植酸酶活力的測定方法及應(yīng)注意問題

1、科技信息植酸酶是催化植酸及植酸鹽水解成肌醇與磷酸的一類酶的總稱 1。 植酸酶是一種胞外酶 2, 廣泛存在于自然界中, 植物 、 動物 、 微生物均可 產(chǎn)生植酸酶 。 植酸酶的活性因來源不同而有差異 。植酸酶能將肌醇六磷酸 (植酸 分解成為肌醇和磷酸 。 植酸酶可以專 一性地水解植酸中的磷酯鍵, 使磷酸游離出來, 植酸酶將植酸分子上的磷酸基團(tuán)逐個切下, 形成中間產(chǎn)物肌醇五磷酸 、 肌醇四磷酸 、 肌醇三磷 酸 、 肌醇二磷酸 、 肌醇一磷酸 、 終產(chǎn)物為肌醇和磷酸 3。 植酸酶的作用機(jī) 理見圖 1。 圖 1植酸酶的作用機(jī)理1. 植酸酶酶活力測定的意義 酶活力也稱酶活性, 是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的

2、能力, 用在一定條 件下, 酶所催化某一反應(yīng)的速率表示 。 酶活性是研究酶的特性, 分離純 化以及酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用時的一項不可缺少的指標(biāo) 。酶活力單位是以酶活力為根據(jù)而定義的 。 國際生化協(xié)會酶委員會 規(guī)定, 1min 內(nèi)將 1mol 的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定為 1個單位,稱為 標(biāo)準(zhǔn)單位, 同時規(guī)定了酶作用的條件 。 因標(biāo)準(zhǔn)單位在實際應(yīng)用時不夠方 便, 故在生產(chǎn)上往往根據(jù)不同的酶, 制定各自不同的酶活力單位 。 在測 定酶活力時, 對反應(yīng)溫度 、 pH 、 底物濃度 、 作用時間都有統(tǒng)一規(guī)定, 以便 同類產(chǎn)品互相比較 。 但是酶活力單位并不能直接反映酶的絕對數(shù)量, 只 不過是一種相對比較的依據(jù)

3、 4。植酸酶活性的定義為:在最適宜條件下, 每分鐘從一定濃度的植酸 鈉溶液中釋放 1mol 的無機(jī)磷所需要的酶量為一個酶活力單位 。 確定 植酸酶的酶活, 可以提高實驗的標(biāo)準(zhǔn)性和效率 。2. 植酸酶活力測定的原理及方法酶活力測定的原理都是利用酶水解植酸鈉形成無機(jī)磷,然后測定 無機(jī)磷的釋放量 。植酸酶活性的測定方法較多 , 但至今尚沒有被世界普遍公認(rèn)的植酸 酶的定量分析方法 。 方法包括:釩 -鉬酸銨法 、 硫酸亞鐵 -鉬藍(lán)法 、 Vc-鉬藍(lán)法 、 丙酮 -磷鉬酸銨法 、 微板法和微量比色法等 5。 可根據(jù)實驗需要 選擇不同的方法 。2.1釩 -鉬酸銨法該方法是利用植酸酶可以水解植酸磷釋放出無機(jī)

4、磷的原理 。 通過 加入酸性鉬 -釩試劑使水解反應(yīng)停止 , 同時與水解釋放出來的無機(jī)磷 產(chǎn)生顏色反應(yīng) , 形成黃色的釩鉬磷絡(luò)合物 , 在 415nm 波長下測定磷的含 量 。 以標(biāo)準(zhǔn)植酸酶為參照物 , 間接計算被測樣品中植酸酶的含量 。 本法于 1994年列入 AOAC, 我國也已將此法的測定結(jié)果作為審批商品植酸酶 注冊許可證和驗收進(jìn)口產(chǎn)品的法定商檢依據(jù) 。2.2硫酸亞鐵 -鉬藍(lán)法該方法利用植酸酶可以水解植酸磷釋放無機(jī)磷的原理 , 通過加入三 鹽酸使水解反應(yīng)停止 , 然后加入鉬酸銨及 FeSO 4·7H 20的混合液使溶液 顯色 , 在 720nm 波長下測定其吸收值 , 以標(biāo)準(zhǔn)酶為

5、參照物 , 間接計算被測 樣品中植酸酶的含量 。2.3Vc-鉬藍(lán)法該方法是利用植酸酶可以水解植酸磷釋放無機(jī)磷的原理 , 通過加入 三氯乙酸使反應(yīng)停止 , 然后加入鉬酸銨與 Vc 的混合液 , 使溶液顯色 , 在 820nm 波長下測定吸光度 , 再以標(biāo)準(zhǔn)磷溶液的吸光度及磷溶液濃度對應(yīng) 的酶活單位建立直線回歸方程 , 最后以待測樣品吸光度代入方程 , 計算 出酶活性 。2.4丙酮 -磷鉬酸銨法磷酸鹽與過量的鉬酸銨在酸性條件下混合后 , 可慢慢生成黃色磷鉬 酸銨 , 加入丙酮后將黃色物質(zhì)提出來 , 在 355nm 波長處測吸光度 , 靈敏度 增加 10倍 。2.5方法比較不同的測定方法, 各有優(yōu)缺

6、點 。 釩 -鉬酸銨法靈敏度最高, 丙酮法穩(wěn)定性最好, 抗干擾能力較強(qiáng), 在測定飼料 、 發(fā)酵產(chǎn)物中植酸酶酶活, 采 用丙酮法較好 。AOAC 法測定出現(xiàn)酶活力結(jié)果偏小 , 原因可能是由于顯色反應(yīng)需要 在沸水浴中進(jìn)行,溶液中已經(jīng)存在的 TCA 可在高溫下水解底物植酸鈉, 因此造成誤差 。 所以,用 TCA 做酶的滅活劑時, 不能采用 AOAC 無 機(jī)磷分析方法進(jìn)行植酸酶的測定 。鉬藍(lán) -Vc 顯色法是在室溫下進(jìn)行的, 可減少 TCA 對植酸的水解作用, 分析結(jié)果相對準(zhǔn)確 。 空白樣測定時, 當(dāng)采用 TCA 為滅活劑時,可能產(chǎn)生假酶活問題 。 如果改進(jìn)程序, 先不加入 底物植酸鈉, 而是將酶液與

7、緩沖液保溫, 反應(yīng)完成后用 TCA 將酶滅活, 然后加入底物,這樣操作避免了 TCA 在熱環(huán)境下對植酸鈉的水解作 用, 能夠較準(zhǔn)確地測定植酸酶水解底物后釋放的無機(jī)磷的量, 酶活力分 析結(jié)果更為準(zhǔn)確 。3. 植酸酶活力測定中應(yīng)注意的問題 3.1溫度植酸酶作為一種酶制劑, 對溫度非常敏感, 溫度低會降低它的生物 活性; 溫度高也會降低其生物活性, 甚至完全失活 。 因此, 在檢測過程中 對溫度的控制則顯得非常重要,國標(biāo)要求植酸酶活性測定時的溫度為 (37±0.1 。 在 33 時植酸酶不能很好地發(fā)揮其活性, 酶活與其真實 值相比約低 10%; 在 40 時, 部分植酸酶會失活, 酶活與其

8、真實值相比約低 8%。 另外,水浴加熱時, 水浴液面要超過試管內(nèi)反應(yīng)液液面, 使其 在規(guī)定時間內(nèi)充分反應(yīng) 。3.2pH 值pH 值在酶活測定時影響很大, 國標(biāo)要求 pH 值為 5.5。 當(dāng) pH 值為 3.0時,植酸酶活力基本消失 。 盡量不要用酸度計來調(diào)節(jié)緩沖液的 pH 值, 因為酸度計存在一定的誤差, 使用時間長了會發(fā)生鈍化, 使測定的pH 值不準(zhǔn) 。 可以通過計算緩沖溶液中 H +濃度的方法來配制一定 pH 值 的溶液 。3.3底物植酸鈉的型號 植酸鈉有兩種型號, 一種是 Sigma p-3168, 分子量為 923.8; 另一種 是 Sigma p-8810, 分子量為 660.03。

9、 根據(jù)國標(biāo)要求,植酸鈉應(yīng)為 Sigma p-3168, 在實驗中發(fā)現(xiàn) Sigma p-3168植酸鈉底色淺, 且作磷標(biāo)準(zhǔn)曲線時 梯度較好檢測植酸酶活性時用 Sigma p-3168為反應(yīng)底物較好 。3.4離心速度和時間當(dāng)水浴 30min 終止酶解反應(yīng)后, 需要進(jìn)行離心 。 國標(biāo)要求 4000r/min,離心 10min 。 若以 3000r/min離心 10min ,則離心不徹底, 測吸光度時發(fā) 現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度不呈梯度; 以 5000r/min離心 10min 時, 發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線各梯度的吸光度與以 4000r/min離心 10min 時相比偏低 。如果應(yīng)用國 標(biāo)改進(jìn)法, 乙酸緩沖液中加入了牛

10、血清白蛋白, 離心時間需要 15min 用 國標(biāo)改進(jìn)法進(jìn)行了時間對比實驗,測定酶活時離心 10min 和 15min 后 樣品的吸光度, 發(fā)現(xiàn)離心時間對測定結(jié)果影響很大 。4. 結(jié)束語在實際應(yīng)用和理論研究中酶不易制成純品, 其中含有很多雜質(zhì), 真 正的含酶量并不多, 所以酶制劑中酶的含量都用酶活力來表示 。 酶活力 大小是衡量酶制劑質(zhì)量的主要指標(biāo),選擇具有高度專一性和靈敏度的 酶活測定方法是酶制劑質(zhì)量的保障 。 不同的測定方法有不同的應(yīng)用范 圍, 應(yīng)根據(jù)實際情況進(jìn)行選擇, 并在測定中應(yīng)注意其影響因素 。 參考文獻(xiàn)1羅貴民 . 酶工程 . 第二版 . 北京 :化學(xué)工業(yè)出版社 ,2004:19-2

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