高靈敏度化學發(fā)光儀

1、 作者:黃磊 一.概述化學發(fā)光 (ChemiLuminescence ,簡稱為 CL 分析法是分子發(fā)光光譜分析法中的一類,它主要是 依據(jù)化學檢測體系中待測物濃度與體系的化學發(fā)光強度在一定條件下呈線性定量關系的原理,利用儀器 對體系化學發(fā)光強度的檢測,而確定待測物含量的一種痕量分析方法?；瘜W發(fā)光與其它發(fā)光分析的本質(zhì) 區(qū)別是體系產(chǎn)生發(fā)光 ( 光輻射 所吸收的能量來源不同。 體系產(chǎn)生化學發(fā)光, 必須具有一個產(chǎn)生可檢信 號的光輻射反應和一個可一次提供導致發(fā)光現(xiàn)象足夠能量的單獨反應步驟的化學反應。 化學發(fā)光 Western 雜交檢測,是同位素檢測 的一種高度靈敏的替代方法。 酶標記抗體取代了放 射性標記

2、抗體, 當它作用于底物時,可產(chǎn)生光信 號。多數(shù)特異抗原檢測方法以辣根過氧化物酶 (HRP或堿性磷酸酶 (AP 二級抗體 耦聯(lián)物為基 礎。信號可通過感光膠片或?qū)Ｓ玫某上裨O備來采 集。 化學發(fā)光底物用于免疫印跡技術已有十幾年的 歷史, 目前大部分實驗室做轉(zhuǎn)印時都會采用化學發(fā) 光技術進行檢測。隨著冷 CCD 化學發(fā)光檢測技術 的發(fā)展,現(xiàn)在越來越多的實驗室都開始采用冷 CCD 的凝膠成像系統(tǒng)進行化學發(fā)光的檢測,膠片 成像雖然比自然發(fā)光法靈敏度更高, 但也有很多缺 點:耗時,需要暗房,顯影劑和膠片,膠片較貴且 為需持續(xù)購買的消耗品。 同時由于膠片的線性范圍 較窄, 因此用膠片上的條帶 (特別是表達量較低

3、的 條帶進行定量幾乎不可能。冷 CCD 技術與 X 膠 片相比具有瞬時影像處理、高靈敏度和高分辨率、 動力范圍廣等優(yōu)點,因此能對條帶進行精確定量。 當然這項技術要求底物能產(chǎn)生高強度長持續(xù)時間 的信號,以保證信號能被冷 CCD 的凝膠成像系統(tǒng) 捕獲。 在這方面多家公司都提供了相應的化學發(fā)光 底 物 或 試 劑 盒 , 特 別 是 Bio-Rad 公 司 提 供 的 Western-C 化學發(fā)光檢測試劑盒, 底物可產(chǎn)生高強度的持續(xù)光信號 24小時,因此用戶可以進行多次 曝光,最低可檢測至 10-19mol ,配合 Bio-Rad 屢 獲大獎的化學發(fā)光成像系統(tǒng) ChemiDoc XRS或 Versa

4、Doc 系統(tǒng)能得到得到高質(zhì)量的印記信號。我們實驗室從 05年開始采用 Bio-Rad 的 ChemiDocXRS 進行化學發(fā)光的檢測, 目前已經(jīng)形 成一套較為成熟的技術路線,取得大批的實驗數(shù) 據(jù)。 本文將就 Western Blotting的關鍵步驟及使用 ChemiDocXRS 的一些心得體會與大家一起分享。ChemiDoc XRS system了解 ChemiDoc XRS系統(tǒng)的更多信息!二.轉(zhuǎn)印過程2009年7月9日第六十四期 第 15 頁,共 25 頁 下一頁 返回 轉(zhuǎn)印蛋白的方法有多種, 最常用的是電泳轉(zhuǎn)印 方法,該技術具有快速、有效、并保持蛋白在凝膠 中高分辨率的特性。 電泳轉(zhuǎn)印技

5、術是指在凝膠中分 離的蛋白質(zhì)向印跡膜載體轉(zhuǎn)印的過程。 由于該技術 可以準確、快速、高效的將蛋白轉(zhuǎn)印到膜上,并可 以保持蛋白在凝膠中高的分辨率, 而被廣泛的應用 于轉(zhuǎn)移印跡技術中。常用的電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)有槽轉(zhuǎn)印系統(tǒng)和半干轉(zhuǎn) 印系統(tǒng),前者是將凝膠和印跡膜浸入轉(zhuǎn)印緩沖液 槽, 然后加電壓進行轉(zhuǎn)印; 后者是將凝膠和印跡膜 放置于濾紙間形成三明治結(jié)構(gòu), 而后在電極平板間 進行轉(zhuǎn)印。兩種系統(tǒng)間的比較見表 1.1表 1.1 電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)的比較槽轉(zhuǎn)印 半干轉(zhuǎn)印靈活性 可靈活選擇電壓設置、 轉(zhuǎn)印時間和冷卻方法; 可靈活更換電極位置(Trans-Blot和 Trans-Blot Plus印跡槽快速、高強度轉(zhuǎn)印, 使用

6、少量電轉(zhuǎn)印緩 沖液,無冷卻系統(tǒng)定量和定 性結(jié)果 小分子量范圍可以提供高效而定量的蛋白轉(zhuǎn)印小分子量蛋白與印 跡膜很少結(jié)合, 發(fā)生 轉(zhuǎn)印并穿透印跡膜分子量范圍 寬分子量范圍 對于分子量大于 120kD 蛋白的轉(zhuǎn)印 效率不穩(wěn)定, 小分子 量蛋白會轉(zhuǎn)印穿透 印跡膜轉(zhuǎn)印時間 可以在不耗盡緩沖液時延長轉(zhuǎn)印時間到 24h ; 高強度轉(zhuǎn)印只需 15-60min快速轉(zhuǎn)印; 不適用于 延時轉(zhuǎn)印溫度控制 冷卻芯和循環(huán)冷卻水, 可以在很低的溫度進行轉(zhuǎn)印(4-10,例如原酶轉(zhuǎn)印無冷卻系統(tǒng)緩沖能力 緩沖液 10-12L(Trans-Blot 槽或450ml (MiniTrans-Blot 槽緩沖液不限制轉(zhuǎn)印時間少量, 每

7、次實驗只需 要 250ml , 節(jié)約試劑 成本和縮短轉(zhuǎn)印時 間電泳轉(zhuǎn)印過程中, 凝膠和印跡膜平行放置于兩 極間。根據(jù)歐姆定律(Ohm's :V=I*R, R 為兩 極間物質(zhì)的電阻值, (即轉(zhuǎn)印緩沖液、凝膠、印跡 膜、濾紙的電阻值,當電極兩端加有電壓時,就 會在上述物質(zhì)間產(chǎn)生電流,蛋白樣品便發(fā)生轉(zhuǎn)印。 由于兩極間的電場強度(V/cm是蛋白轉(zhuǎn)移 的驅(qū)動力, 因此兩極間的電壓和距離稱為凝膠上蛋 白轉(zhuǎn)印的關鍵參數(shù)。同樣其他參數(shù)包括蛋白的大 小、 形狀、 所帶電荷多少, 電轉(zhuǎn)印緩沖液的 pH 值、 黏度、 離子強度、 以及凝膠密度也影響著蛋白的電 轉(zhuǎn)印效率。在轉(zhuǎn)印過程中將產(chǎn)生大量熱量, 因此對電

8、場強 度要有一定的限制。轉(zhuǎn)印中產(chǎn)生的焦耳熱(Joule 與電源參數(shù) P 成正比, P=I*V=I2R。電泳轉(zhuǎn)印緩沖 液的溫度隨著焦耳熱的增加而升高, 此時其電阻卻 明顯下降。 電阻的降低將會使轉(zhuǎn)印過程和電場強度 發(fā)生變化, 從而影響電轉(zhuǎn)印緩沖液的緩沖能力。 同 時, 系統(tǒng)過熱還會引起凝膠的損壞或與印跡膜發(fā)生 粘連。 從而槽體的散熱能力將直接影響電泳轉(zhuǎn)印效 率。本室主要以濕轉(zhuǎn)進行轉(zhuǎn)印, 因此本文就濕轉(zhuǎn)為 例,對化學發(fā)光和 ChemiDoc XRS的應用進行敘 述。一、轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn):注意:1 整個過程在轉(zhuǎn)膜液中進行在鋪每一層 時要用刮子趕氣泡, 尤其是膠與膜之間一定不能留 有氣泡。 2 撬玻璃板剝膠

9、時動作要輕, 用刮子將濃縮膠 輕輕刮去小心剝下分離膠蓋于濾紙上, 用手調(diào)整使 其與濾紙對齊(4 將夾子合好,放到轉(zhuǎn)移槽槽中,要使夾的 黑面對槽的黑面, 夾的白面對槽的紅面。 接通電電 轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱, 在槽的一邊有較大空隙, 放入事先 準備好的冰盒來降溫。 將整個電泳槽放入一個大的 容器中(大的塑料泡沫盒子最好,在這個容器中 盛滿冰。(5 250毫安恒流轉(zhuǎn)膜 2小時。(6 2小時后,將膜取出,用 TBST 洗膜 5分 鐘。(7 用 5%脫脂奶粉室溫封閉。封閉是為了使抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì) 結(jié)合而不是和膜結(jié)合。脫脂奶粉要用 TBST 配置, 要在干凈的容器里 進行封閉,且足以覆蓋住膜。二、孵育

10、一抗一抗用 BSA 溶解,根據(jù)抗體說明書上的要求 稀釋抗體(大部分稀釋度為 1:1000, 4過 夜。 也可根據(jù)抗體量和膜上抗原量適當延長或縮 短時間。 (有些一抗室溫孵育一小時也可得到滿意 的結(jié)果三、孵育二抗室溫孵育 1小時。 一般采用 HRP 標記的二 抗,稀釋比例為 1:2000。二抗的稀釋比例不能太低, 否則容易導致非特 異性的結(jié)合。注意:孵育二抗之前一定要用 TBST將膜洗 三次,每次五分鐘,時間一定要夠。洗滌是為了洗去二抗的非特異性結(jié)合, 洗滌的 效果直接影響結(jié)果背景的深淺, 所以洗滌一定要干 凈。四、曝光本實驗室選用威格拉斯 “western 發(fā)光檢測 試劑盒 ” ,如采用 Bi

11、o-Rad 公司的 Immun-Star WesternC 化學發(fā)光試劑盒(已針對 CCD 成像做 了優(yōu)化,可獲得更好的效果。(1洗膜, 2至 3次,每次 5分鐘(2在照膠儀放膜的平板上加少許水,取一 張與平板大小合適的保鮮膜鋪在平板上,排氣泡。 作用:a 保證 PVDF 膜能在一個相對干凈的 平臺上曝光,避免污染。b 鋪上保鮮膜后, 背景顏色是純黑色且深淺均 勻, 這樣當半透明的 PVDF 膜在白測光下照 Marker 時,會更清晰、明顯。(3將膜放入照膠儀,調(diào)整明暗、大小、焦 距,在目的條帶的 marker 出,用圓珠筆標一個印 記。(4選擇 EPI WHITE 光,點擊 “White E

12、pi IIIumination” 點擊 Auto Expose 獲取 marker 圖 片,圖片最大化,選中圖片,選擇 file ->export to jpeg , quantity 調(diào)至最大值 100,保存至文件夾。 保存為 jpeg 格式后,轉(zhuǎn)至其他電腦即使未安裝 quantity one 軟件也可用其他圖像軟件編輯圖片。 (5 將發(fā)光液 A 液和 B 液按 1:1比例混勻、 倒在 PVDF 膜上,發(fā)光液能蓋住膜即可,關閉 WHITE EPI光(注意膜的位置從照 Marker 開始, 不要改變點擊 “Chem Hi Sensitivity” ,點擊 “Live Acquire” 選

13、擇合適的曝光時間,張數(shù),選擇指定文 件夾,保存。2009年7月9日第六十四期 第 17 頁,共 25 頁 下一頁 返回 選擇比較滿意的圖片, 按如上所說轉(zhuǎn)換至 jpeg 格式。 例如, Caveolin-3、 AKT 、 ERK 、 GSK 等比較 好曝的,可以調(diào)至 10s 一張,一般 10張之內(nèi)就可 得到好的效果。 其他不太容易出條帶的, 可以適當 延長時間。對于內(nèi)參來說, 在曝第一張之前, 讓發(fā)光液倒 在膜上靜置反映 20-30秒,有時會得到理想的效 果。 (6 marker 與目的條帶的比對:用 window自帶的 “ 圖片和傳真查看器 ” 軟件打開 jpeg 格式的 marker 圖片

14、,用手在屏幕上點住剛剛用圓珠筆畫 的印記,手不要松開,此時還用 “ 圖片和傳真查看 器 ” 打開 jpeg 格式的目的條帶的圖片,手點的地方 就是剛才 marker 的位置。 白測光下獲取的 marker 圖像(圓珠筆標記 43KD 化學發(fā)光下目的蛋白條帶(-actin 蛋白上樣量:120g 分離膠濃度:12%白測光下獲取的 marker 圖像(ERK 化學發(fā)光下目的蛋白條帶 蛋白上樣量:80g 分離膠濃度:12%白測光下獲取的 marker 圖像(圓珠筆標記 26KD 第 18 頁,共 25 頁下一頁 返回 化學發(fā)光下目的蛋白條帶(ARC 蛋白上樣量:50g分離膠濃度:15%結(jié)論:采用 Bi

15、o-Rad 的冷 CCD 化學發(fā)光成像 系統(tǒng)進行化學發(fā)光的檢測, 比傳統(tǒng)的暗室曝光方法 更為簡便, 也大大縮短了實驗時間。 但在成像時需 要注意選擇合適的化學發(fā)光試劑,以適合 CCD 的 成像檢測。 且大部分的化學發(fā)光試劑均對應暗室曝 光的方式, 因此在進行檢測需要進行調(diào)整, 如對發(fā) 光液不能進行稀釋, 而必須要使用原液。 同時如果 條帶的表達比較弱的情況下, 如使用常用發(fā)光液可 能需要更長的成像時間, 當然更好的方法是選擇能快速產(chǎn)生強烈信號的化學發(fā)光試劑,如 Bio-Rad公司的 Immun-Star WesternC化學發(fā)光試劑盒。相關儀器及試劑訂貨信息170-8251 Molecular Imager ChemiDocXRS+ System PC170-8182 XciteBlue Conversion Screen andviewing goggles for SYBR Green/SYBR Safe/GFP/ Flamingo Fluorescent Gel Stain170-8184 Gel Alignment Templates170-7950 White Light Tr