精編湖南農業(yè)大學基因工程重點,更具老師整理

1、1909年，丹麥生物學家，創(chuàng)造了基因（gene）詞1944年，美國著名微生物學家 O.T.Avery證明了基因的物質基礎是DNA1953年，J.Watson和F.Crick的DNA雙螺旋結構模型，揭示了 DNA的分子結構特別是 DNA半保留復制規(guī)律。DNA的半保留復制復制子：由復制起點開始合成的一段DNA序列。復制起點：在大腸桿菌中其復制起點由245個堿基對組成，由兩段保守的重復序列組成。1958 年，F(xiàn).Crick提出了描述DNA、RNA 和蛋白質三者關系的所謂中心法則（cen traldogma）5.基因的表達與調控（操縱子學說）基因依其功能差別可以分成調節(jié)基因、操縱基因和結構 基因三大類

2、。一、基因工程的概念是指按照人們的科研或生產需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遺傳物質（DNA片段），在體外切割、拼接形成重組DNA，然后將重組 DNA與載體的遺傳物質重新組合，再將其引入到沒有該DNA的受體細胞，進行復制和表達，生產出符合人類需要的產品或創(chuàng)造出新性狀，并能穩(wěn)定地遺傳給下一代。供體、受體和載體稱為基因工程的三大要素。技術上的三大發(fā)明：DNA分子的體外切割與連接技術、基因工程載體的使用、DNA分子的核苷酸序列分析技術、瓊脂糖凝膠電泳和Southern轉移雜交等技術基因工程的主要研究內容或步驟分、從復雜的生物有機體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。切、在體外

3、，用限制性內切核酸酶切割目的基因和基因載體，以利于將兩者連接形成重組體接、在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復制并具有選擇記號的載體分子上，形成重組 DNA分子。轉、將重組DNA分子轉移到適當?shù)氖荏w細胞（亦稱寄主細胞），并與之一起增殖 篩、從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組 DNA分子的受體細胞克隆 表。外源基因的高效表達的措施 ：1、提高外源基因的劑量2、篩選、修飾充足基因表達的轉錄調控元件：啟動子，增強子，上游調控序列，操作子， 終止子3、修飾和構建蛋白質生物合成的翻譯調控元：選擇、修飾和重組核糖體結合位點及密碼子 等mRNA的翻譯調控原件，強化受體細胞中蛋白的生物

4、合成過程。這些涉及到基因表達調 控的分子生物學原理。4、工程菌的穩(wěn)定生產與增殖：合理控制微型生物反應器的增值速度和最終數(shù)量。第二章基因操作基本技術第一節(jié)凝膠電泳技術電泳是指帶電粒子在電場中向與自身帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象。電泳技術 就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異， 使帶電分子產生不同的遷移速度，從而對樣品進行分離、鑒定或提純的技術。一、電泳的基本原理在溶液中任何一個帶電顆粒在電場作用下的移動大致要受到三方面的影響： 顆粒的性質，如：實際電荷，大小及形狀，解離強度的難易等。 所處的環(huán)境，如：電解質或緩沖液的濃度，離子強度，pH，粘度，

5、溫度等。 應用電場的性質，如：電場強度不同帶電顆粒在同一電場中泳動的速度不同，常用泳動度或遷移率來表示，遷移率是指帶電顆粒電場強度下泳動的速度。三、電泳的分類按有無固體支持物區(qū)分又可以分為：自由電泳和支持物電泳 兩大類四、凝膠電泳色（1 ）瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物，是由D 半乳糖和3、6 脫水一L半乳糖結合的鏈狀多糖。1瓊脂糖凝膠電泳的原理概述在pH值為8.08.3時，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負電，在電泳時向正極移動。 采用適當濃度的凝膠介質作為電泳支持物，在分子篩的作用下， 使分子大小和構象不同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大的差異，從而達到分離

6、核酸片段檢測其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。瓊脂糖之間以分子內和分子間 氫鍵形成較為穩(wěn)定的交聯(lián)結構， 低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。2、DNA分子的遷移速率由下列多種因素決定:1 ） DNA的分子大?。壕€狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與 DNA分子量成反比。分子越大 則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中泳動， 因而遷移得越慢。分子越小，所受阻力越小， 遷移得越快。2）凝膠濃度凝膠濃度直接影響凝膠的孔徑。濃度越高，孔徑越小，其分辨力越強。DNA分子電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關系。3）D

7、NA分子的構型相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的，共價閉合環(huán)環(huán)狀 DNA （ cccDNA） 直線 DNA （ LDNA） 開環(huán)的雙鏈環(huán)狀 DNA（ocDNA）。4）電源電壓一般電壓不得超過 5v/cm 。5）離子強度影響在沒有離子存在時（如誤用蒸餾水配制凝膠）,電導率最小，DNA幾乎不移動，在高離子強度的 緩沖液中（如誤加10 X電泳緩沖液）,則電導很高并明顯產熱，嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。2）緩沖液系統(tǒng)常用的電泳緩沖液有 EDTA （ pH8.0 ）和Tris-乙酸（TAE）, Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸 （TPE ）等，濃度約為 5

8、0mmol/L（pH7.57.8）。3）凝膠的制備以稀釋的電極緩沖液為溶劑，用沸水浴或微波爐配制一定濃度的溶膠，灌入水平膠框或垂直膠膜，插入梳子，自然冷卻。4 ）樣品配制與加樣DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內含有0.25%溴酚藍或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%10%甘油，以增加其比重，使樣品集中5）電泳5V/cm 。為了獲得電泳分離 DNA片段的最大分辨率，電場強度不宜高于6）染色和拍照常用熒光染料溴乙錠（EB）染色，在紫外光下觀察DNA條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統(tǒng)輸出照片，并進行有關的數(shù)據(jù)分析。EB：即卩3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲錠溴鹽

9、，（EthidiumBromide） 。它能夠插入 DNA 分子中的堿基對之間而與 DNA結合。由于EB分子的插入，在波長為300nm的紫外光的照射下，凝膠電泳中的 DNA條帶呈現(xiàn)出熒光，易于檢測?？梢詸z測10ng的DNA。（四）脈沖電場凝膠電泳一般瓊脂糖凝膠電泳只能分離小于20kb的DNA。這是因為在瓊脂糖凝膠中，DNA分子的有效直徑超過凝膠孔徑時， 在電場作用下，迫使DNA變形擠過篩孔，而沿著泳動方向伸直， 因而分子大小對遷移率影響不大。如此時改變電場方向，則DNA分子必須改變其構象，沿新的泳動方面伸直，而轉向時間與 DNA分子大小關系極為密切。（2 ）聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠濃度及其分離范

10、圍分離DNA 大小的范圍為 1-1000bp蛋白質電泳中SDS凝膠檢測常采用的染色方法有考馬斯亮藍、硝酸銀染色、熒光染色法銀染的機制：來源于攝影銀染技術，是將蛋白分子結合的銀離子還原作成金屬銀。優(yōu)點:檢測靈敏度高，較普通考馬斯亮藍染色靈敏度要高50-100倍，可在蛋白質中找到含量較低的蛋白，而且所需的上樣量較少（每點僅需0.1 ng ）。缺點:可重復性差耗費人力質譜測定有一定的干擾 聚丙烯酰胺凝膠的主要優(yōu)點: 也 分辨率高。具有三種效應：濃縮效應，分子篩效應，電荷效應；長度僅僅相差0.2 % （即500bp中的1bp）的DNA分子即可分開；（例）曲所能裝載的DNA量遠遠大于瓊脂糖凝膠；曲從聚丙

11、烯酰胺凝膠中回收的 DNA純度很高。/可根據(jù)被分離物質的分子大小控制凝膠濃度制成不同孔徑的凝膠。曲丙烯酰胺較穩(wěn)定，無色透明，機械強度好，易觀察，可用檢測儀直接測定。5、等電聚焦：在某一 PH下，蛋白質分子在電場中不再移動，即靜電荷為零，則此PH值即為該蛋白質的等電點。/ 優(yōu)點： 分辨率很高； 樣品可混入膠中或加在任何位置，在電場中隨著電泳的進行區(qū)帶越來越窄，克服了一般電泳的擴散作用。 電泳結束后，可直接測定蛋白質pI。 分離速度快，蛋白質可保持原有生物活性?？側秉c：諭電泳中應使用無鹽樣品溶液，否則高壓中電流太大而發(fā)熱。但無鹽時有些蛋白質溶解性能差易發(fā)生沉淀，可在樣品中多加些兩性電解質。必許多蛋

12、白質在pI附近易沉淀而影響分離效果，可加些脲或非離子去垢劑解決。蛋白質雙向電泳中 SDS凝膠檢測常采用的染色方法有 考馬斯亮藍、硝酸銀染色、熒光染色 法、免疫染色法以及蛋白質印跡法。8、蛋白質印跡蛋白質印跡方法將高分辨率的電泳技術與靈敏的、專一的免疫探測技術結合起來，用針對蛋白特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針進行檢測對于蛋白質，通常使用的探針是抗體，它與附著于固定基質上的靶蛋白發(fā)生特異性反應 9、免疫電泳1、抗原抗體特異性反應。2、抗原在PH8.6時通常帶強負電，而抗體不帶電。3、抗原在含有抗體的凝膠中電泳時發(fā)生免疫反應，抗原過量，僅產生可溶性的免疫復合物與抗原一起向陽極移動。4、抗原與抗體

13、濃度達到當量點時，形成免疫沉淀帶。免疫電泳：是將區(qū)帶電泳與雙向免疫擴散相結合的一種免疫化學分析技術。先將蛋白質抗原在瓊脂平板上進行電泳， 使不同的抗原成分因所帶電荷、分子量及構型不同，電泳遷移率各異而彼此分離。然后在與電泳方向平行的瓊脂槽內加入相應抗體進行雙向免疫分散。分離成區(qū)帶的各種抗原成分與相應抗體在瓊脂中擴散后相遇，在二者比例合適處形成肉眼可見的弧形沉淀線。根據(jù)沉淀線的數(shù)量、位置和形狀，與已知的標準（或正常）抗原抗體形成的沉淀線比較，即可對樣品中所含成分及其性質進行分析、鑒定。對流免疫電泳：雙向免疫擴散與電泳相結合的技術。在pH8.6的緩沖液中，抗原向正極泳動；而抗體大部分屬于Ig，由于

14、分子量大，暴露的極性基團較少，在離子瓊脂中泳動緩慢， 同時受電滲作用的影響向負極泳動（電滲使液體向負極泳動）在抗原抗體相遇的最適比例處形成乳白色沉淀線。由于電場的作用，限制了抗原、抗體的自由擴散，而使其定向泳動，因 而增加了試驗的靈敏度，并縮短反應時間。此法操作簡便，僅需3060分鐘，靈敏度比雙向擴散高1015倍；但缺點是特異性不如雙向瓊脂擴散高。火箭免疫電泳：是將單向免疫擴散和電泳相結合的一種定量檢測技術。電泳時，含于瓊脂凝膠中的抗體不發(fā)生移動， 而在電場的作用下促使樣品中的抗原向正極泳動。當抗原與抗體分子達到適當比例時，形成一個形狀如火箭的不溶性免疫復合物沉淀峰，峰的高度與撿樣中的抗原濃度

15、呈正相關。 因此，當瓊脂中抗體濃度固定時，以不同稀釋度標準抗原泳動后形成的沉淀峰為縱坐標，抗原濃度為橫坐標，繪制標準曲線。根據(jù)樣品的沉淀峰長度即可計算出待 測抗原的含量；反之，當瓊脂中抗原濃度固定時，便可測定待測抗體的含量（即反向火箭免疫電泳）。DNA序列分析法：雙脫氧末端終止測序法十二烷基磺酸鈉 SDS :是一種陰離子去污劑，它在水溶液中以單體和分子團的混合形式存 在。這種陰離子去污劑能破壞蛋白質分子之間以及與其他物質分子之間的非共價鍵，使蛋白質分子內的二硫鍵被還原劑打開并不易再氧化，這就保證了蛋白質分子與SDS充分結合從而形成帶負電荷的蛋白質-SDS復合物。第四章基因工程載體載體：是一類可

16、供外源 DNA插入并攜帶重組 DNA分子進入適當宿主細胞的DNA分子。絕大多數(shù)分子克隆實驗所使用的載體是DNA雙鏈分子。它的本質是 DNA復制子。復制子（Replicon） : DNA中發(fā)生復制的獨立單位稱載體的功能：1. 為外源基因提供進入受體細胞的轉移能力。2. 為外源基因提供在受體細胞中的復制能力或整合能力。3. 為外源基因提供在受體細胞中的擴增和表達能力。一個理想的載體至少應具備以下幾個條件：（1 ）能自我復制并能帶動插入的外源基因一起復制。（2 ）具有合適的限制性內切酶位點。（3）具有合適的篩選標記，如抗藥性基因等。（4 ）在細胞內拷貝數(shù)要多，這樣才能使外源基因得以擴增。（5 ）載體

17、的相對分子質量要小，這樣可以容納較大的外源DNA插入片段。（6 ）在細胞內穩(wěn)定性高，這樣可以保證重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失?？寺≥d體的基本結構1）至少有一個 復制起點，因而至少可在一種生物體中自主復制；2） 至少應有一個 克隆位點，以供外源DNA插入；多克隆位點區(qū)（multiplecloningsiteMCS）。即載體上人工合成的含有多種限制性核酸內切酶的酶切位點DNA片段。3） 至少應有一個選擇標記基因，以指示載體或重組 DNA分子是否進入宿主細胞。標記基因的功能是：指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。指示哪些細胞是轉化細胞。標記基因的種類：1）抗性標記基因：抗生素抗性基因氨芐青霉

18、素抗性基因（Ampr ）、四環(huán)素抗性基因（Ter）、氯霉素抗性基因（Cmlr ）、卡那霉素抗性基因（Kanr ）、G418抗性基因（G418r ）、潮霉素抗性基因（Hygr ）、新霉素抗性基因（Neor ）。ii. 重金屬抗性基因。目前所用的重金屬抗性基因有：銅抗性基因（Cur），鋅抗性基因（Znr），鎘抗性基因（Cdr）。iii. 代謝抗性基因?？钩輨┗?，胸苷激酶基因（TK）。2） 營養(yǎng)標記基因。這類基因主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因， 如色氨酸合成酶基因（TRP1），尿嘧啶合成酶基因（URA3），亮氨酸合成酶基因（LEU2），組氨 酸合成酶基因（HIS4）等。3

19、）生化標記基因。這類標記基因的表達產物可催化某些易檢測的生化反應，常用的基因有B-半乳苷酶基因（lacZ ）、葡萄糖苷酸酶基因（GUS ）、氯霉素乙酰轉移酶基因（CAT ）。 載體類型從構建載體的DNA來源分，有質粒載體、病毒載體、噬菌體載體、黏粒載體、噬菌粒載體、 人工染色體等。從應用范圍分，有表達載體、克隆載體、啟動子探測載體、轉化載體、穿梭載體、測序載體、 多功能載體等。從表達所用的受體細胞分，有原核細胞和真核細胞載體，大腸桿菌載體、酵母載體、植物細胞載體和動物細胞載體。質粒載體噬菌體載體：噬菌體絲、狀噬菌體粘粒載體綜合型載體細菌與酵母人工染色體第一節(jié)質粒載體質粒載體是以質粒的各種元件為

20、基礎組建而成的基因工程載體。它必須包含3種共同的組成成分。復制必需區(qū)、選擇標記基因和限制性核酸內切酶的酶切位點（克隆位點）。一、質粒的種類質粒是存在于細胞中的一類獨立于染色體外的自主復制的共價、閉合、環(huán)狀雙鏈DNA分子, 其大小通常為1-500kb范圍內。1 ） F質粒：又稱F因子或性質粒。它們能夠使寄主染色體上的基因和F質粒一道轉移到原先不存在該質粒的受體細胞中。2）R質粒：通稱抗藥性因子。編碼一種或數(shù)種抗菌素抗性基因，并且能將抗性轉到缺乏該質粒的受體細胞，使后者也獲得該抗性。3） Col質粒：大腸桿菌素因子。編碼抗制大腸桿菌素（可使不帶Col質粒的親緣關系的細 菌菌株致死的蛋白質）合成的基

21、因。雙鏈的質粒DNA分子具有三種不同的構型：1. 當其兩條鏈均保持著完整的環(huán)形結構時，稱之為共價閉合環(huán)形 DNA ,（CCC）這樣的DNA通常呈超螺旋的構型（SC）；2. 如果兩條核苷酸鏈中只有一條保持完整的環(huán)形構型，另一條鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個缺口時，稱之為開環(huán) DNA （ OC）；3. 若雙鏈均發(fā)生斷裂而形成線性分子，則通稱為L構型。質粒的基本特征1） 自主復制性。質粒DNA含有自己的復制起始位點（Origin，簡稱ori ）以及控制復制頻 率的調控基因，有些質粒還攜帶特定的復制因子編碼基因，形成一個獨立的復制子結構。有些質粒處于“嚴緊控制”之下，即它們的復制是同宿主細胞的復制偶聯(lián)同步的。因此在

22、每個細胞中的質粒只有一份拷貝，或最多只有幾份拷貝。這稱為“嚴緊型”質粒。另一些質粒則是處于“松弛控制”之下的“松弛型”質粒。每個細菌中可以有101000份拷貝。更重要的是松弛型質粒的拷貝數(shù)可因宿主細胞停止合成蛋白質而增加至幾千份。宿主細胞不合成蛋白質時，染色體和嚴緊型質粒的復制都中止。但松弛型質粒仍繼續(xù)進行復制。2）可轉移性。tra基因mob基因部分質粒含有tra基因，指令宿主細胞產生菌毛，合成細胞表面物質，促使宿主細胞與受體細胞接合，導致遺傳物質從一個細胞轉移到另一細胞中。含tra基因的質粒稱為接合質粒。部分質粒雖不含有tra基因，但是有bom位點，當宿主細胞同時存在含有mob基因的輔助質粒

23、和接合質粒時，mob基因產物可打開非接合質粒的bom位點，借助于接合質粒tra基因的產物，使非接合質粒被動遷移到受體細胞中，這種由共存的接合型質粒引發(fā)的非接合型質粒的轉移過程稱為遷移作用。3 ）不相容性：在無選擇壓力下，兩種親緣關系密切的不同質粒不能共存于同一宿主的現(xiàn)象。質粒DNA的提取：1. 氯化銫密度梯度離心法：在細胞裂解和分離 DNA的過程中，大分子量的細菌染色體DNA容易發(fā)生斷裂形成相應的線性DNA片段，而質粒 DNA則由于其分子量小、結構緊密仍保持完整的環(huán)狀分子。當將含有溴化乙錠（EB）的氯化銫溶液加入大腸桿菌裂解液中，EB扁平分子就會插入到堿基對間而結合在 DNA鏈上，并因此導致雙

24、螺旋結構發(fā)生解旋。線性和開環(huán)的分子，因其具 有游離末端而易于解旋，故可結合大量的EB分子。而質粒由于具有共價閉合環(huán)狀的結構，沒有游離的末端，只能發(fā)生有限的解旋反應，結果限制了EB分子結合的數(shù)量。因此染色體DNA片段要比質粒 DNA結合更多的EB分子。在EB-DNA復合物中，結合的EB分子越多 起密度越低。因此在 EB達到飽和濃度的條件下，質粒DNA-EB復合物比線性DNA-EB復合物具有更高的密度，通過氯化銫密度梯度離心后，它們將停留在不同的位置。2. 堿裂解法在pH值介于12-12.5間時，線性DNA雙鏈間的氫鍵斷裂變成兩條完全分開的單鏈。雖然質粒cccDNA雙鏈間的氫鍵也斷裂，但兩條單鏈并

25、沒有完全分開，仍然緊密的結合在一起。一旦pH值恢復成中性，線性 DNA和質粒cccDNA 度都會復性，質粒 cccDNA 兩條單鏈 并沒有完全分開，因此復性快速而準確。但線性DNA兩條單鏈完全分開，復性作用就沒有cccDNA那樣快速和準確，它們聚集形成線性網絡結構，通過離心便和變性的蛋白質及RNA分子一起沉淀下來。三構建理想質粒載體必須具備的條件1）分子量較小2 ）具有復制起始點3）帶有可供選擇的標記4 ）帶有盡可能多的單一限制性酶切位點5 ）質?？截悢?shù)較高6）缺失mob基因7 ）插入外源基因的重組質粒較易導入宿主細胞并復制和表達選擇標記：抗生素作用機制：氨芐青霉素一與細菌膜上的與細胞壁合成有

26、關的酶類結合并抑制其活性。而氨芐青霉素抗 性基因（Amp r）編碼的酶可水解B -內酰胺環(huán)，從而解除氨芐青霉素的毒性。四環(huán)素一與核糖體30S亞基的一種蛋白質結合，從而抑制核糖體的轉位。而四環(huán)素抗性基 因（tetr）編碼一個膜結合蛋白，可阻止四環(huán)素進入細胞。氯霉素一與核糖體50S亞基結合并抑制蛋白質合成。氯霉素抗性基因（ Cmlr或cat）編碼 一個四聚體細胞質蛋白，在乙酰輔酶A存在的條件下，該蛋白催化氯霉素羥乙酰氧基衍生物的形成，使之不能與核糖體結合而解毒?？敲顾睾托旅顾匾皇且活惻c30S核糖體結合并抑制蛋白質合成的脫氧鏈霉胺氨基糖苷， 可被氨基糖苷磷酸轉移酶所滅活。載體上帶有一個來自大腸桿菌

27、的lac操縱子的DNA區(qū)段（細菌lac操縱元中的lacI基因，啟動子和lacZ的 肽基因），即lacZ'基因，lacZ'基因編碼B -半乳糖苷酶N端146個氨基酸 的（肽）。宿主菌具有缺失突變 LacZ基因，合成的是一種缺失 N端11-41氨基酸的缺陷 性的B-半乳糖苷酶，簡稱3肽。由于缺失故不能將無色底物 X-gal水解成藍色物質。若將帶 有l(wèi)acZ'基因的載體導入該宿主，當培養(yǎng)基中含有誘導物IPTG和生色底物X-gal時，lacZ'基因被誘導表達產生的B -半乳糖苷酶 N端 肽與宿主菌表達的3肽實現(xiàn)基因內的互補而產 生具有活性的B -半乳糖苷酶。質粒和宿主編

28、碼的肽段各自都沒有酶活性，兩者由于功能互補而具有B -半乳糖苷酶活性，這種現(xiàn)象成為稱為-互補（a compleme ntati on）。3-半乳糖苷酶水解X-gal而使菌落呈現(xiàn)藍色，在lacZ'的5'端又插入了一段人工設計合成的DNA序列MCS ,當外來序列插入后則破壞了lacZ'編碼的半乳糖苷酶氨基端片段活性，從而破壞了互補作用，生長的菌落就呈白色，這種顏色標志的變化就很容易區(qū)分和挑選含有和不含有 插入序列或基因的轉化菌落，稱為藍白篩選法。插入失活：因DNA插入而導致基因失活的現(xiàn)象 。四質粒載體的改造與構建 早期：pSC101,ColE1和pCR1缺點：復制效率低；選

29、擇標記不合適；限制性酶切位點少（<2 ）發(fā)展期：pBR313優(yōu)點：松弛型復制；兩個選擇標記（ tetr和amp r）缺點：太大成熟期：pBR322 （4.36kb ）衍生質粒長度盡可能?。恨D化效率高（<15kb ）;容納外源DNA長；復制拷貝數(shù)高。限制性酶切位點盡可能多：多克隆位點（MCS）。輔助序列：肉眼鑒定重組克隆；外源蛋白質表達。五常用的質粒載體1）pSC101 質粒2）pBR322 質粒載體3）pUC系列pBR322質粒作為克隆載體的缺陷：一是很多常用的限制性內切酶沒有單一切點；二是選擇重組子和轉化子時費時又繁瑣。一種典型的pUC系列的質粒載體，包括如下四個組成部分：（1

30、）來自pBR322質粒的復制起點（ori）；（2 ）氨芐青霉素抗性基因，但它的DNA核苷酸序列已經發(fā)生了變化，不再含有原來的核酸內切限制酶的單識別位點；（3 ）大腸桿菌-半乳糖苷酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼該基因氨基端-肽鏈的DNA序列，此結構特稱為lacZ'基因；（4）位于lacZ'基因中的靠近5'端的一段多克隆位點（MCS）區(qū)段。pUC系列的優(yōu)點：a:具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。（500-700copy/cell ）；b:引入人工合成的具有多個限制性內切酶位點的序列，使質粒上帶多個限制酶的單一切點；多克隆位點（MCS:Multi-cloningSite）；

31、c:引入細菌染色體上乳糖操縱元的一段區(qū)域，使轉化子可以實現(xiàn)藍白篩選。4 ）穿梭質粒載體： 人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇標記而可在兩種不同的寄主中存活和復制的質粒載體。如：大腸桿菌-啤酒酵母穿梭質粒載體。5 ）表達質粒載體：專用于在宿主細胞中高水平表達外源蛋白質的質粒載體。除具有一般載體的基本特性外，還需要如啟動子，核糖體結合序列（ S-D序列），轉錄終止子。目的基因 必須處于正確的閱讀框架中。7.T載體（T-A克?。? T-vector兩條鏈的5 '端含有一個游離的 T?PCR過程中，普通的 Taq酶在產物的3 '端多加一個 A第二節(jié)病毒（噬菌體）載體一.-雙鏈DNA噬

32、菌體載體三.單鏈DNA噬菌體載體噬菌體（bacteriophage,phage） :是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒。噬菌體具有病毒的一些特性：個體微小，可以通過濾菌器；沒有完整的細胞結構， 主要由蛋白質構成的衣殼和包含于其中的核酸組成； 只能在活的微生物細胞內復制增值， 是一種專性 細胞內寄生的微生物。噬菌體分布極廣，凡是有細菌的場所，就可能有相應的噬菌體的存在。一.-雙鏈DNA噬菌體載體諭噬菌體是一種中等大小的溫和噬菌體。DNA為線狀雙鏈分子，長度為48502bp。迄今已經定位的噬菌體的基因至少有 61個，其中有一半左右參與了噬菌體生命周期的活動- 噬菌體的必要基因。/另一部

33、分基因，當它們被外源基因取代之后，并不影響噬菌體的生命功能 -噬菌體的非必要的基因。諭DNA兩端具有由12個核苷酸組成的粘性末端（這種由粘性末端結合形成的雙鏈區(qū)段稱為cos位點）。當噬菌體感染宿主細胞后，雙鏈 DNA分子通過COS而成環(huán)狀。諭噬菌體可以進行體外包裝，只要被包裝DNA在36.4 50.9kb的雙鏈處有兩個COS序列?？侱NA可通過噬菌體特異性感染高效進入宿主細胞或受體細胞，以及-DNA在大腸桿菌細胞中的高拷貝復制，這是-DNA在分子克隆技術發(fā)展早期就被選作載體使用的原 因。重組噬菌體分子的體外包裝所謂 DNA的體外包裝，就是在試管中完成噬菌體在寄主細胞內的全部組裝過程。其基本 原

34、理是：噬菌體頭部和尾部的裝配是分開進行的。頭部基因發(fā)生了突變的噬菌體只能形成尾部，而尾部基因發(fā)生了突變的噬菌體只能形成頭部。將這兩種不同突變型的噬菌體提取物混合起來，就能夠在體外裝配成有生物活性的噬菌體顆粒。Ter體系：位點特異的切割體系，能識別兩個相距適宜的cos位點，將多連體分子切割成入單位長度的片段，并將它們包裝到入噬菌體頭部中去。包裝限制：噬菌體頭部外殼蛋白質容納DNA的能力：75%-105% ;包裝底物：多連體的DNA分子。1 ) DNA載體的構建：(1 )縮短野生型 -DNA的長度，提高外源 DNA片段的有效裝載量。-DNA的包裝范圍為-DNA 總長度的 75%-105%(36.4

35、 50.9kb )。(2 )刪除重復的酶切位點，引入單一的多酶切位點接頭序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性。(3 )滅活某些與裂解周期有關基因，使-DNA載體只能在特殊的實驗條件下感染裂解宿主細菌，以避免可能出現(xiàn)的生物污染現(xiàn)象的發(fā)生。(4 )引入合適的選擇標記基因，便于重組噬菌體的檢測2) 噬菌體載體的主要類型(i) 插入型載體：只具有一個限制性內切酶位點以便于外源DNA的插入。外源的DNA克隆到插入型的載體分子上，會使噬菌體的某種生物功能喪失效力，即所謂的插入失活效應。根據(jù)插入失活效應的特異性， 插入型的 載體分為免疫功能失活和大腸桿菌B-半乳糖苷酶失活兩種亞型。插入型載體的長度正好是噬

36、菌體包裝的下限，因為本身也能被包裝，因而所承受的外源插入DNA片段較小(014.5kb )( 50.9-36.4 )，一般在10kb以內，廣泛應用于 cDNA及小 片段DNA的克隆。利用這類載體必須使用載體所攜帶的選擇標記基因來篩選重組噬菌體。(ii )替換型載體又叫做取代型載體：具有兩個限制性內切酶位點，其中央的DNA區(qū)段可以被外源DNA分子所取代的克隆載體。取代型載體的-DNA分子長度約為40kb，在其非必需區(qū)域內含有兩個相同的酶切口，兩者間的距離為14kb，使用時用酶切開載體分子，分離去除非必需DNA片段，然后用外源DNA片段取而代之，形成重組分子。這類載體的裝載量不僅比插入型載體大，而

37、且被克隆的DNA片段必定在10.4kb24.9kb之間(去除I4kb非必需DNA片段后的載體片段總長為 26kb)。取代型載體不再需要標記基因，因為空的載體分子只有26kb，不能被包裝成成熟的噬菌體顆粒。含有小于10kb和大于25kb外源DNA片段的重組分子也不能形成噬菌斑。3) 重組噬菌體的篩選與質粒載體不同，噬菌體載體不具有抗菌素抗性選擇記號。對重組體分子的選擇，主要是依據(jù)噬菌斑的形態(tài)學特征和X-gal-IPTG 顯色反應作出判斷的。(i) cI基因功能選擇法：cl基因編碼的阻遏蛋白質，是促使感染了大腸桿菌的噬菌體在寄主細胞進入溶源化狀態(tài)的必要條件。如果在噬菌體載體的cI基因區(qū)域插入了或替

38、換了外源DNA片段，重組體分子的表型將是cl-,重組噬菌體因不能建立溶源狀態(tài)形成透明噬菌斑；而非重組體分子的則是 c I +表型,重組體分子。形成混濁型的噬菌斑。所以，根據(jù)噬菌斑形態(tài)學特征的差異，便可以選擇出(ii) LacZ基因功能選擇法：根據(jù)lacZ基因編碼產物B -半乳糖苷酶在 X-gal-IPTG 培養(yǎng)基 平板上顯色反應的原理，并且在某些噬菌體載體的lacZ基因中，引入了若干常用的核酸內切限制酶識別位點。當外源DNA片段插入到這些克隆位點時，形成的是無功能活性的B -半乳糖苷酶。于是被感染的大腸桿菌寄主細胞，就將在含X-gal-IPTG 的培養(yǎng)基平板上形成無色的噬菌斑；而相反的，只噬菌

39、體載體將會形成藍色的噬菌斑(iii) Spi-選擇法(SensitivetoP2inhibition):基本原理： 噬菌體的red和gam 基因的編碼產物，會抑制噬菌體在P2噬菌體溶源性的大腸桿菌細胞中正常生長，其表型為Spi+。而red-gam-突變型的噬菌體，卻可以在 P2溶源性的細菌中正常生長并形成噬菌斑，即Spi-。4) 重組噬菌體分子導入受體細胞轉染： 重組體DNA分子直接感染大腸桿菌，使之侵入寄主細胞內。5) 質粒和噬菌體載體比較：質粒載體克隆外源 DNA片段的大小一般不超過15Kb ;噬菌體載體容納的外源DNA片段較大；以感染途徑進入宿主細胞的效率比轉化高；但對克隆基因的分析鑒定

40、較難。6) 常用的噬菌體載體lambdagt10 插入型載體、Iambdagt11插入型載體容量：5kb，適用于cDNA文庫構建EMBL3替換型載體9-23kb 的置換容量二柯斯質粒載體柯斯質粒載體又稱粘粒是一類由人工構建的含有DNA的cos序列和質粒復制子的特殊類型的質粒載體。1) 柯斯質粒的特點：(i )具有噬菌體的特性：在克隆了外源片段后可在體外被包裝成噬菌體顆粒，高效地感染對入噬菌體敏感的大腸桿菌細胞。（ii）具有質粒載體的特性：在寄主細胞內如質粒一樣進行復制，攜帶有抗性基因和克隆位 點，并具氯霉素擴增效應。（iii ）具有高容量的克隆能力柯斯質粒用于克隆大片段的DNA分子特別有效2）

41、柯斯質粒的優(yōu)越性：1高效進入受體細胞內 2柯斯質粒可以大規(guī)模擴增 3具有很強的選擇性 4質粒上的選擇性 標記可直接用來篩選感染的轉化細胞。與-噬菌體DNA不同的是：柯斯質粒重組分子進入受體細胞后，依靠質粒DNA部分的復制子結構進行自主復制，其拷貝數(shù)取決于質粒本身的性質，而且由于重組分子失去了體內包裝的能力，故其分離純化只能采用質粒的方法。3）柯斯克隆應用柯斯質粒載體，在大腸桿菌細胞中克隆大片段的真核基因組DNA技術，叫做“柯斯克隆”。三.單鏈M13DNA 噬菌體載體M13基因組為環(huán)狀單鏈 DNA，大小為6407bpM13噬菌體有下述特點： 不論是RFDNA還是單鏈DNA，都能夠轉染感受態(tài)的大腸

42、桿菌； M13單鏈DNA噬菌體可大可小，只受 DNA的大小控制。因此 M13不受外殼蛋白的包 裝限制。 RFDNA可作為克隆載體使用，單鏈 DNA適合測序等。2.M13單鏈DNA噬菌體載體的構建1) 在IG內插入一個大腸桿菌的lac操縱子片段。2) 在M13mp2的EcoRI位點上，加入一種化學合成的具有多克隆位點的多聚銜接物(polyli nker)，使其成為適用于多種核酸內切限制酶的克隆載體。M13克隆載體的缺陷 是克隆外源DNA的能力較小，一般只適于克隆3004OObp的外源DNA片段，其最大容量1500bp。插入外源片段后，遺傳穩(wěn)定性下降。第三節(jié)噬菌粒載體噬菌粒載體：一類由質粒載體和單

43、鏈噬菌體而成的新型載體系列。它們均具有以下的基本結構：(1 )在多克隆位點區(qū)(MCS)的兩側，存在一對 T3和T7噬菌體的啟動子，用以定向地指導 插入在多克隆位點上的外源DNA或(基因)的轉錄活動；(2 )同時具有一個單鏈噬菌體M13或f1的復制起點和一個來自ColE1質粒的復制起點，pBluescript噬菌粒載體便可按照不同的復制形式分別合成出單鏈或雙鏈的DNA ;(3)編碼有一個氨芐青霉素抗性基因，供作轉化子克隆的選擇記號；(4 )含有一個lacZ基因，可以按照 Xgal-IPTG 組織化學顯色反應法篩選噬菌粒載體的重 組子。酵母人工染色體染色體含有三種必需成分：著絲粒、端粒和自主復制序

44、列。著絲粒(CEN)在有絲分裂時結合微管并調控染色體的運動，接收細胞信號而使姐妹染色體分開到各子細胞中去。端粒(TEL):主要功能是防止染色體融合、降解、確保其完整復制。維持染色體的穩(wěn)定。自主復制序列(ARS),即復制起點：DNA復制通常由起始蛋白與該序列相互作用開始，含有酵母菌中DNA進行雙向復制所必須的信號。無義突變：由于一對或幾對堿基對的改變而使決定某一氨基酸的密碼子變成一個終止密碼子 的基因突變叫無義突變。其中密碼子改變?yōu)?UAG的無義突變又叫琥珀突變，密碼子改變成 UAA的無義突變又叫赭 石突變。細菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC):用

45、F質粒及其調控基因構建細菌載體，克隆大片段DNA。是通過去除了 F質粒的轉移區(qū)及整合區(qū)等復制非必需區(qū)段，并引入了多克隆位點及選擇標記而構成的。BAC的優(yōu)點1.易于用電擊法轉化E.coli (轉化效率比轉化酵母高10-100倍)；2 .超螺旋環(huán)狀載體，易于操作；3 . F質粒本身所帶的基因控制了質粒的復制；4 .很少發(fā)生體內重排，穩(wěn)定；5. 克隆容量可達300kb。第三節(jié)表達型載體1.基因表達的過程轉錄是基因表達的第一步，是遺傳信息從DNA分子轉移到RNA分子的過程?；虮磉_的第二步是轉譯，是mRNA分子指導蛋白質多肽鏈合成的過程。基因的編碼區(qū)叫做開放閱讀框架表達型載體：包括轉錄起始必需的啟動子

46、、翻譯起始所必需的核糖體識別序列，正確的閱讀框架等。3 .分泌型表達載體4 .原核生物的表達載體大多數(shù)原核生物表達載體的啟動子主要是入噬菌體的Pl啟動子、大腸桿菌乳糖操縱子的lac啟動子、色氨酸操縱子的trp啟動子以及pBR322質粒的B -內酰胺酶啟動子第三章工具酶 核酸酶：通過切割相鄰的兩個核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，使核酸分子多核苷酸發(fā)生水解 斷裂的酶。核糖核酸酶(Rnase)專門水解斷裂 RNA分子，脫氧核糖核酸酶(DNase)特異水解斷裂 DNA分子。按水解斷裂核酸分子的不同方式核酸酶分為兩種類型: 核酸外切酶(exonuclease):從核酸分子的末端開始，一個核苷酸一個核苷酸地消

47、化降解多 核苷酸鏈。切害V DNA核酸內切酶(en do nuclease):從核酸分子內部切割磷酸二酯鍵使之斷裂形成小片段。限制性核酸內切酶I ra iDNA連接酶I生成3 -5 '磷酸二酯鍵DNA聚合酶I探針標記、補平 3 '末端反轉錄酶多聚核苷酸激酶5 '磷酸化、探針標記末端轉移酶3 '末端多聚尾堿性磷酸酶I切除末端磷酸基cDNA合成第一節(jié)限制性內切酶 Restrictio nEn zyme(RE)修飾作用：第二個寄主菌株賦予入噬菌體非遺傳的變化，使之再感染時能夠有效生長，而沒有再次受到限制的現(xiàn)象。限制性內切酶是 一類能夠識別雙鏈 DNA分子中的某種特定核

48、苷酸序列，并在識別位點或其附近切割DNA雙鏈的核酸內切酶。3限制酶的種類根據(jù)限制酶識別和切割 DNA的特點，可將限制酶分為 I、II、山三種類型.I型：能識別專一的核苷酸順序，在距識別點數(shù)千堿基處隨機切割DNA分子中的雙鏈。III型：有專一的識別順序。它在識別順序下游約25bp處幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對則是任意的。II型：識別專一的核苷酸順序，并在該順序內或附近的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的。所以總能得到同樣核苷酸順序的DNA片段,并能構建來自不同基因組的DNA片段，形成雜合 DNA分子。4. n型限制性核酸內切酶的基本特性：

49、4.1 n型限制性內切酶的識別序列絕大多數(shù)的n型核酸內切限制酶，都能夠識別由4 一 6個核苷酸對組成的特定的核苷酸序列，我們稱這樣的序列為核酸內切限制酶的識別序列。而限制酶就是從其識別序列內切割DNA分子的，因此識別序列又稱內切酶的靶子序列。識別序列通常具有二重旋轉對稱軸，序列呈回文結構(palindromicstructure)。即有一個中心對稱軸，從這個軸朝二個方向“讀”核苷酸順序都完全相同。識別序列在DNA分子中出現(xiàn)的頻率：如果四種堿基按完全隨機分布的原則，則某種限制性內切酶識別序列在DNA分子中出現(xiàn)的頻率為(1/4 ) nn為識別序列的核苷酸數(shù)目。4.2 n型限制性內切酶的酶切特點絕大

50、多數(shù)n型限制性內切酶在其識別順序切割雙鏈DNA，水解磷酸二酯鍵，產生3' OH和5 ' P片段。這種酶的切割可以有兩種方式。一是交錯切割，結果形成兩條單鏈末端，這種單鏈末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端 如果切點在中軸的左上側和右下側，則產生5 '突出粘性末端(cohesiveend ):5 'GJAATTC 35 'GOHpTTAAC 3'3 'CATAA 1G 5 ' EcoR I 3'CTTAApOHG 5' 如果切點在中軸的右上側和左下側，則產生3'突出的粘性末端：5 '

51、CTGCA G 3' t 5 'CTGCAOHpG 3'3 'GgCGTC 5' Pst I 3 'GpOHACGTC 5'另一種是在同一位置上切割雙鏈，產生平頭末端，即堿基配對完好的末端。5同裂酶同裂酶：來源不同的限制酶卻識別和切割相同的序列。“完全同裂酶”能識別和切割完全相同的序列，如HindIII與HsuI , (A/AGCTT ) “不完全同裂酶”雖能識別相同序列， 但切割方式不同，如Xmal和Smal。( CCCG/GG和CCC/GGG ) 6同尾酶同尾酶：來源不同的限制酶，識別及切割序列各不相同，但卻能產生出相同的粘性末端。7

52、限制酶的識別位點與切割方式之間的關系：(1 )識別順序不同，切割方式也不同；(如EcoR I和Pstl，前者產生的是5 '粘端，后者產生的是3'粘端。)(2 )識別順序不同，切割產生的粘末端相同；(同尾酶)(3)識別順序相同，切割方式不同；(如Smal與X mal)(4 )相同的識別順序，切割方式亦相同；8 .影響核酸內切限制酶活性的因素：核酸內切限制酶的單位是這樣定義的，在20ul終反應體系中，1h完全酶解1底物DNA所需要的酶量，為I個單位的內切酶(1U )。(1 ) DNA樣品的純度：純度越高越有利酶切(2 ) DNA的甲基化程度：甲基轉移酶對 DNA修飾后，使得自身 D

53、NA不受到體內限制性 內切核酸酶的酶切(3)酶切消化反應的溫度：不適合的溫度酶會失活。(4 ) DNA的分子結構：酶切超螺旋DNA和病毒DNA需要的的酶量比線性 DNA多(5 )核酸內切限制酶的緩沖液：放止酶變性(6)酶的純度：越高越好內切酶的星號活性： 在某些反應條件下，識別順序的特異性可能發(fā)生變化，可能切割一些與特異識別序列相類似的序列。促使內切酶產生星號活性的因素有多種，主要由如下一些因素引起。(1 )甘油濃度過高。這是引起星號反應的常見原因。(2 )離子強度不合適。某些內切酶需要在高鹽緩沖液中進行反應，鹽濃度降低也可能引起 星號反應。(3)陽離子變化。若將 Mg2+改為Mn 2+可能促

54、使EcoR I和Hi nd川產生星號活性。(4 )溶液中pH變化。如用EcoRI酶切時，反應溶液的 pH值由7.5升高到8.5時也會出 現(xiàn)星號反應。(5 )有機溶劑殘留的影響。9.核酸內切限制酶在分子克隆中的應用DNA重組，組建新質粒， DNA分子雜交， 制備DNA放射性探針，繪制 DNA物理圖譜，DNA序列分析，DNA甲基化堿基的 識別與切割，基因定位及 DNA同源性研究。第二節(jié)甲基化酶甲基化酶 使識別順序中的某個堿基發(fā)生甲基化，保護DNA不被限制性內切酶切開。第三節(jié)DNA連接酶DNA連接酶（ligase）:能借助ATP或NAD水解提供的能量催化 2條雙鏈DNA片段緊靠 在一起的3 '

55、;羥基末端與5 '磷酸基團末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接的酶。1. DNA連接酶的作用機理DNA連接酶與細胞內的能源分子形成復合物，“用力拉住”-P末端并將其'“送到”3 '-OH末端上，促使兩者形成磷酸二酯鍵，實現(xiàn)兩個DNA分子的連接。細胞內的能源分子主要是指煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+ ）和腺苷三磷酸（ATP ）。2連接酶的種類E.coliDNA 連接酶：簡稱DNA連接酶，是由大腸桿菌染色體編碼的。只能催化雙鏈DNA片段黏性末端之間的連接， 不能催化雙鏈DNA片段平末端之間的連接。用NAD+作能源輔 助因子。T4DNA 連接酶：是由大腸桿菌 T4噬菌體DNA

56、編碼的。既可用于雙鏈 DNA片段黏性末 端之間的連接，也能催化雙鏈DNA片段平末端之間的連接，但平末端之間連接的效率比較 低。用ATP作作能源輔助因子。連接反應的最佳溫度為 4-15 °C3. DNA片段的連接特點和連接方式（1 ）粘性末端連接：由同一限制性核酸內切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的粘性末端，或由兩種不同的限制性核酸內切酶切割的DNA片段，具有相同類型的粘性末端，都可以在DNA連接酶催化作用下形成共價結合的重組DNA分子。(2 )平末端連接：用T4DNA連接酶直接將平末端的 DNA片段連按起來，或是用末端脫 氧核苷酸轉移酶給具平末端的 DNA片段加上poly(dA)-poly(dT) 同聚物尾巴之后，再用 DNA連接酶將它們連接起來。(3 )同聚物加尾連接：運用末端脫氧核苷酸轉移酶，將