紫外光譜分析儀基礎知識

1、紫外光譜分析儀基礎知識紫外, 可見光譜法及相關儀器UV-VIS Spectrometry & Instrument紫外, 可見光譜法及相關儀器一（紫外, 可見吸收光譜概述二（紫外, 可見分光光度計 21（紫外, 可見分光光度計的主要部件2（紫外, 可見分光光度計的分類3（紫外, 可見分光光度計的各項指標含義4（紫外, 可見分光光度計的校正三（紫外, 可見分光光度計的應用四（紫外, 可見分光光度計的進展一（紫外, 可見吸收光譜概述利用紫外 ,可見吸收光譜來進行定量分析由來已久，可追溯到古代，公元 60 年 古希臘已經(jīng)知道利用五味子浸液來估計醋中鐵的含量，這一古老的方法由于最初是 運用人眼

2、來進行檢測，所以又稱比色法。到了 16、17 世紀，相關分析理論開始蓬 勃發(fā)展， 1852 年，比爾 （Beer） 參考了布給爾 （Bouguer）1729 年和朗伯 （Lambert） 在 1760年所發(fā)表的文章，提出了分光光度的基本定律，即液層厚度相等時，顏色的 強度與呈色溶液的濃度成比例，從而奠定了分光光度法的理論基礎，這就是著名的 朗伯, 比爾定律。1（紫外, 可見吸收光譜的形成 吸光光度法也稱做分光光度法，但是分光光度法的概念有些含糊，分光光度是 指儀器的功能，即儀器進行分光并用光度法測定，這類儀器包括了分光光度計與原 子吸收光譜儀（AAS）。吸光光度法的本質是光的吸收，因此稱吸光光

3、度法比較合 理，當然，稱分子吸光光度法是最確切的。紫外,可見吸收光譜是物質中分子吸收 200-80Onm光譜區(qū)內的光而產(chǎn)生的。這 種分子吸收光譜產(chǎn)生于價電子和分子軌道上的電子在電子能級躍遷（原子或分子中的電子，總是處在某一種運動狀態(tài)之中。每一種狀態(tài)都具有一定的能量，屬于一定 的能級。這些電子由于各種原因 （如受光、熱、電的激發(fā) ）而從一個能級轉到另一個 能級，稱為躍遷。 ）當這些電子吸收了外來輻射的能量就從一個能量較低的能級躍 遷到一個能量較高的能級。因此，每一躍遷都對應著吸收一定的能量輻射。具有不 同分子結構的各種物質，有對電磁輻射顯示選擇吸收的特性。吸光光度法就是基于 這種物質對電磁輻射的

4、選擇性吸收的特性而建立起來的，它屬于分子吸收光譜。躍 遷所吸收的能量符合波爾條件 :hvEE,2121二（紫外, 可見分光光度計1854年，杜包斯克（Duboscq）和奈斯勒（Nessler）等人將此理論應用于定量分析 化學領域，并且設計了第一臺比色計。到 1 91 8年，美國國家標準局制成了第一臺 紫外可見分光光度計。此后，紫外 , 可見分光光度計經(jīng)不斷改進，又出現(xiàn)自動記 錄、自動打印、數(shù)字顯示、微機控制等各種類型的儀器，儀器的靈敏度和準確度也 不斷提高，其應用范圍也不斷擴大。1（紫外,可見分光光度計的主要部件全世界的紫外 , 可見分光光度計生產(chǎn)廠家有上百家，產(chǎn)品型號成千上萬，但就 基本結構

5、來說，都是由五個部分組成，即光源、單色器（單色儀） 、吸收池、檢測器和信號指示系統(tǒng)。如下圖所示 :信號指 光源 單色器 吸收池 檢測器 示系統(tǒng) 光源對光源的基本要求是 : 應在儀器操作所需的光譜區(qū)域內能夠發(fā)射連續(xù)輻射 ;有足 夠的輻射強度和良好的穩(wěn)定性，而且輻射能量隨波長的變化應盡可能小。紫外 , 可 見分光光度計中常用的光源有熱輻射光源和氣體放電光源兩類。熱輻射光源用于可 見光區(qū)。如鎢絲燈和鹵鎢燈 ; 氣體放電光掉用于紫外光區(qū)，如氫燈和氘燈。鎢燈和碘鎢燈可使用的范圍在340,250Onm,這類光源的輻射能量與施加的外加 電壓有關，在可見光區(qū)，輻射的能量與工作電壓的 4 次方成正比。光電流也與

6、燈 絲電壓的 n 次方 (n>l) 成正比。因此必須嚴格控制燈絲電壓,儀器必須備有穩(wěn)壓裝在近紫外區(qū)測定時常用氫燈和氘燈,它們可在 160,375nm 范圍內產(chǎn)生連續(xù)光 源。氘燈的燈管內充有氫的同位素氘,它是紫外光區(qū)應用最廣泛的一種光源,其光 譜分布與氫燈類似,但光強度比相同功率的氫燈要大 3,5 倍。 單色器單色器是能從光源輻射的復合光中分出單色光的光學裝置,其主要功能應該是 能夠產(chǎn)生光譜純度高且波長在紫外可見區(qū)域內任意可調的單色光。單色器一般由入 射狹縫、準直鏡 (透鏡或凹面反射鏡使入射光成平行光 ) 、色散元件、聚焦元件和出 射狹縫等幾部分組成。其核心部分是色教元件,起分光的作用。單

7、色器的性能直接 影響人射光的單色性,從而也影響到測定的靈敏度、選擇性及校準曲線的線性關系 等。能起分光作用的色散元件主要是棱鏡和光柵。棱鏡常用的材料有玻璃和石英兩 種。它們的色散原理是依據(jù)不同波長光通過棱鏡時有不同的折射率而將不同波長的 光分開。由于玻璃可吸收紫外光,所以玻璃棱鏡只能用于 350,3200 nm 的波長范圍,即只能用于可見光區(qū)域內。石英棱鏡適用的波長范圍較寬,可從185,4000nm,即可用于紫外、可見、近紅外三個光域。光柵是利用光的衍射與干涉原理制成的。它可用于紫外、可見及近紅外光域,而且在整個波長區(qū)具有良好的、幾乎均勻一致的分辨能力。它具有色散波長范圍 寬、分辨本領高、成本

8、低、便于保存和易于制備等優(yōu)點。缺點是各級光譜會重疊而 產(chǎn)生干擾。入射、出射狹縫，透鏡及準直鏡等光學元件中狹縫在決定單色器性能上起重要 作用。狹縫的大小直接影響單色光純度，但過小的狹縫又會減弱光強。 吸收池吸收池用于盛放分析試樣，一般有石英和玻璃材料兩種。石英池適用于可見光 區(qū)及紫外光區(qū)，玻璃吸收池只能用于可見光區(qū)。為減少光的反射損失，吸收池的光 學面必須完全垂直于光束方向 ( 在高精度的分析測定中 (紫外區(qū)尤其重要 ), 吸收池要 挑選配對。因為吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程長度的精度等對分析 結果都有影響。檢測器檢測器的功能是檢測光信號、測量單色光透過溶液后光強度變化的一種裝置，

9、常用的檢測器有光電池、光電管和光電倍增管等。它們通過光電效應將照射到檢測 器上的光信號轉變成電信號。對檢測器的要求是 : 在測定的光譜范圍內具有高的靈 敏度; 對輻射能量的響應時間短，線性關系好 ; 對不同彼長的輻射響應均相同，且可 靠; 噪音低，穩(wěn)定性好等。硒光電池對光的敏感范圍為 300,800nm ，其中又以 500,600nm 最為靈敏。這 種光電池的特點是能產(chǎn)生可直接推動微安表或檢流計的光電流，但由于容易出現(xiàn)疲 勞效應而只能用于低檔的分光光度計中。光電管在紫外 , 可見分光光度計上應用較為廣泛。它的結構是以一彎成半圓柱 形的金屬片為陰極，陰極的內表面涂有光敏層，在圓柱形的中心置一金屬

10、絲為陽極 ( 接受陰極釋放出的電子。兩電極密封于玻璃或石英管內并抽成真空。陰極上光敏 材料不同，光譜的靈敏區(qū)也不同?？煞譃樗{敏和紅敏兩種光電管，前者是在鎳陰極 表面上沉積銻和艷，可用于波長范困為 210,625 nm; 后者是在陰極表面上沉積了銀和氧化艷。可用范圍為 625,10OOnm。與光電池比較，它有靈敏度高、光敏范圍寬、不易疲勞等優(yōu)點。光電倍增管是檢測微弱光最常用的光電元件，它的靈敏度比一般的光電管要高200 倍，因此可使用較窄的單色器狹縫，從而對光譜的精細結構有較好的分辨能力。信號指示系統(tǒng)它的作用是放大信號并以適當方式指示或記錄下來。早期常用的信號指示裝置 有直讀檢流計、電位調節(jié)指零

11、裝置以及數(shù)字顯示或自動紀錄裝置等?，F(xiàn)在很多型號 的分光光度計都可配套計算機使用，一方面可對分光光度計進行操作控制，另一方 面可進行數(shù)據(jù)處埋。2（ 紫外, 可見分光光度計的分類紫外, 可見分光光度計的類型很多，但可歸納為三種類型 : 單光束分光光度計、雙光束分光光度計和雙波長分光光度計。a（ 單光束分光光度計其光路示意圖如前圖 （ 紫外, 可見分光光度計的基本結構圖 ） 所示，經(jīng)單色器分 光后的一束平行光，輪流通過參比溶液和樣品溶掖，以進行吸光度的測定。這種類 型的分光光度計結構簡單，操作方便，維修容易，適用于常規(guī)分析。國產(chǎn) 722型， 751型、724型、英國SP500型以及Backman D

12、U,8型等均屬于此類光度計。b（ 雙光束分光光度計其光路示意如下圖所示，經(jīng)單色器分光后經(jīng)反射鏡（M1）分解為弧度相等的兩束光，一束通過參比池，另一束通過樣品池。光度計能自動比較兩束光的強度，此比 值即為試樣的透射比，經(jīng)對數(shù)變換將它轉換成吸光度并作為波長的函數(shù)記錄下來。 雙光束分光光度計一般都能自動記錄吸收光譜曲線。由于兩束光同時分別通過參比池和樣品他，還能自動消除光源強度變化所引起的誤差。這類儀器有國產(chǎn) 710型、730型和740型，日立220系列，島津,210，英國UNICAM SP,70(等等。M1切光器M3單 色 器參比池光源光電倍增管樣品池M2切光器M4單波長雙光束分光光度計原理圖c(

13、 雙波長分光光度計 其基本光路如下圖所示。由同一光源發(fā)出的光被分成兩束，分別經(jīng)過兩個單色 器，得到兩束不同波長的單色光 ; 再利用切光器使兩束光以一定的頻率交替照射同 一吸收池，然后經(jīng)過光電倍增管和電子控制系統(tǒng)，最后由顯示器顯示出兩個波長處 的吸光度差值 A ( A = A-A)。12雙波長分光光度計的優(yōu)點 :對于多組分混合物、混濁試樣 (如生物組織液 )的分 析，以及存在背景于擾或共存組分吸收干擾的情況下，利用雙波長分光光度法，往 往能提高方法的靈敏度和選擇性。利用雙波長分光光度計，能獲得導數(shù)光譜。通過 光學系統(tǒng)轉換，使雙波長分光光度計能很方便地轉化為單波長工作方式。如果能在 兩波長處分別記

14、錄吸光度隨時間變化的曲線，還能進行化學反應動力學研究。切光器單色器光源吸收池檢測器單色器雙波長分光光度計光路示意圈3（紫外, 可見分光光度計的各項指標含義a. 波長準確度與準確性 （ 一般在 0.1-0.8nm 之間）單色光的最大強度波長值于波長指示值之差。是儀器最重要的指標之一，儀器 測定的每個值都是在指定的波長下得到的，如果所示的波長和實際波長偏差很大， 那么測出的結構就毫無意義了。b. 狹縫寬準確度 （ 一般在 0.01-0.1nm 之間）狹縫是指由一對隔板在光通路上形成的縫隙，用來調節(jié)入射單色光的純度和強 度，也直接影響分辯力。因此，狹縫的準確度越高越好。狹縫可在 0.1,10nm 寬

15、度 內調節(jié)。c. 噪音（ 一般在 0.0008-0.008 之間）表征儀器做稀溶液的能力。這個指標越小越好。d. 吸光度準確性 （ 一般在 0.1%-2.0%之間 ）吸光度的儀器讀數(shù)與標準溶液的標準值之差。標定應在紫外光區(qū)和可見光區(qū)兩個部分進行。e. 高讀數(shù)準確度 （ 一般在 0.2%-5.0%之間）吸光度范圍一般在 0-8 之間，在比較大的吸光度時測定的準確度反映了儀器的線性范圍的好壞。f. 雜散光（一般在0.02%-0.3%T之間）檢測器在給定的標稱波長處（220nm, Nal;340nm,NaN0接收的光線中2夾雜的不屬于入射光束的其它光線。這個值越小越好。g. 分辨率（一般在 0.03

16、-0.3 之間）是指儀器分開相鄰的兩條譜線的能力。如：在狹縫為0.2nm時，365.02、365.48、366.33nm三條譜線應能明顯分清h. 能量（一般在0.5-1之間）是讀數(shù)方式的一種，一般儀器都有幾種測量光度的方式如：透過率，吸光度，反射率，能量。能量的大小反映了光源、檢測器等儀器的整體性能。此外還有其它指標：如儀器的波長范圍（190-1100nm）、基線漂移、穩(wěn)定性、吸 光度范圍等，這些指標都容易理解，就不一一說明了。4（紫外,可見分光光度計的校正通常在實驗室工作中，驗收新儀器或儀器使用過一段時間后都要進行波長校正 和吸光度校正。一般要在紫外區(qū)和可見區(qū)分別校正。常采用下述的方法來進行

17、校 正。錯釹玻璃或欽玻璃都有若干特征的吸收峰，可用來校正分光光度計的波長標尺，前者用于可見光區(qū)，后者則對紫外和可見光區(qū)都適用。3可用KCrO標準溶液來校正吸光度標度。將 0.04克KCrO溶解于1dm的242430.05 mol/dm的KOH溶液中，在1cm光程的吸收池中，在25?時用不同波長 測得的吸光度值如下表：察工L捱醉輝畀黑的屋特改Am亂吐出* ,feriMt Jr joUUII73no1 3SCjojuoej-i遠4D2S015X)(V闕Q 9T2血慣朋1L3wtw曠*伽弊斟；IL7X15 1CLB4C150L'.WIJ鉻酸鉀溶液的吸光度三（紫外,可見分光光度計的應用紫外,可

18、見分光光度計可用于物質的定量分析、結構分析和定量分析。而且還 能測定某些化合物的物理化學參數(shù)，如摩爾質量、配合物的配合比例和穩(wěn)定常熟、 酸堿電離常數(shù)等。1( 定性分析緊外, 可見分光光度法對無機元素的定性分析應用較少，無機元素的定性分析 可用原子發(fā)射光譜法或化學分析的方法。在有機化合物的定性鑒定和結構分析中， 由于紫外 , 可見光譜較簡單，特征性不強，因此該法的應用也有一定的局限性。但 是它適用于不飽和有機化合物。尤其是共軛體系的鑒定，以此推斷未知物的骨架結 構。此外，可配合紅外光譜、核磁共振波譜法和質譜法進行定性鑒定和結構分析， 因此它仍不失為是一種有用的輔助方法。一般有兩種定性分析方法，比

19、較吸收光譜曲線和用經(jīng)驗規(guī)則計算最大吸收波長入，然后與實測值進行比較。max2( 結構分析結構分析可用來確定化合物的構型和構象。如辨別順反異構體和互變異構體。3( 定量分析紫外, 可見分光光度定量分析的依據(jù)是 Lambert-Beer 定律，即在一定波長處被 測定物質的吸光度與它的溶度呈線性關系。應此，通過測定溶液對一定波長入射光 的吸光度可求出該物質在溶液中的濃度和含量。種常用的測定方法有 : 單組分定量 法、多組分定量法、雙波長法、示差分光光度法和導數(shù)光譜法等。 4( 配合物組成 及其穩(wěn)定常數(shù)的測定測量配合物組成的常用方法有兩種 :摩爾比法(又稱飽和法 )和等摩爾連續(xù)變化 法(又稱 Job

20、法) 。5( 酸堿離解常數(shù)的測定 光度法是測定分析化學中應用的指示劑或顯色劑離解常數(shù)的常用方法，該法特 別適用于溶解度較小的弱酸或弱堿。-VIS 的一些應用領域舉例 6.UV紫外, 可見分光光度計的應用范圍很廣，在有機化學、生物制藥、藥品分析、 食品檢測、環(huán)保、生命科學等領域都廣泛的應用。比如紫外 ,可見分光光度計在環(huán)保行業(yè)應用于有機污染物的檢測 : 可以測定水中 的油分、黃腐酸、木素磺酸、木質素、五氯酚、CO等，可以測定土壤和水中的酚類、苯胺類等等。紫外, 可見分光光度計在農(nóng)藥制劑、添加劑、防腐劑和作物提取物測定等方面 有著廣泛的應用 :可以用來測量水稻小麥中多均靈殘留量，可用于滅鼠靈、除草

21、劑 的測定，可測定飼料添加劑中皮蠅磷、灰黃霉素、磺胺類藥物等，可測定作物提取 物中的煙堿、辣椒素、香草醛、苯甲醛、咖啡堿等，可測定食品防腐劑中的苯甲酸 鹽和山梨酸鹽，飲料中的各種有機成分等。此外，紫外 , 可見分光光度計在制藥行業(yè)有著更廣泛的應用?？捎糜?、滴眼 液、安定藥、鎮(zhèn)咳劑、解熱藥、利尿藥、降壓藥、抗瘧藥、抗腫瘤、抗結核等藥物 的測定，測定去痛片、安痛定注射液和小兒感敏沖劑中各組分的含量，紫外, 可見分光光度計在無機物的測定中也有許多應用。四（紫外, 可見分光光度計的進展1（儀器的自動化程度大大提高世界上第一臺紫外可見分光光度計儀器，是由美國的Beckman公司于1945年推出，隨著科學技術的發(fā)展，紫外可見分光光度計儀器得到了飛速發(fā)展。自動化程 度大大提高。特別是計算機及其計算機軟件更是日新月異。許多高檔紫外可見分光 光度計，如美國的 Cary6000、Lambda9O0國產(chǎn)的TU-1901等紫外可見分光光度 計，一開機儀器就進行全方位的自