(tǒng)計學(xué)意義，提示Ezrin的異常表達預(yù)示著乳腺癌患者有較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響乳腺癌患者預(yù)后的重要因素，因此Ezrin的異常表達可能預(yù)示著患者的預(yù)后不佳，其測定有助于早期判斷預(yù)后。激活的Ezrin可以使E-cadherin向細胞內(nèi)聚集，導(dǎo)致細胞表面E-cadherin減少，從而破壞E-cadherin介導(dǎo)的細胞間連接,減少細胞間粘附11。另外，Ezr

17、in能與CD44形成復(fù)合體而發(fā)揮作用，CD44v6 作為CD44主要變異體，其胞內(nèi)C末端結(jié)構(gòu)域能與Ezrin的 FERM結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合體12，Ezrin在細胞內(nèi)作為CD44v6的錨定分子，使CD44v6與細胞骨架連接起來，CD44是基質(zhì)重要成分透明質(zhì)酸的細胞表面受體，因此形成透明質(zhì)酸-CD44-ERM-肌動蛋白細胞骨架復(fù)合物，促進細胞-基質(zhì)的粘附13，進而改變腫瘤細胞的運動能力，介導(dǎo)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，同時與細胞外基質(zhì)中配體結(jié)合，導(dǎo)致腫瘤細胞形態(tài)、游走性的改變，為腫瘤細胞的遷移奠定基礎(chǔ)。而Ezrin的表達與患者年齡、發(fā)生部位等臨床病理參數(shù)均無關(guān)。這與國外在其他腫瘤的多項研究結(jié)果相一致。 &

18、#160; 本研究顯示，Ezrin在乳腺癌組織中的異常表達參與了乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。對Ezrin的深入研究將有助于我們進一步揭示腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移機制，Ezrin作為一個新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白，有望成為判斷腫瘤預(yù)后的新指標(biāo)和未來治療腫瘤轉(zhuǎn)移的一個靶點?！緟⒖嘉墨I】  1 Bretscher A,Edwards K,Fehon RG.ERM proteins and merlin:integrators at the cell cortex“J“.Nat Rev Mol Cell Biol,2002,3(8):586-5992 Moilanen J,Lassus H,Lemin

19、en A,et al.Ezrin immunoreactivity in relationship to survival in serous ovarian carcinoma patients“J“.Gynecol Oncol,2003,90:273-2813 Valdman A,Fang X,Pang ST,et al.Ezrin expression in prostate cancer and benign prostatic tissue“J“.Eur Urol,2005,48(5):852-8574 Li Q,Wu MF,Song AP,et al.Expression of ezrin and E - cadherin in invasive ductal breast cancer and their correlations to lymphatic metastasis“J“.Ai Zheng,2006,25(3):363-3665 Hunter KW.Ezrin,a key component in tumor metas