離子交換層析分離核苷酸的實(shí)驗(yàn)方法

1、CN11-2034/T實(shí) 驗(yàn) 技 術(shù) 與 管 理第28卷 第3期 2011年3月ExperimentalTechnologyandManagementVol.28 No.3 Mar.2011離子交換層析分離核苷酸的實(shí)驗(yàn)方法胡曉倩,鐘長明,陳來同(北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100871)摘 要:對傳統(tǒng)的離子交換層析分離單核苷酸實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行改革和創(chuàng)新。以強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂、采用梯度洗脫和階段洗脫對酵母RNA水解液進(jìn)行分離,利用標(biāo)準(zhǔn)核苷酸的參數(shù)確定層析峰的核苷酸種類。不但可以使學(xué)生全面掌握離子交換層析技術(shù),而且經(jīng)過對標(biāo)準(zhǔn)核苷酸性質(zhì)的研究及核苷酸的鑒定,還可將原有實(shí)驗(yàn)內(nèi)容從一個簡單的分離純化實(shí)驗(yàn)提

2、升為研究性實(shí)驗(yàn),從而有效調(diào)動了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和學(xué)習(xí)熱情,明顯提高了學(xué)生的綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)芰?。關(guān)鍵詞:核苷酸;強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂;階段洗脫;梯度洗脫中圖分類號:Q5-33 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B 文章編號:1002-4956(2011)03-0032-04Investigationoftheexperimentalmethodaboution-exchangechromatographyforisolatingnucleotidesHuXiaoqian,ZhongChangming,ChenLaitong(SchoolofLifeSciences,PekingUniversity,Beijing100871

3、,China)Abstract:Thisarticleintroducesthereform,innovationandpracticeonthetraditionalion-exchangechroma-tographymethodusedforsinglenucleotideisolationbyfullyusingoflaboratoryinstrumentsandequipment.Utilizingstrongbaseanionexchangeresinandelutingwithdifferentways,includinggradientelutionandstep-wiseel

4、ution,andaccordingtostandardparametersofnucleotide,thenucleotidesinthechromatographicpeakfromthehydrolyzateofyeastRNAcouldbeidentified.Bythedifferentexperimentalwaysaboution-exchangechromatographyseparationofsinglenucleotide,itnotonlyenablesstudentstocompletelylearnthetechniqueofion-exchangechromato

5、graphy,butalsoraisesasimpleexperimentofisolationandpurificationintoahigherlevelofresearchaboutcharacterizationofnucleotidesamples,thereforeeffectivelypromotesthestudents in-terestandenthusiasminlearningandmarkedlyincreasestheircomprehensiveexperimentalability.Keywords:nucleotide;stronglyalkalineanio

6、nexchangeresin;fractionalelution;gradientelution核苷酸是核糖核酸及脫氧核糖核酸的基本組成單位。核苷酸類物質(zhì)包括腺苷酸(AMP)、鳥苷酸(GMP)、胞苷酸(CMP)、尿苷酸(UMP)等及其衍生物,它們在醫(yī)藥、食品、保健、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)及化妝品中得到了廣泛的應(yīng)用1-2。核苷酸的生產(chǎn)方法有很多3,離子交換層析法是普遍應(yīng)用中的主要分離純化方法4。離子交換層析法是分離生物大分子有效而常用的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),一直作為本科生生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的重要內(nèi)容。隨著實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備的改善,對實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行改革和創(chuàng)新勢在必行,重新設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟、豐收稿日期:2010-05-20作

7、者簡介:胡曉倩(1964 ),女,浙江省永嘉市人,大學(xué)本科,工程師,主要從事生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)和研究工作.E-mail:huxiaoqian富實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的研究性是本文重點(diǎn)研究的內(nèi)容。1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑材料:酵母RNA;強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂(型號為201 8)(聚苯乙烯-二乙烯苯,三甲基季銨堿型),來自本院生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。試劑:4種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司);0.3mol/L氫氧化鉀溶液;2mol/L過氯酸;2mol/L氫氧化鈉溶液;0.5mol/L氫氧化鈉溶液;1mol/L鹽酸;1mol/L甲酸鈉溶液;0.2mol/L甲酸;0.15mol/L甲酸;0.02mol/L甲酸;0.01mo

8、l/L甲酸-0.05mol/L甲酸鈉溶液(pH4.44);0.1mol/L甲酸-0.1mol/L甲酸鈉溶液(pH3.74);0.2mol/L甲酸-0.2mol/L甲酸鈉溶液。化學(xué)試劑均為分析純。胡曉倩,等:離子交換層析分離核苷酸的實(shí)驗(yàn)方法332 實(shí)驗(yàn)儀器電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器廠);臺式低速離心機(jī)(上海菲怡爾分析儀器廠);玻璃層析柱(1.1cm 20cm);蛋白核酸檢測儀及記錄儀(瑞典安瑪西亞公司);自動部分收集器BS-100A(上海市滬西機(jī)電廠);雙光束分光光度計(jì)(英國UNICAM公司);磁力攪拌器(上海市滬西機(jī)電廠)。r/min離心10min;棄去沉淀,上清液用2mol/L氫氧化鈉

9、溶液調(diào)至pH=8;取出100 L用于紫外分光光度計(jì)測定核苷酸含量,其余部分用于離子交換層析分離。3.4 樹脂處理取強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂用水浸泡2h,用浮選法除去細(xì)小顆粒,并用減壓法除去樹脂中存留的氣泡;然后依次用4倍樹脂量的0.5mol/L氫氧化鈉和1mol/L鹽酸浸泡1h,除去樹脂中堿溶性和酸溶性雜質(zhì),均用去離子水洗至中性;最后用1mol/L甲酸鈉溶液將樹脂轉(zhuǎn)變?yōu)榧姿嵝汀?.5 離子交換柱的準(zhǔn)備取內(nèi)徑1.1cm、高20cm的玻璃管柱,連接蛋白核酸檢測儀及記錄儀、部分收集器;將處理好的強(qiáng)堿型陰離子樹脂201 8裝柱,最后柱床高約8cm,用1mol/L甲酸鈉平衡直至流出液不含氯離子(用1%硝酸銀

10、檢查);然后用0.2mol/L甲酸平衡,直至記錄儀基線平穩(wěn);最后用去離子水洗至流出液接近中性。3.6 離子交換層析加樣及洗脫將酵母RNA水解液上柱,用去離子水洗去未吸附的雜質(zhì),直至記錄筆回到基線,用甲酸-甲酸鈉溶液分段洗脫或梯度洗脫。3.6.1 分段洗脫法依次:用250mL、0.02mol/L甲酸,350mL、0.15mol/L甲酸,200mL、0.01mol/L甲酸-0.05mol/L甲酸鈉溶液(pH=4.44);250mL、0.1mol/L甲酸-0.1mol/L甲酸鈉溶液(pH=3.74)分段洗脫,控制流速3mL/min。部分收集器收集流出液,每個洗脫峰溶液分別用氫氧化鈉調(diào)至pH=7,然后

11、用分光光度計(jì)在230350nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,并與標(biāo)準(zhǔn)品掃描圖譜對照,確定各洗脫峰核苷酸種類,然后測定260nm處的吸光值8。3.6.2 梯度洗脫法梯度儀的混合瓶裝300mL、0.02mol/L甲酸,貯液瓶裝300mL、0.2mol/L甲酸-0.2mol/L甲酸鈉溶液,控制流速1.5mL/min,部分收集器收集流出液,每個洗脫峰溶液處理同分段洗脫法。3 實(shí)驗(yàn)方法3.1 離子交換層析法離子交換層析法是在固相(即離子交換劑)和液相之間發(fā)生的可逆性離子交換反應(yīng)。核酸經(jīng)酸、堿或酶水解可以產(chǎn)生各種核苷酸的混合物。核苷酸帶有幾種可解離基團(tuán),其中含氮環(huán)上的 NH2(除尿苷酸外)pKa2值差別較大,導(dǎo)致各個核

12、苷酸的pI值有顯著差別,所以在進(jìn)行離子交換層析時它們與離子交換樹脂的吸附能力是不同的。本實(shí)驗(yàn)以強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂,運(yùn)用梯度洗脫法和階段洗脫法對酵母RNA水解液進(jìn)行分離。首先降低RNA水解液的離子強(qiáng)度,調(diào)整pH值,使核苷酸帶負(fù)電荷;上樣后核苷酸都能與離子交換樹脂結(jié)合,pI值大的核苷酸與離子交換樹脂的結(jié)合力弱,所以用含競爭性離子的洗脫液進(jìn)行洗脫時是按照核苷酸的pI值從大到小的順序被洗脫下來,而嘌呤和嘧啶堿基與樹脂的非極性親和力不同,綜合兩方面因素,4種核苷酸被洗脫的順序?yàn)镃MP、AMP、UMP、GMP。由于2 -磷酸基和3 -磷酸基的位置不同對堿基電荷的影響,2 -核苷酸更容易被洗脫下來。在水溶

13、液中核苷酸有其獨(dú)特的吸收光譜65,用雙光束分光光度計(jì)對標(biāo)準(zhǔn)核苷酸進(jìn)行掃描,利用掃描圖譜計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)核苷酸的參數(shù),然后將強(qiáng)堿型陰離子交換層析分離純化后的核苷酸溶液進(jìn)行掃描并與標(biāo)準(zhǔn)核苷酸掃描圖譜及參數(shù)進(jìn)行比較,確定各洗脫峰為何種核苷酸。3.2 核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品掃描圖譜核苷酸在240290nm的紫外波段有一個強(qiáng)烈的吸收峰,將4種標(biāo)準(zhǔn)核苷酸溶液(含33mg/LAMP、CMP、GMP或UMP)用雙光束分光光度計(jì)在230350nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。由于核苷酸吸光值受pH值的影響,所以測定之前用氫氧化鈉溶液調(diào)整核苷酸溶液至pH=7。3.3 樣品處理取20mg酵母RNA溶于2mL0.3mol/L氫氧化鉀溶液中,置

14、于電熱恒溫培養(yǎng)箱中37 水解20h;然后用2mol/L過氯酸溶液調(diào)至pH=2以下,400074 結(jié)果4.1 標(biāo)準(zhǔn)核苷酸數(shù)據(jù)結(jié)果4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)核苷酸掃描結(jié)果對核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品掃描得到的掃描圖譜見圖1。圖中 為波長,A為吸光值。4.1.2 計(jì)算各核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)參數(shù)根據(jù)圖1可以得到單核苷酸的最大吸收波長 max34實(shí) 驗(yàn) 技 術(shù) 與 管 理和計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)單核苷酸的一些相關(guān)參數(shù)見表1。表1中 260為對260nm光的吸收系數(shù)。圖1 pH=7時核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的掃描圖譜表1 核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品的物理常數(shù)核苷酸(2 ,3 混合)AMPCMPGMPUMPmr347.2323.2363.2324.2-3/(L m

15、ol-1 cm-1) 260 10A250/A2600.8400.8831.1360.799A280/A2600.1880.9040.6830.372A290/A2600.0200.3150.3010.055max/(nm)25927025226215.37.711.59.94.2 離子交換樹脂分離酵母RNA水解液的結(jié)果4.2.1 強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂201 8分離核苷酸分段洗脫層析圖譜及分析測得的分段洗脫法的層析圖譜見圖2。對分段洗脫得到的各洗脫峰溶液進(jìn)行掃描,根據(jù)掃描圖譜得到各峰的波長,并計(jì)算出各洗脫峰的一些相關(guān)參數(shù),結(jié)果見表2。對照核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品的物理常數(shù),確定圖2中各洗脫峰對應(yīng)的峰1為C

16、MP、峰2為AMP、峰3為UMP、峰4為GMP。對照標(biāo)準(zhǔn)核苷酸參數(shù)的理論值可以進(jìn)一步確定峰1.1為2 -CMP、峰1.2為3 -CMP、峰2.1為2 -AMP、峰2.2為3 -AMP、峰4.1為2 -GMP、峰4.2為3 -GMP。圖2 強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂201 8分離核苷酸分段洗脫層析圖譜胡曉倩,等:離子交換層析分離核苷酸的實(shí)驗(yàn)方法表2 各洗脫峰物理常數(shù)不同波長比下的吸光值比峰序號A250/A260峰1.1峰1.2峰2.1峰2.2峰3峰4.1峰4.20.8960.8610.8160.8150.8201.1431.134280nm/260mm0.8680.9530.180.1820.3440

17、.6910.691290nm/260mm0.2790.3370.0220.0280.0510.3000.288270271259259261252252 max/nm35將圖3中各洗脫峰溶液進(jìn)行掃描,經(jīng)計(jì)算得到相關(guān)的物理常數(shù),對照核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品的物理常數(shù),確定圖3中峰1為CMP、峰2為AMP、峰3為UMP、峰4和峰5為GMP。對照標(biāo)準(zhǔn)核苷酸參數(shù)的理論值可以進(jìn)一步確定峰4為2 -GMP、峰5為3 -GMP。計(jì)算出總回收率為77.11%。應(yīng)用梯度洗脫的效果不如階段洗脫,可以考慮降低洗脫液酸度和離子強(qiáng)度的變化梯度來改善洗脫效果9,降低洗脫液流速10,使各峰間距離拉開,分離效果更好。5 結(jié)論本研究以強(qiáng)堿

18、型陰離子交換樹脂采用階段洗脫法和梯度洗脫法對酵母RNA水解液進(jìn)行有效分離,均得到較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。分離得到的核苷酸純度較高,回收率可達(dá)到70%以上。研究結(jié)果表明,盡管離子交換層析在實(shí)際應(yīng)用中梯度洗脫法優(yōu)于階段洗脫法,但在分離核苷酸時使用階段洗脫法分辨率比較高,基本可以將2 -核苷酸和3 -核苷酸分離開。使用梯度洗脫法雖然幾種核苷酸也都得到有效分離,但其分辨率不如階段洗脫法高?？梢酝ㄟ^降低洗脫液的酸度和離子強(qiáng)度的變化梯度來提高梯度洗脫的分辨率,使各峰間距離拉開,分離效果更好。采用階段洗脫法和梯度洗脫法分離核苷酸作為生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的內(nèi)容,不但可以使學(xué)生全面掌握離子交換層析技術(shù),而且經(jīng)過對標(biāo)準(zhǔn)核苷酸

19、性質(zhì)的研究及核苷酸的鑒定,還可將原有的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容從一個簡單的分離純化實(shí)驗(yàn)提升到研究性實(shí)驗(yàn)的層次,從而有效調(diào)動了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和學(xué)習(xí)熱情,進(jìn)一步增強(qiáng)了學(xué)生解決問題和分析問題的能力。參考文獻(xiàn)(References)1應(yīng)國清,石陸娥,唐振興.核苷酸類物質(zhì)的應(yīng)用研究進(jìn)展J.廣州食品工業(yè)科技,2004,20(2):126-128.2吳艷波,李周權(quán),李仰銳.外源核苷酸的研究與應(yīng)用現(xiàn)狀J.飼料研究,2005(5):20-23.3張志軍,溫明浩,王克文,等.核苷酸生產(chǎn)技術(shù)現(xiàn)狀及展望J.現(xiàn)代化工,2004,24(11):19-23.4袁平海,張國文.生物化學(xué)品生產(chǎn)技術(shù)M.江西:江西科學(xué)技術(shù)出版社,2007.5張龍翔,張庭芳,李令媛.生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)M.2版.北京:高等教育出版社,1997.6黃曉蘭,李科德,陳云華.15種核酸水解產(chǎn)物的高效液相色譜分離及其在酵母抽提物分析中的應(yīng)用J.分析化學(xué),2000,28(12):1504-1507.7王鏡巖,朱圣庚,徐長法.生物化學(xué):上冊M.3版.北京:高等教育出版社,2002.8李建武,肖能慶,