自己總結(jié)：流式細胞儀的原理和用途

1、流式細胞儀(Flow Cytometry1 流式細胞儀的概念及其發(fā)展歷史1. 1 流式細胞儀的基本概念 流式細胞儀(flow cytonletry , FCM 是對高速直線流動的細胞或生物微粒 進行快速定量測定和分析的儀器,主要包括樣品的液流技術(shù)、細胞的計數(shù)和分選技術(shù),計算機對數(shù)據(jù)的采 集和分析技術(shù)等。 流式細胞儀以流式細胞術(shù)為理論基礎(chǔ),是流體力學(xué)、激光技術(shù)、電子工程學(xué)、分子免疫 學(xué)、細胞熒光化學(xué)和計算機等學(xué)科知識綜合運用的結(jié)晶。 流式細胞術(shù)是一種自動分析和分選細胞或亞細胞 的技術(shù)。其特點是:測量速度快、被測群體大、可進行多參數(shù)測量,即對同一個細胞做有關(guān)物理、生物化 學(xué)特性的多參數(shù)測量,且在統(tǒng)

2、計學(xué)上有效。1. 2 流式細胞儀的發(fā)展簡史 最早的流式細胞儀雛形誕生于 1934年, Moldavan 提出使懸浮的單個血紅細 胞 流 過 玻 璃 毛 細 管 , 在 亮 視 野 下 用 顯 微 鏡 進 行 計 數(shù) , 并 用 光 電 記 錄 裝 置 測 量 的 設(shè) 想 。 1953年 Crosland-Taylor 根據(jù)牛頓流體在圓形管中流動規(guī)律設(shè)計了流動室。 其后又經(jīng)過 Coulter 、 Parker & Horst 、 Kamentsky 、 Gohde 、 Fulwyler 、 Herzenberg 等人的不斷改進,設(shè)計了光電檢測設(shè)備和細胞分選裝置、完成 了計算機與流式細胞儀

3、的物理連接及多參數(shù)數(shù)據(jù)的記錄和分析、開創(chuàng)了細胞的免疫熒光染色及檢測技術(shù)、 推廣流式細胞儀在臨床上的應(yīng)用。 近 20年來,隨著流式細胞儀及其檢測技術(shù)的日臻完善, 人們越來越致力 于樣品制備、細胞標(biāo)記、軟件開發(fā)等方面的工作,以擴大 FCM 的應(yīng)用領(lǐng)域和使用效果。宋平根的流式細胞術(shù)的原理和應(yīng)用是迄今為止對流式細胞儀及其技術(shù)闡述的最為詳盡和透徹的中文著 作。這本書非常詳細地介紹了流式細胞術(shù)的歷史、結(jié)構(gòu)、原理、技術(shù)指標(biāo)等,例舉了其在醫(yī)學(xué)和生物工程 中的應(yīng)用, 非常適合從事此方面專業(yè)研究的人。由于這本書是 13年前出版的, 所以基本上沒有涉及植物流 式細胞儀檢測技術(shù)。此外對于只需要對流式細胞儀有些基本認識

4、的人士來說,這本書太復(fù)雜太深奧。謝小 梅主要介紹了流式細胞儀在生物工程中的應(yīng)用。楊蕊概括了流式細胞儀的工作原理,簡單提及了流式細胞 儀的應(yīng)用。本文在分析這三篇論著或文章的優(yōu)缺點后,用比較通俗的語言介紹了掌握流式細胞儀檢測技術(shù) 必須了解的一些原理,并對目前市場上的主流型號進行了客觀的性能概括。2 流式細胞儀的工作原理和技術(shù)指標(biāo)2. 1 流式細胞儀工作原理 除電源外,流式細胞儀主要由四部分組成:流動室和液流系統(tǒng):激光源和光學(xué) 系統(tǒng);光電管和檢測系統(tǒng);計算機和分析系統(tǒng),其中流動室是儀器的核心部件。這四大部件共同完成了信 號的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)換和傳輸?shù)娜蝿?wù)。流動室和液流系統(tǒng)流動室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成,

5、常用光學(xué)玻璃、石英等透明、穩(wěn)定的材料制作。設(shè)計和 制作均很精細, 是液流系統(tǒng)的心臟。 樣品管貯放樣品, 單個細胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出; 鞘液由鞘液管從四周流向噴孔,包圍在樣品外周后從噴嘴射出。為了保證液流是穩(wěn)液,一般限制液流 速度 <10m/s。由于鞘液的作用,被檢測細胞被限制在液流的軸線上。流動室上裝有壓電晶體,受到 振蕩信號可發(fā)生振動。激光源和光學(xué)系統(tǒng)經(jīng)特異熒光染色的細胞需要合適的光源照射激發(fā)才能發(fā)出熒光供收集檢測。 常用的光源有弧光燈 和激光; 激光器又以氬離子激光器為普遍 ,也有配和 氪離子激光器 或染料激光器。 光源的選擇主要根 據(jù)被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜而定。汞燈是最

6、常用的弧光燈 ,其發(fā)射光譜大部分集中于 300400nm ,很 適合需要用紫外光激發(fā)的場合。氬離子激光器的發(fā)射光譜中,綠光 514nm 和藍光 488nm 的譜線最強, 約占總光強的 80%;氪離子激光器光譜多集中在 可見光 部分,以 647nm 較強。免疫學(xué)上使用的一些熒 光染料激發(fā)光 波長 在 550nm 以上,可使用染料激光器。將有機染料做為激光器泵浦的一種成份,可使 原激光器的光譜發(fā)生改變以適應(yīng)需要即構(gòu)成染料激光器。例如用氬離子激光器的綠光泵浦含有 Rhodamine6G 水溶液的染料激光器 , 則可得到 550650nm 連續(xù)可調(diào)的激光,尤在 590nm 處轉(zhuǎn)換效率最 高,約可占到一

7、半。 為使細胞得到均勻照射,并提高分辨率,照射到細胞上的激光光斑直徑應(yīng)和細胞 直徑相近。 因此需將激光光束經(jīng)透鏡會聚。光斑直徑 d 可由下式確定:d=4f/D 。 為激光波長; f 為透鏡焦距; D 為激光束直徑。色散棱鏡用來選擇激光的波長,調(diào)整反射鏡的角度使調(diào)諧到所需要 的波長 。為了進一步使檢測的發(fā)射熒光更強,并提高熒光訊號的信噪比,在光路中還使用了多種濾 片。帶阻或帶通濾片是有選擇性地使某一濾長區(qū)段的光線濾除或通過。例如使用 525nm 帶通濾片只允 許 FITC (Fluoresceinisothiocyanate, 異硫氰熒光素發(fā)射的 525nm 綠光通過。長波通過二向色性 反射鏡只

8、允許某一波長以上的光線通過而將此波長以下的另一特定波長的光線反射。 在免疫分析中常 要同時探測兩種以上的波長的熒光信號,就采用二向色性反射鏡,或二向色性分光器,來有效地將各 種熒光分開。光電管和檢測系統(tǒng)經(jīng)熒光染色的細胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光是通過光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號而進行測量 的。 光電倍增管(PMT 最為常用。 PMT 的響應(yīng)時間短,僅為 ns 數(shù)量級;光譜響應(yīng)特性好,在 200 900nm 的光譜區(qū),光量子產(chǎn)額都比較高。光電倍增管的增益從 10到 10可連續(xù)調(diào)節(jié) ,因此對弱光測量十分有利。 光電管運行時特別要注意穩(wěn)定性問題, 工作電壓要十分穩(wěn)定, 工作電流及功率不能太大。 一般功耗

9、低于 0.5W ;最大陽極電流在幾個毫安。此外要注意對光電管進行暗適應(yīng)處理,并注意良好 的磁屏蔽。在使用中還要注意安裝位置不同的 PMT ,因為光譜響應(yīng)特性不同,不宜互換。也有用硅光 電二極管的,它在強光下穩(wěn)定性比 PMT 好。從 PMT 輸出的電信號仍然較弱,需要經(jīng)過放大后才能輸入分析儀器。流式細胞計中一般備有兩類 放大器。一類是輸出信號輻度與輸入信號成線性關(guān)系,稱為線性放大器。線性放大器適用于在較小范 圍內(nèi)變化的信號以及代表生物學(xué)線性過程的信號,例 DNA 測量等。另一類是對數(shù)放大器,輸出信號和 輸入信號之間成常用對數(shù)關(guān)系。在免疫學(xué)測量中常使用對數(shù)放大器。因為在免疫分析時常要同時顯示 陰性

10、、陽性和強陽性三個亞群,它們的熒光強度相差 12個數(shù)量級;而且在多色 免疫熒光 測量中, 用對數(shù)放大器采集數(shù)據(jù)易于解釋。此外還有調(diào)節(jié) 便利、細胞群體分布形狀不易受外界工作條件影響 等優(yōu)點。計算機和分析系統(tǒng)經(jīng)放大后的電信號被送往計算機分析器。多道的道數(shù)是和電信號的脈沖高度相對應(yīng)的,也是和光 信號的強弱相關(guān)的。對應(yīng)道數(shù)年縱坐標(biāo)通常代表發(fā)出該信號的細胞相對數(shù)目。多道分析器出來的信號 再經(jīng) 模 -數(shù)轉(zhuǎn)換器 輸往微機處理器編成數(shù)據(jù)文件,或存貯于計算機的硬盤和軟盤上,或存于儀器內(nèi)以 備調(diào)用。計算機的存貯容量較大,可存貯同一細胞的 68個參數(shù)。存貯于計算機內(nèi)的數(shù)據(jù)可以在實 測后脫機重現(xiàn),進行數(shù)據(jù)處理和分析,

11、最后給出結(jié)果。除上述四個主要部分外,還備有電源及壓縮氣 體等附加裝置。2. 1. 1 信號的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)換和傳輸 在壓力作用下,鞘液管中的鞘液被持續(xù)不斷地壓入流動室,形成一股 穩(wěn)定地連續(xù)的液流, 保證了樣本液穩(wěn)定地處于鞘液液流的軸線上, 并以單個細胞形式直線通過激光照射區(qū)。 激光照射區(qū)又稱測量區(qū),是指液流與激光束垂直相交的點。當(dāng)細胞攜帶熒光素標(biāo)記物 (每種物質(zhì)攜帶的標(biāo) 記物不同嗎 ? 通過激光照射區(qū)時,產(chǎn)生代表細胞內(nèi)部不同物質(zhì)、不同波長的熒光信號,這些信號以細胞為 中心,向空間 360°立體角發(fā)射 ,產(chǎn)生散射光和熒光信號。 散射光不依賴任何細胞樣品的制備技術(shù),因此 被稱為細胞的物理參數(shù)或

12、固有參數(shù)。散射光又包括前向角散射和測向角散射。 前向角散射與被測細胞直徑 的平方密切相關(guān),測向角散射光對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更敏感,可提供有關(guān)細胞內(nèi)精細結(jié)構(gòu)和顆 粒性質(zhì)的信息。熒光信號也有二種;一種是細胞自身在激光照射下發(fā)出的微弱熒光信號,另一種是經(jīng)過特 異熒光素標(biāo)記后的細胞受激發(fā)照射后得到的熒光信號。在免疫分析中常要同時探測兩種以上波長的熒光信號,就采用二向色性反射鏡,或二向色性分光器,來有效地將各種熒光分開。經(jīng)熒光染色的細胞受到適合的光激發(fā)后產(chǎn)生的熒光是通過光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號而進行測量的。最常用 的光電轉(zhuǎn)換器是光電倍增管(PMT 。從 PMT 輸出的電信號需要經(jīng)過放大后才能輸入分

13、析儀器。流式細胞儀 中一般備有兩類放大器。一類是線性放大器,其輸出信號與輸入信號成線性關(guān)系。線性放大器適用于在較 小范圍內(nèi)變化的信號以及代表生物學(xué)線性過程的信號,如 DNA 測量等。另一類是對數(shù)放大器,其輸出信號 和輸入信號之間成常用對數(shù)關(guān)系。在免疫學(xué)測量中常使用對數(shù)放大器。放大后的電信號被傳送到計算機, 再經(jīng)模一數(shù)轉(zhuǎn)換器傳輸?shù)轿C處理器形成數(shù)據(jù)文件,保存在計算機上。保存在計算機上的數(shù)據(jù)可在脫機后 再進行數(shù)據(jù)處理和分析。參數(shù)(例如:細胞的大小、形態(tài)、質(zhì)膜和細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)測量原理流式細胞儀可同時進行多參數(shù)測量,信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。測量是在 測量區(qū)進行的,所謂測量區(qū)就是照射激

14、光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點。液流中央的單個細胞通 過測量區(qū)時,受到激光照射會向立體角為 2(360°的整個空間散射光線, 散射光的波長和入射 光的波長相同。 散射光的強度及其空間分布與細胞的大小、形態(tài)、質(zhì)膜和細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān),因 為這些生物學(xué)參數(shù)又和細胞對光線的反射、折射等光學(xué)特性有關(guān)。 未遭受任何損壞的細胞對光線都具 有特征性的散射,因此可利用不同的散射光信號對不經(jīng)染色活細胞進行分析和分選。 經(jīng)過固定的和染 色處理的細胞由于光學(xué)性質(zhì)的改變,其散射光信號當(dāng)然不同于活細胞。散射光不僅與作為散射中心的 細胞的參數(shù)相關(guān),還跟散射角、及收集散射光線的立體角等非生物因素有關(guān)。在 流式

15、細胞術(shù) 測量中,常用的是兩種散射方向的散射光測量:前向角(即 0角散射(FSC ; 側(cè)向散射(SSC ,又稱 90角散射。這時所說的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號的光 電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說來, 前向角散射光的強度與細胞的大小有關(guān) ,對同種 細胞群體隨著細胞截面積的增大而增大; 對球形活細胞經(jīng)實驗表明在小立體角范圍內(nèi)基本上和截面積 大小成線性關(guān)系;對于形狀復(fù)雜具有取向性的細胞則可能差異很大,尤其需要注意。 側(cè)向散射光的測 量主要用來獲取有關(guān)細胞內(nèi)部精細結(jié)構(gòu)的顆粒性質(zhì)的有關(guān)信息。 側(cè)向散射光雖然也與細胞的形狀和大 小有關(guān),但它對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感,也

16、能對細胞質(zhì)內(nèi)較大顆粒給出靈敏反映。 在實際使用中,儀器首先要對光散射信號進行測量。當(dāng)光散射分析與熒光探針聯(lián)合使用時,可鑒 別出樣品中被染色和未被染色細胞。光散射測量最有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。 熒光信號主要包括兩部分:自發(fā)熒光,即不經(jīng)熒光染色細胞內(nèi)部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出 的熒光;特征熒光,即由細胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光,其熒光強度較弱,波長也與照射激光不同。 自發(fā)熒光信號為噪聲信號 , 在多數(shù)情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。 在 免疫細胞化學(xué) 等測量中, 對于結(jié)合水平不高的熒光抗體來說, 如何提高信噪比是個關(guān)鍵。 一般說來, 細胞成分中能夠產(chǎn)生

17、的自發(fā)熒光的分子(例核黃素、細胞色素等的含量越高,自發(fā)熒光越強;培養(yǎng) 細胞中死細胞 /活細胞比例越高,自發(fā)熒光越強;細胞樣品中所含亮細胞的比例越高,自發(fā)熒光越強。 減少自發(fā)熒光干擾、提高信噪比的主要措施是:盡量選用較亮的熒光染料;選用適宜的激光 和濾片光學(xué)系統(tǒng);采用電子補償電路,將自發(fā)熒光的本底貢獻予以補償。2. 1. 2 流式細胞儀分選原理 并不是所有的流式細胞儀都具有分選功能。流式細胞儀的分選功能是由細 胞分選器來完成的。由噴嘴射出的液流柱在電信號作用下發(fā)生振動,斷裂形成均勻的小液滴。根據(jù)選定的 某個參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選,而后由充電電路對選定細胞液滴充電,帶電液滴攜帶細胞通過靜

18、電場而發(fā)生偏轉(zhuǎn),落入收集器中。使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度,可能會改變分選效果。從參數(shù)測 定經(jīng)邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時間。精確測定延遲時間是決定分選質(zhì)量的關(guān)鍵,可根據(jù)具體要 求進行適當(dāng)調(diào)整。2. 1. 3 數(shù)據(jù)的顯示和分析 數(shù)據(jù)處理主要包括數(shù)據(jù)的顯示和分析。單參數(shù)直方圖是使用最多的圖形顯示 形式,既可用于定性分析,又可用于定量分析。單參數(shù)直方圖是由 X 、 Y 二方向組成的二維平面圖。橫座標(biāo) X 是所測的熒光或散射光的強度,用“道數(shù)” (Channel No. 來表示。選擇的放大器類型不同,標(biāo)度不同。 縱座標(biāo) Y 通常表示被測細胞的絕對數(shù)目。正常情況下,數(shù)據(jù)分析得到的圖形為具有一

19、個或若干個峰的曲線 圖。對曲線圖的解釋應(yīng)該具體問題具體分析。除直方圖外,數(shù)據(jù)顯示方式還包括二維點圖、二維等高圖、假三維圖和列表模式等。二維點圖也是比較常 用的數(shù)據(jù)顯示類型。它顯示兩個獨立參數(shù)與細胞相對數(shù)之間的關(guān)系,也是二維平面圖,橫縱坐標(biāo)可以根據(jù) 自己選定的被測參數(shù)自行決定,點的位置表明了細胞和顆粒具有的二個被測參數(shù)的數(shù)值。二維點圖所提供 的信息量要大于單參數(shù)直方圖。數(shù)據(jù)分析的方法大體可分為參數(shù)法和非參數(shù)法兩大類。當(dāng)被檢測的生物學(xué)系統(tǒng)能夠用某種數(shù)學(xué)模型時則多 使用參數(shù)方法。非參數(shù)分析法不用對顯示的圖像做任何假設(shè),也不采用數(shù)學(xué)模型,分析程序可以很簡單, 也可能很復(fù)雜。臨床醫(yī)學(xué)較常使用非參數(shù)分析法

20、。2. 2 流式細胞儀性能的技術(shù)指標(biāo) 流式細胞儀性能的技術(shù)指標(biāo)主要有熒光分辨率、 熒光靈敏度、適用樣品 濃度、分選純度等。熒光分辨率是指分辨兩個相鄰峰的最小距離,通常用變異系數(shù)(CV 值來表示?，F(xiàn)在 市場上主流型號出廠時的熒光分辨率應(yīng)該小于 2.0%。熒光靈敏度反映了儀器探測最小熒光光強的能力。一 般用熒光微球上可測出的 FITC 的最少分子數(shù)來表示。目前儀器均可達到 1000左右。儀器工作時樣品濃度 一般在 105107細胞 /ml。 分析速度 /分選速度是指流式細胞儀每秒種可分析或分選的顆粒數(shù)目。 一般分析 速度為 500010000,分選速度控制在 1000以下。流式細胞儀測量的數(shù)據(jù)是相

21、對值,因此需要在使用前對系統(tǒng)進行校準(zhǔn)或標(biāo)定。流式細胞儀的校準(zhǔn)有二個目 的,即儀器的準(zhǔn)直調(diào)整和定量標(biāo)度。通常使用標(biāo)準(zhǔn)微球作為非生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品,雞血紅細胞做為生物學(xué)標(biāo) 準(zhǔn)樣品。3 主流流式細胞儀型號及其特性介紹目前擁有市場較大份額的公司是美國的 BD (Becton-Dickinson 公司、 Beckman-Coulter 公司(原名稱 Coulter 和德國的 Partec 公司。3. 1 BD公司流式細胞儀介紹 BD 公司生產(chǎn)的流式細胞儀都冠以 FACs (fluorescence activated cell sorter ,即熒光激活細胞分選器。其型號種類比較齊全,如早期的 FACSor

22、t 、 FACS Canto、 FACSean 。現(xiàn) 在市場上供應(yīng)的型號有五種:FACSCount (小型流式細胞儀 、 FACS CAlibur (流式細胞儀 、 FACSA ria (流 式細胞分選儀 、 FACSV antage SETM(多色分析和高速分選流式細胞儀 、 LSR II (數(shù)字化分析型流式細胞 儀 。FACSCount 為精確計數(shù)淋巴細胞 CD3, CD4, CD8絕對數(shù)而設(shè)計的。 FACSCalibur 是全自動多色流式系統(tǒng),偏 重于臨床,其整體設(shè)計幫助臨床醫(yī)生快速實現(xiàn)常規(guī)免疫表型、 CD4T 細胞計數(shù)、 DNA 、網(wǎng)織紅細胞、血小板 等臨床分析,兼具分選功能。配備有二

23、根激光管,可同時檢測 4個熒光參數(shù)?？勺R別粘聯(lián)細胞。BD FACSA ria 流式細胞分選儀為臺式高速細胞分選儀, 獲取速度達 70, 000細胞 /s, 分析速度達 50, 000/s。 使用石英杯流動檢測池固定光路校準(zhǔn)技術(shù)。使用三種激光,多色分析,分析參數(shù)可達 15色。兩管或四管分 選,可以使用多種規(guī)格的收集管。液流監(jiān)測系統(tǒng)白動監(jiān)測液流斷點,檢查堵塞,實現(xiàn)了細胞分選的無人操 作。配件 BDACDU 裝置,可以在微孔板或載波片上定量分選細胞。FACSV antage SETM是在 FACSV antage的細胞分選功能基礎(chǔ)上推出的分選增強型流式細胞儀。六色熒光分 析系統(tǒng),點對點分選,配置 F

24、ACS Diva 數(shù)字化系統(tǒng),提供全面的配套試劑。速度和功能優(yōu)于 FACSV antage 。 BD LSR II是 LSR 的數(shù)字化升級版,其性能介于 FACSV antage SE和 FACS Calibur之間,是專為生命科學(xué) 研究設(shè)計的臺式機。配備固定校準(zhǔn)的紫外激光,四種激光立體空間激發(fā)、十色熒光同時分析、電子系統(tǒng)數(shù) 字化、比較易學(xué)易用。3. 2 Beckman-Coulter 公司流式細胞儀介紹 Beckman- Coulter 公司生產(chǎn)的流式細胞儀以 Profile (早期, 現(xiàn)已停產(chǎn)和 EPICS 系列為代表,近年又推出了 Cytomics FC500系列。 EPICS 系列是大

25、型流式細胞儀,目 前市場上有 XL 、 XL-MCL 和 ALTRA 三種型號,其中 ALTRA 具有分選功能,適用于免疫學(xué)、細胞生理、分子生 物學(xué)、遺傳學(xué)、微生物學(xué)、水質(zhì)分析和植物細胞分析。 Cytomics FC500系列流式細胞儀體積小,可自動進 行 5種顏色的分析, 適用于免疫學(xué)檢測, 如人類 HIV 診斷。 特別是 FC500MPL 的獨特設(shè)計可以在同一系統(tǒng)上 使用 12×75mm 的離心管和 24或 96孔的平板。特別適合工作量大的實驗室。這二個公司主要針對醫(yī)學(xué)研究和臨床工作進行設(shè)計和生產(chǎn),其產(chǎn)品可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究以及臨床檢測的許多領(lǐng)域,如遺傳、腫瘤、血液、免疫等諸

26、多研究中紅細胞、 T 細胞、淋巴細胞亞群測定、檢測早期 細胞凋亡、腫瘤細胞免疫測定等。這二個公司的流式細胞儀價格昂貴,我國主要購買、使用的單位基本上 都是一些醫(yī)療機構(gòu)。3. 3 Partec公司流式細胞儀介紹 與 BD 和 Becman-Coutler 公司的產(chǎn)品相比,德國 Partec 公司生產(chǎn)的流 式細胞儀的共同特點是體積小,造價低,易操作,便于攜帶,適合植物學(xué)研究,適合邊遠地區(qū)和發(fā)展中國 家。 德國 Partec 公司的產(chǎn)品分為三類:CCA 家族、 PAS 家族和 CyFlow 家族 (Galaxy 為早期產(chǎn)品,已停產(chǎn) 。 CCA 家族包括細胞計數(shù)分析儀 CCA 和倍性分析儀 PA-I

27、。它是單或雙參數(shù)的臺式小型機,可以進行一些常規(guī) 分析, 如核 DNA 測定 (檢測倍性或細胞周期 、 細胞計數(shù)、 細胞凋亡。它的特點是體積小, 易操作, 價格低, 檢測范圍廣,可以檢測多種熒光素(如 PI 、 DAPI 、 Fluorescein 發(fā)出的熒光。 PAS 家族包括粒子分析系統(tǒng) PAS 、粒子分析系統(tǒng) III (PAS-III 和倍性分析儀 PA-II 。提供三種激光器的三種組合,可檢測十余種熒光 染料。 最多可檢測和記錄八個獨立熒光參數(shù)。 倍性分析儀 PA 能夠在 2分鐘內(nèi)自動測量植物的倍性水平, 檢 測異倍體?？梢詫θ~片、幼苗、種子、果皮、根、花等植物材料進行分析。在大多數(shù)植物

28、中,異倍體染色 體的檢測分辨率為±1條染色體。 PA-I 使用 HBO-100汞燈,屬于弧光燈,可產(chǎn)生紫外激發(fā)光和藍光。 PA-II 中增加了 488nm 氬離子激光器,能夠檢測幾乎所有的熒光染料,如 DAPI , Hoeehst , PI , EB , MMC , FITC , FDA 等。汞燈發(fā)光是電流經(jīng)過氣體時,氣體電離產(chǎn)生的。它能提供最佳的激發(fā)波長。CyFlow (R SL 配備三種激光管,可應(yīng)用于諸如人類健康、微生物學(xué)、工業(yè)應(yīng)用、過程控制、生態(tài)學(xué)等研 究。如 HIV 掃描中免疫標(biāo)記細胞計數(shù)、食品處理過程中的微生物計數(shù)、細胞凋亡等。它使用 l2 V直流電, 特別適合邊遠地區(qū)和

29、發(fā)展中國家。國際上 20世紀(jì) 80年代開始將流式細胞儀檢測應(yīng)用到植物的研究中(Galbraith , 1983 ,眾多學(xué)者都認為 流式細胞儀是一種準(zhǔn)確、快速的檢測 DNA 含量的方法(Michaelson , 1991 。應(yīng)用范圍主要是利用流式細胞 儀研究屬內(nèi)、屬間多種植物的 DNA 含量(Baird , 1994; Jacob , 1996; HALL , 2000和倍性水平(Costich , 1993; Meng , 2002 、檢測體細胞雜種(Pfosser , 1995; Keller , 1996和游離小孢子培養(yǎng)再生株(Kim , 2003的 DNA 含量。過去我國應(yīng)用這一檢測技術(shù)

30、的植物研究工作者寥寥無幾,且大多是在國外實驗室完成 的。研究內(nèi)容包括植物生理、程序性死亡、倍性鑒定等。植物研究中使用的流式細胞儀基本上都是 Partec 公司的產(chǎn)品, 也有少量是 BD 公司生產(chǎn)的流式細胞儀。 BD 公司的產(chǎn)品主要定位于醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用, 與 Partec 產(chǎn)品相比, 不太適合從事植物染色體倍性的鑒定。 主要體現(xiàn)在不能提供植物樣品制備技術(shù) /試劑, 數(shù)據(jù)獲取 軟件可同時檢測到的倍性數(shù)目少。 鑒于目前我國科研院所中使用較多的是 BD 公司生產(chǎn)的流式細胞儀, 在下 一篇中將會對利用 BD 流式細胞儀進行植物倍性檢測的技術(shù)和技巧做詳細報告。如何選擇流式細胞儀自七十年代出現(xiàn)第一代流式細胞

31、儀以來,隨著計算機技術(shù)、電子制造技術(shù)、激光技術(shù)及熒光素合成技術(shù)的 不斷發(fā)展,現(xiàn)代流式細胞儀已今非昔比,制造工藝、功能、精確度有了質(zhì)的飛躍。流式細胞儀生產(chǎn)廠商推出各種不同型號的流式細胞儀來滿足用戶的不同需要?，F(xiàn)生產(chǎn)流式細胞的廠商全球 至少有六家,各廠商產(chǎn)品又有不同的系列,各具特點。如何從眾多的型號中挑選出最適合自己的機型,我 們還需從分析應(yīng)用出發(fā),評估自己的需求來決定什么樣的流式細胞儀最具性價比、最適合自己。、 DNA 倍體分析DNA 分析是流式細胞儀最初且是現(xiàn)在應(yīng)用最廣檢測項目。由于惡性細胞 DNA 含量通常與正常細胞不同,存 在異倍體細胞,所以現(xiàn)有很研究評價異倍體細胞與腫瘤惡性度及其預(yù)后的關(guān)

32、系。 DNA 含量檢測還可提供細 胞周期方面的信息,這在細胞生物學(xué)中運用很廣泛。特別地,它可表示出細胞毒性藥物對細胞作用過程。 這些 DNA 檢測還可與細胞表面標(biāo)志物標(biāo)記同時進行,這樣在細胞混合培養(yǎng)中,可通常追蹤表達特異標(biāo)志物 的細胞顯示其生長周期情況。所有方法都是基于染料能與核酸起特異的化學(xué)反應(yīng)并發(fā)射出熒光,常用的染 料為 PI , DAPI 。流式細胞儀要求:488nm 光源, 575nm 濾光片。、細胞生存能力實驗使用 Heochest 33342染料與 DNA 特異性結(jié)合,后因細胞活力不同,染料的結(jié)合程度也各異,故可評估細胞 的活性度。流式細胞儀要求:360nm 光源, 455nm 濾

33、光片。、計數(shù)外周血中檢測網(wǎng)織紅細胞使用 TO 染料能夠特異性地與 RNA 結(jié)合,結(jié)合系數(shù)高達 3000,故具有很好的性價比。流式細胞儀要求:488nm 光源, 525nm 濾光片,液量絕對計數(shù)系統(tǒng)。、外周血、骨髓采集物中 CD34陽性干細胞計數(shù),臨床上用于骨髓移植前干細胞數(shù)理的測定使用標(biāo)準(zhǔn) ISHAG 方案, 需要 DNA 或其他核染料占用 FITC 通道, PE 標(biāo)記 CD34抗體, PE-CY5標(biāo)記 CD45抗體。 流式細胞儀要求:488nm 光源, 525nm 、 575nm 、 675nm 濾光片,液量絕對計數(shù)系統(tǒng)。、交叉淋巴細胞、粒細胞毒實驗檢測識別供體血清中免疫球蛋白與受體粒細胞之

34、間是否存在反應(yīng)有著重要臨床意義,因為這種反應(yīng)會導(dǎo)致 移植后發(fā)熱、移植后肺損傷及免疫性粒細胞缺乏癥。流式細胞儀可檢測全血樣本與血清孵育后粒細胞上結(jié)合的人免疫球蛋白。 FITC 標(biāo)記人免疫球蛋白抗體、 PE 標(biāo)記粒細胞表面標(biāo)志物、 PE-CY5標(biāo)記 HLA 抗體。 流式細胞儀要求:488nm 光源, 525nm 、 575nm 、 675nm 濾光片。、血小板自身抗體檢測血小板自身抗體識別人血小板抗原,會引起各種臨床相關(guān)癥狀,如新生兒自免性血小板減少癥、輸血后紫 癜、難治性血小板減少。流式細胞可快速準(zhǔn)確地檢測血小板自身抗體。 FITC 標(biāo)記抗人免疫球蛋白抗體、 PE 標(biāo)記識別血小板抗體。流式細胞儀

35、要求:488nm 光源, 525nm 、 575nm 濾光片。、移植交叉配型原細胞毒實驗,主要用于避免移植物超急性排拆反應(yīng)。流式細胞儀用于監(jiān)測 T 或 B 細胞是否受到受體血清 中免疫球蛋白攻擊,作為 HLA 配型前的預(yù)實驗。流式細胞儀因其高精確性已成為該領(lǐng)域內(nèi)的金標(biāo)準(zhǔn)。 FITC 標(biāo)記抗人免疫球蛋白抗體、 PE 標(biāo)記識別 T 細胞 CD3或 B 細胞 CD29抗體。儀器要求:488nm 光源, 525nm 、 575nm 濾光片。、檢測細胞經(jīng)抗原或細胞有絲分裂刺激后活化效應(yīng)淋巴細胞早期活化指標(biāo) CD69可用來檢測免疫治療效果。 流式細胞使用三色分析可監(jiān)測淋巴細胞各亞群活化 情況:FITC 標(biāo)

36、記的 CD3抗體、 PE 標(biāo)記的 CD8抗體、 PE-CY5標(biāo)記的 CD69抗體。流式細胞儀要求:488nm 光源, 525nm 、 575nm 、 575nm 濾光片。、檢測細胞內(nèi)因子(TH1/TH2細胞檢測未活化的淋巴細胞所分泌的細胞因子極少,用流式細胞儀很難檢測出來,因此在檢測前需刺激活化?；罨?所用的刺激素為 PMA 佛波酯 +Ionomycin。淋巴細胞在刺激素的作用下,活化分泌細胞因子到細胞外。因流 式細胞儀只能對細胞表面或內(nèi)部的抗原進行檢測,如細胞因子分泌到細胞外則檢測不到,因此必須阻止細 胞因子的分泌。抑制細胞因子分泌的試劑為 Brefedlin A或 Monensin 。 T

37、h1/Th2細胞首先是 CD4+T細胞, 因此存在著用 CD4來設(shè)定細胞群的問題。 我們知道 CD4不但在 T 細胞上表達, 還在所有的單核細胞上表達, 因此單獨用 CD4設(shè)門無法將 CD4+T細胞區(qū)分開來。那么我們用 CD3和 CD4雙參數(shù)設(shè)門是否可以呢?回答是 否定的。因為在佛波酯的刺激作用下 CD4 抗原的表達會迅速下調(diào),甚至完全喪失,所以不適合于設(shè)門。用 CD3和 CD8設(shè)門,因 CD8不受佛波脂的影響且絕大多數(shù) CD3+CD8-的細胞都是 CD3+CD4+細胞,因此可用 CD3+CD8-細胞群來確定 CD4+T細胞群。 FITC 標(biāo)記 CD8, PE 標(biāo)記 IL-4和, PE-CY5

38、標(biāo)記 IFN-r , APC 或 PE-CY7標(biāo)記 CD3。流式細胞儀要求:488nm 或 633nm (僅限 APC 染料光源, 525nm 、 575nm 、 675nm , 767nm 濾光片。、細胞增殖狀態(tài)檢測核增殖抗 PCNA 、 Ki67、 BrdUrd 用于衡量細胞增殖分裂狀況,在評估腫瘤預(yù)后有重要意義。為些標(biāo)志物的檢測一般同細胞表面標(biāo)志物同時檢測。 FITC 標(biāo)記 PCNA 或 Ki67或 BrdUrd , PE 或(并 PE-CY5標(biāo)記細胞表面 標(biāo)志物。流式細胞儀要求:488nm 或 633nm 光源, 525nm 、 575nm 、 675nm 濾光片。、染色體分析流式細胞儀染色分析運用兩