流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用技巧

1、 利用流式細(xì)胞儀利用流式細(xì)胞儀( flow cytometer ) 通過(guò)檢測(cè)熒光通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞或其它顆粒性物質(zhì)（表面或胞漿或胞信號(hào)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞或其它顆粒性物質(zhì)（表面或胞漿或胞核）的物理、化學(xué)特性并通過(guò)這些特性對(duì)細(xì)胞或顆粒核）的物理、化學(xué)特性并通過(guò)這些特性對(duì)細(xì)胞或顆粒進(jìn)行進(jìn)行定量。定量。 & 檢測(cè)表面標(biāo)記物檢測(cè)表面標(biāo)記物 & 檢測(cè)胞漿標(biāo)記物檢測(cè)胞漿標(biāo)記物 & 檢測(cè)胞核內(nèi)標(biāo)記物檢測(cè)胞核內(nèi)標(biāo)記物 & 檢測(cè)可溶性蛋白檢測(cè)可溶性蛋白流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（FLOW CYTOMETRY）一、流式細(xì)胞儀的原理應(yīng)用技巧的基礎(chǔ)光源：光源：激光激光(488nm 氬離子空冷激

2、光氬離子空冷激光) 細(xì)胞：細(xì)胞： 單細(xì)胞懸單細(xì)胞懸液液 液流：液流：鞘液鞘液(Sheath Fluid) 流動(dòng)室：流動(dòng)室：Flow Cell檢測(cè)器：檢測(cè)器：光電倍增管光電倍增管(PMT)檢測(cè)信號(hào)：檢測(cè)信號(hào)：散射光散射光(FS，SS)，熒光信號(hào)，熒光信號(hào)(FL1FL4)統(tǒng)計(jì)分析：統(tǒng)計(jì)分析：計(jì)算機(jī)計(jì)算機(jī)散射光信號(hào) FS 細(xì)胞大小 SS 細(xì)胞顆粒性熒光信號(hào) FL1 FITC FL2 PE FL3 ECD FL4 PC5 FL5 - PC7 用熒光標(biāo)記抗體抗體特異性地結(jié)合細(xì)胞上對(duì)應(yīng)的抗原表達(dá)該抗原的細(xì)胞被標(biāo)記上熒光；抗原表達(dá)多的細(xì)胞熒光強(qiáng)度強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞百分比或濃度靶蛋白濃度（1）、直標(biāo)和間標(biāo)（2）、細(xì)胞

3、膜標(biāo)和細(xì)胞內(nèi)標(biāo)（3）、兩種染色：抗體和染料（4）、組合標(biāo)記間接免疫熒光標(biāo)記法間接免疫熒光標(biāo)記法直接免疫熒光標(biāo)記直接免疫熒光標(biāo)記法法抗原分布:Important for method optimization 表面，胞漿，核內(nèi) 是共同檢測(cè)還是分別檢測(cè)？CD3, CD4, CD8, tetramercytokinesDNACD3,4,8, tetramer+CytokinesCD3,4,8, tetramer+DNACytokines+DNACD3,4,8, tetramer+Cytokines+DNAIntracellular Cytokine-Protocol（1）、方案：兩種圖形（散點(diǎn)圖、直

4、方圖）（2）、百分率信息、強(qiáng)度信息（3）、分群：細(xì)胞大?。‵S）細(xì)胞內(nèi)顆粒（SS）（4）、設(shè)閾值、設(shè)門特征（細(xì)分）（5）、直接信息、間接信息二、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用技巧一 整合項(xiàng)目，樹立體系化概念，提高流式使用價(jià)值白血病全過(guò)程評(píng)價(jià)患者出現(xiàn)癥狀各種抗原（參照白血病抗原選擇原則）診斷白血病，確診疾病，對(duì)白血病進(jìn)行分型以指導(dǎo)治療治療初診時(shí)所用抗原中能夠代表白血病細(xì)胞的特殊抗原評(píng)價(jià)療效及治療的療程同上緩解期動(dòng)態(tài)跟蹤患者緩解期的白血病細(xì)胞變化，及時(shí)控制在相應(yīng)水平下臨床過(guò)程FCM檢測(cè)項(xiàng)目意義CIK細(xì)胞治療過(guò)程的評(píng)價(jià)治療前病人免疫狀況評(píng)價(jià)T亞群、NK、CIK、細(xì)胞因子是否適合做、能否能培養(yǎng)、值得做CIK采集MN

5、CMNC數(shù)目、純度、 T亞群、NK、CIK數(shù)目及比例是否達(dá)到培養(yǎng)要求、調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)MNC數(shù)目、 T亞群、NK、CIK數(shù)目及比例、CD3、CD8活化狀況培養(yǎng)培養(yǎng)是否達(dá)標(biāo)、回輸時(shí)機(jī)回輸后T亞群、NK、CIK、細(xì)胞因子療效評(píng)價(jià)、監(jiān)測(cè)、下次治療的時(shí)機(jī)CIK治療程序FCM檢測(cè)項(xiàng)目意義云云 南南 省省 腫腫 瘤瘤 醫(yī)醫(yī) 院院 腫腫 瘤瘤 研研 究究 所所 流流 式式 細(xì)細(xì) 胞胞 術(shù)術(shù) 報(bào)報(bào) 告告 單單 生物免疫治療檢測(cè)報(bào)告生物免疫治療檢測(cè)報(bào)告 門診號(hào): 住院號(hào): 42435 姓 名 曹淑英 性別 女 年齡 75 科別 腹一 編號(hào) 52 病床號(hào) 臨床診斷 胃癌術(shù)后 送檢標(biāo)本 培養(yǎng)物 日期 2006 年 02

6、月 13 日 流式細(xì)胞檢測(cè)及分析結(jié)果：流式細(xì)胞檢測(cè)及分析結(jié)果： 采 集 前 培 養(yǎng) 后 項(xiàng) 目 % ABS（610） % ABS（610） CD45+CD3+ 58.5 1068 95.5 679 CD45+CD3+CD4+ 30.8 - 60.8 - CD45+CD3+CD8+ 21.1 - 21.4 - CD45+CD3-CD56+ 17.0 245 4.6 33 CD45+CD3+CD56+ 0.5 7 43.4 310 HLA DR-CD3+ 54.8 - 24.1 - HLA DR+CD3+ 15.3 - 67.2 - HLA DR-CD8+ 31.0 - 14.9 - HLA DR

7、+CD8+ 2.0 - 20.7 - 檢測(cè)日期 2006 年 01 月 13 日 2006 年 01 月 20 日 送檢醫(yī)生 周永春 實(shí)驗(yàn)者 金從國(guó)、李佳 報(bào)告日期 2006 年 02 月 20 日 腫瘤細(xì)胞免疫特點(diǎn)AIDS全過(guò)程免疫細(xì)胞評(píng)價(jià)基礎(chǔ)免疫水平T亞群、NK、CIK當(dāng)?shù)夭煌挲g、性別、民族的免疫水平基礎(chǔ)數(shù)據(jù)高危人群HIV檢測(cè)陽(yáng)性T亞群、NK、CIK、 CD4凋亡、細(xì)胞因子HIV檢測(cè)陽(yáng)性前的免疫水平變化狀況及CD4的凋亡T亞群、NK、CIK 、CD3、CD4、CD8活化狀況、細(xì)胞因子、CD4凋亡HIV陽(yáng)性AIDS檢出HIV到發(fā)病的情況AIDS病人治療T亞群、NK、CIK、細(xì)胞因子、CD4

8、凋亡、 CD3、CD4、CD8活化狀況療效評(píng)價(jià)、監(jiān)測(cè)、治療效果及病情動(dòng)態(tài)觀察AIDS過(guò)程FCM檢測(cè)項(xiàng)目意義骨髓移植或CD34細(xì)胞移植供者動(dòng)員效果監(jiān)測(cè)圖051015202530358月4日8月5日8月5日8月6日8月6日8月7日8月7日8月8日8月8日WBC(x 109/L)MNC(x108/L)CD34+ ( x 106/L)云云 南南 省省 腫腫 瘤瘤 醫(yī)醫(yī) 院院 腫腫 瘤瘤 研研 究究 所所 流流 式式 細(xì)細(xì) 胞胞 術(shù)術(shù) 報(bào)報(bào) 告告 單單 干干/ /祖細(xì)胞相對(duì)絕對(duì)計(jì)數(shù)報(bào)告祖細(xì)胞相對(duì)絕對(duì)計(jì)數(shù)報(bào)告 流式號(hào)： 門診號(hào): 住院號(hào) 外院 姓 名 李艷華 性別 男 年齡 25 科別 外院 標(biāo)本號(hào) 20

9、070919 病床號(hào) 8 臨床診斷 NHL 送檢標(biāo)本 外周血 日期 2007 年 09 月 19 日 流式細(xì)胞檢測(cè)及分析結(jié)果：流式細(xì)胞檢測(cè)及分析結(jié)果： 項(xiàng)目 相對(duì)計(jì)數(shù) 絕對(duì)計(jì)數(shù) MNC 41.1% 30 x 108/L CD34+ 1.0% 30 x 106/L CD34+CD38- 0.9% 27 x 106/L CD34+CD38- 0.1% 3 x 106/L 送檢醫(yī)生 何迪 實(shí)驗(yàn)者 金從國(guó)、陳曉群 報(bào)告日期 2007 年 09 月 19 日 凋亡啟動(dòng)凋亡啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 動(dòng)員動(dòng)員 Caspase激活激活脫水致細(xì)胞皺縮脫水致細(xì)胞皺縮核染色質(zhì)凝縮核染色質(zhì)凝縮 線粒體膜電位喪失線粒體

10、膜電位喪失 細(xì)胞膜細(xì)胞膜PS外翻外翻 核碎片形成核碎片形成DNA被切割成低分子量片段被切割成低分子量片段細(xì)胞內(nèi)酸化細(xì)胞內(nèi)酸化凋亡小體形成凋亡小體形成三、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用技巧二利用儀器的靈活性，充分整合項(xiàng)目1 1、CIKCIK細(xì)胞作用腫瘤細(xì)胞的凋亡分細(xì)胞作用腫瘤細(xì)胞的凋亡分析析2 2、不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)染、表達(dá)情況、不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)染、表達(dá)情況3 3、不同分型增殖的細(xì)胞分布、不同分型增殖的細(xì)胞分布4 4、spsp細(xì)胞、非細(xì)胞、非spsp細(xì)胞細(xì)胞 5、腫瘤細(xì)胞診斷時(shí)、腫瘤細(xì)胞診斷時(shí) （1）、胸腹水：把白細(xì)胞和癌細(xì)胞分開）、胸腹水：把白細(xì)胞和癌細(xì)胞分開 （2）、穿刺，手術(shù)細(xì)胞：）、穿刺，手術(shù)細(xì)胞： 6、組織中

11、的浸潤(rùn)細(xì)胞：、組織中的浸潤(rùn)細(xì)胞：7、Th1/Th2細(xì)胞的分析細(xì)胞的分析四、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用技巧三 利用儀器提供的參數(shù)，對(duì)所做實(shí)驗(yàn)全面分析評(píng)價(jià)1、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中：、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中： 轉(zhuǎn)染率轉(zhuǎn)染率 疫苗疫苗 轉(zhuǎn)染的強(qiáng)度轉(zhuǎn)染的強(qiáng)度2、同時(shí)分析轉(zhuǎn)染率和轉(zhuǎn)染強(qiáng)度、同時(shí)分析轉(zhuǎn)染率和轉(zhuǎn)染強(qiáng)度3、稀有細(xì)胞的額外發(fā)現(xiàn)：、稀有細(xì)胞的額外發(fā)現(xiàn)： T亞期中：亞期中：CD45+、CD3+、CD4-、CD8- NK細(xì)胞：細(xì)胞：CD3-CD16+56+ CD3+CD16+56+4、Tunecl方法中方法中 不同周期的凋亡狀況不同周期的凋亡狀況 細(xì)胞阻滯狀況細(xì)胞阻滯狀況 DNA斷片發(fā)生時(shí)斷片發(fā)生時(shí)SOS狀況狀況五、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用技

12、巧四 了解相關(guān)知識(shí)及現(xiàn)有的評(píng)價(jià)方法，充分應(yīng)用流式細(xì)胞1. 白血病分型 形態(tài)學(xué)、免疫組化、PCR2. 細(xì)胞因子 生物活性測(cè)定法、RIA和ELISA法、DNA分析法 外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子檢測(cè)法FCM、 ELI-SPOT、FCM（STAT）3. HLA B27/B7 FCM、免疫法4. 凋亡、蛋白表達(dá) FCM、免疫組化、PCR5 . CIK、DC、CD34、CD44V、CD31等 熒光顯微鏡下經(jīng)丫啶橙/溴化乙啶染色SGC-7901細(xì)胞24hSGC-7901蒿甲醚組24 hSGC-7901 DDP組24hECV-304細(xì)胞 24hECV-304蒿甲醚組24hECV-304 DDP組24 h六、

13、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用技巧五 專項(xiàng)應(yīng)用中的問(wèn)題及解決方案免疫細(xì)胞相對(duì)絕對(duì)計(jì)數(shù)免疫細(xì)胞相對(duì)絕對(duì)計(jì)數(shù)造血干細(xì)胞和其他稀有細(xì)胞的檢測(cè)造血干細(xì)胞和其他稀有細(xì)胞的檢測(cè)血小板活化、膜糖蛋白及抗體檢測(cè)血小板活化、膜糖蛋白及抗體檢測(cè)DNA倍體分析，周期、異倍體分析倍體分析，周期、異倍體分析細(xì)胞內(nèi)因子（細(xì)胞內(nèi)因子（Th1/Th2）細(xì)胞因子（體液及培養(yǎng)液因子）細(xì)胞因子（體液及培養(yǎng)液因子）各種凋亡檢測(cè)（各種凋亡檢測(cè)（Apo.2.7 Tunecl、DNA亞二倍體）亞二倍體）組織中免疫細(xì)胞和其他細(xì)胞（如組織中免疫細(xì)胞和其他細(xì)胞（如CXCR、CCR）基因蛋白檢測(cè)（如基因蛋白檢測(cè)（如p53、Bcl-2等）等）白血病免疫分型白血病

14、免疫分型B27檢測(cè)檢測(cè)動(dòng)物檢測(cè)過(guò)程中的問(wèn)題動(dòng)物檢測(cè)過(guò)程中的問(wèn)題免疫細(xì)胞的檢測(cè)T細(xì)胞細(xì)胞 分群標(biāo)志分群標(biāo)志 活化標(biāo)志活化標(biāo)志 亞群標(biāo)志亞群標(biāo)志B細(xì)胞細(xì)胞NK細(xì)胞細(xì)胞CIK細(xì)胞細(xì)胞以T細(xì)胞亞群檢測(cè)為例，其余的免疫細(xì)胞出現(xiàn)的問(wèn)題類似1、標(biāo)準(zhǔn)方案、標(biāo)準(zhǔn)方案 抗抗 凝凝 血血 組組 織織 胸腹水、灌洗液（單細(xì)胞懸液）胸腹水、灌洗液（單細(xì)胞懸液）加入加入1ml 溶血素（溶血素（NH4Cl或或C液或液或A、B、C液）液） 上機(jī)檢測(cè)上機(jī)檢測(cè) 結(jié)果：結(jié)果：CD3+ T Cell ：%、Abs CD4+ T Cell ：%、Abs CD8+ T Cell ：%、AbsCD4/ CD8比值比值 2hr內(nèi)加入內(nèi)加入

15、100ul Flow Count （100ul/份） + 10ul 抗體標(biāo)本標(biāo)記 15-30 min2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法（1）、標(biāo)本環(huán)節(jié)）、標(biāo)本環(huán)節(jié) 抗凝血：抗凝血： A、抗凝效果不好：如果沒(méi)有大的凝血塊，該血可以使、抗凝效果不好：如果沒(méi)有大的凝血塊，該血可以使 用，但結(jié)果可能受影響。設(shè)閾值時(shí)最好采用用，但結(jié)果可能受影響。設(shè)閾值時(shí)最好采用Fl1 （CD45所在所在）;如果有大的凝血塊，不能用于檢測(cè)。如果有大的凝血塊，不能用于檢測(cè)。 B、標(biāo)本在、標(biāo)本在4或以下放置過(guò)：一般不做檢測(cè)用?；蛞韵路胖眠^(guò)：一般不做檢測(cè)用。 C、標(biāo)本放置時(shí)間大于、標(biāo)本放置時(shí)間大于48小時(shí)：檢測(cè)時(shí)盡

16、量用小時(shí)：檢測(cè)時(shí)盡量用Fl1設(shè)閾值。設(shè)閾值。 建議：最好使用新鮮標(biāo)本檢測(cè)，尤其是做絕對(duì)計(jì)數(shù)時(shí)。建議：最好使用新鮮標(biāo)本檢測(cè)，尤其是做絕對(duì)計(jì)數(shù)時(shí)。 D、動(dòng)物血：對(duì)于豬、猴、兔、狗等大動(dòng)物的，如人一樣、動(dòng)物血：對(duì)于豬、猴、兔、狗等大動(dòng)物的，如人一樣 處理。而如小白鼠等小動(dòng)物，由于所采血量少，需要處理。而如小白鼠等小動(dòng)物，由于所采血量少，需要 先溶血，后加樣處理。如需做絕對(duì)計(jì)數(shù)，則要求計(jì)算先溶血，后加樣處理。如需做絕對(duì)計(jì)數(shù)，則要求計(jì)算 稀釋倍數(shù)，比如稀釋倍數(shù)，比如10ul血加入血加入490ul溶血素相當(dāng)于稀釋了溶血素相當(dāng)于稀釋了 350倍。倍。2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法組織標(biāo)本：組

17、織標(biāo)本： 組織標(biāo)本做免疫細(xì)胞時(shí)，通常需要組織標(biāo)本做免疫細(xì)胞時(shí)，通常需要CD45設(shè)行設(shè)行，這樣可排，這樣可排 除非血細(xì)胞。除非血細(xì)胞。A、組織標(biāo)本通常不需要研磨，只需用針頭反復(fù)搗碎便可：、組織標(biāo)本通常不需要研磨，只需用針頭反復(fù)搗碎便可：這樣可以減少組織細(xì)胞的量。這樣可以減少組織細(xì)胞的量。B、穿刺細(xì)胞：手術(shù)標(biāo)本需要反復(fù)清洗表面附有的血液，、穿刺細(xì)胞：手術(shù)標(biāo)本需要反復(fù)清洗表面附有的血液，否則會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。否則會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。C、組織標(biāo)本一般保存在生理鹽水中。、組織標(biāo)本一般保存在生理鹽水中。2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法胸腹水、灌洗液胸腹水、灌洗液： 通常也需要通常也需要CD45設(shè)門

18、設(shè)門A、都需要濃縮處理：一般取、都需要濃縮處理：一般取250ml左右，靜置左右，靜置4hr后取沉后取沉淀物離心。淀物離心。B、如果需要計(jì)數(shù)，則需做體積換算，比如、如果需要計(jì)數(shù)，則需做體積換算，比如250ml500ul，相當(dāng)于濃縮了，相當(dāng)于濃縮了500倍。倍。組織、胸腹水標(biāo)本，希望做2次過(guò)濾，第一次為標(biāo)記前，采用200目過(guò)濾，第二次為上機(jī)檢測(cè)前，采用300目過(guò)濾。2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法（2）、抗體環(huán)節(jié)）、抗體環(huán)節(jié)試劑選擇試劑選擇A、盡量選擇試劑組合多的作為標(biāo)記抗體，比如、盡量選擇試劑組合多的作為標(biāo)記抗體，比如T亞群亞群CD45/CD4/CD3/CD8：最佳選擇最佳選擇CD

19、4/CD8/CD3： 可用，但做起來(lái)會(huì)有很多麻煩可用，但做起來(lái)會(huì)有很多麻煩單一抗體：?jiǎn)我豢贵w： 不可用不可用 2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法B、選擇試劑時(shí)，不但需要選擇陽(yáng)性標(biāo)記，同時(shí)也需要選、選擇試劑時(shí)，不但需要選擇陽(yáng)性標(biāo)記，同時(shí)也需要選擇陰性標(biāo)記。擇陰性標(biāo)記。比如：比如：CD4T 細(xì)胞細(xì)胞CD45+CD3+CD4+CD8- B 細(xì)胞細(xì)胞CD19+CD3- NK 細(xì)胞細(xì)胞CD3-CD16+56+ CD34+ 細(xì)胞細(xì)胞CD34+CD38-尤其在科研項(xiàng)目中，一般應(yīng)選擇尤其在科研項(xiàng)目中，一般應(yīng)選擇2-3個(gè)陽(yáng)性標(biāo)記，同時(shí)選個(gè)陽(yáng)性標(biāo)記，同時(shí)選擇擇1-2個(gè)陰性標(biāo)記，否則所做出來(lái)的結(jié)果將會(huì)有

20、很大誤差。個(gè)陰性標(biāo)記，否則所做出來(lái)的結(jié)果將會(huì)有很大誤差。2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法C、在醫(yī)學(xué)中，一般標(biāo)記抗原較弱的，需選擇較強(qiáng)的染料，、在醫(yī)學(xué)中，一般標(biāo)記抗原較弱的，需選擇較強(qiáng)的染料，尤其我們?cè)谧鱿∮屑?xì)胞的時(shí)候，比如尤其我們?cè)谧鱿∮屑?xì)胞的時(shí)候，比如DC細(xì)胞，細(xì)胞，CD34細(xì)胞，細(xì)胞，CIK細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞等，一般均選擇標(biāo)記細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞等，一般均選擇標(biāo)記PE細(xì)胞。細(xì)胞。標(biāo)記條件：一般18 25，如果溫度低或高效果都不好標(biāo)記時(shí)間：根據(jù)所用試劑量決定，一般不得低于15 min。2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法標(biāo)記的先后順序標(biāo)記的先后順序 A、先標(biāo)記膜表面的，

21、后標(biāo)記胞漿內(nèi)、先標(biāo)記膜表面的，后標(biāo)記胞漿內(nèi) B、先處理、先處理抗體抗體，后加染料，后加染料 C、透膜處理后的標(biāo)本不能強(qiáng)烈振蕩。、透膜處理后的標(biāo)本不能強(qiáng)烈振蕩。2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法 溶血環(huán)節(jié)溶血環(huán)節(jié)溶血素的選擇溶血素的選擇 A、A B 液（主要是甲酸成分），一般需要專門的制備儀液（主要是甲酸成分），一般需要專門的制備儀 C B、NH4Cl（主要成分是（主要成分是NH4Cl 、NH4HCO3、EDTA ） C、溶血素、溶血素C（專配試劑）（專配試劑）2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法 自配溶血素要求：自配溶血素要求： A、必須在儀器試驗(yàn)后方可使用、必須在儀器試

22、驗(yàn)后方可使用 B、有條件時(shí)需做、有條件時(shí)需做pH、微粒分析、微粒分析 C、放置時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，尤其是、放置時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，尤其是A液液2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法溶血液加入溶血液加入可能出現(xiàn)的問(wèn)題可能出現(xiàn)的問(wèn)題 溶血效果不好溶血效果不好v 溫度問(wèn)題：溫度問(wèn)題：C液溶血和溫度關(guān)聯(lián)較大，一般不能放液溶血和溫度關(guān)聯(lián)較大，一般不能放 4冰冰 箱，可以采用水浴箱，可以采用水浴 37 v 溶血?jiǎng)┎粔颍嚎梢噪x心后追加溶血?jiǎng)┤苎獎(jiǎng)┎粔颍嚎梢噪x心后追加溶血?jiǎng)?以上處理如果還不可以，則需要選擇：以上處理如果還不可以，則需要選擇：不重要的標(biāo)本不重要的標(biāo)本：重新再標(biāo)記：重新再標(biāo)記重要而又沒(méi)有剩余的標(biāo)本重

23、要而又沒(méi)有剩余的標(biāo)本：反復(fù)離心，選擇：反復(fù)離心，選擇1200-2000轉(zhuǎn)左轉(zhuǎn)左右的速度，建議每次離心均加入右的速度，建議每次離心均加入2-3mlNH4Cl溶血素。溶血素。有些抗體或染料對(duì)酸比較敏感：有些抗體或染料對(duì)酸比較敏感：比如比如PE標(biāo)記，溶血后會(huì)使其脫離，但這種現(xiàn)象是可逆的，靜標(biāo)記，溶血后會(huì)使其脫離，但這種現(xiàn)象是可逆的，靜置置10 -30 min2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法加入加入Flowcout環(huán)節(jié)環(huán)節(jié) Flowcout必須在加入溶血素后才能加入，否則會(huì)影響檢測(cè)必須在加入溶血素后才能加入，否則會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)加入結(jié)果，同時(shí)加入Flowcout后后 2 hr 后必須

24、上機(jī)檢測(cè)。后必須上機(jī)檢測(cè)。2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法（5）、檢測(cè)出結(jié)果環(huán)節(jié)：）、檢測(cè)出結(jié)果環(huán)節(jié)：A、上機(jī)前需要搖勻標(biāo)本，儀器開機(jī)超過(guò)、上機(jī)前需要搖勻標(biāo)本，儀器開機(jī)超過(guò)30min，F(xiàn)low check 10% 2% 外電壓穩(wěn)定等等。外電壓穩(wěn)定等等。B、方案盡量采用完整方案，比如方案盡量采用完整方案，比如T亞群：亞群：由于由于Flowcout微球在所有通道上都有信號(hào)，一般選擇沒(méi)有使用微球在所有通道上都有信號(hào)，一般選擇沒(méi)有使用的熒光通道作為收集通道，如果沒(méi)有剩余通道，就選擇熒光較的熒光通道作為收集通道，如果沒(méi)有剩余通道，就選擇熒光較強(qiáng)的染料所在的通道強(qiáng)的染料所在的通道方案是實(shí)現(xiàn)正

25、確操作和得到正確結(jié)果的平臺(tái)，建議建立方 案時(shí)盡量建立完整方案2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法C、檢測(cè)結(jié)果、檢測(cè)結(jié)果1）、檢測(cè)結(jié)果必須嚴(yán)格按醫(yī)學(xué)含義得到，比如）、檢測(cè)結(jié)果必須嚴(yán)格按醫(yī)學(xué)含義得到，比如 CD4+T細(xì)胞細(xì)胞CD45+CD3+CD4+CD8-(百姓定義上的結(jié)果百姓定義上的結(jié)果) (醫(yī)學(xué)定義上的結(jié)果醫(yī)學(xué)定義上的結(jié)果) 2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法2）、相對(duì)計(jì)數(shù)：一般醫(yī)院檢測(cè)）、相對(duì)計(jì)數(shù)：一般醫(yī)院檢測(cè)T亞群時(shí)可以只做相對(duì)數(shù)，這亞群時(shí)可以只做相對(duì)數(shù)，這樣就可以樣就可以使用使用prism門，門，CD3+%、CD4+%、CD8+ %，如果需如果需要濃度，則從血常規(guī)

26、中得到要濃度，則從血常規(guī)中得到 淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞的濃度的濃度 * 相應(yīng)的相應(yīng)的 % = 濃濃度（即所謂度（即所謂的的 雙平臺(tái)法雙平臺(tái)法），這時(shí)我們可以采用縮小設(shè)行的辦），這時(shí)我們可以采用縮小設(shè)行的辦法，得到準(zhǔn)確的法，得到準(zhǔn)確的%。3）、絕對(duì)計(jì)數(shù)：）、絕對(duì)計(jì)數(shù)：AIDS往往采用單平臺(tái)法得到濃度，這樣我們往往采用單平臺(tái)法得到濃度，這樣我們可以采用擴(kuò)大設(shè)行方法得到準(zhǔn)確的絕對(duì)數(shù)?？梢圆捎脭U(kuò)大設(shè)行方法得到準(zhǔn)確的絕對(duì)數(shù)。2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法3）、影響結(jié)果的因素：）、影響結(jié)果的因素： 電壓、補(bǔ)償不足或過(guò)頭均影響電壓、補(bǔ)償不足或過(guò)頭均影響 閾值設(shè)置不合理閾值設(shè)置不合理 設(shè)門設(shè)門范圍范

27、圍 FlowcoutDNA檢測(cè)1、固定問(wèn)題：、固定問(wèn)題：70%酒精酒精 106 細(xì)胞細(xì)胞 700 ul 冰乙醇冰乙醇2-3min2-3min300 ul 蒸餾水蒸餾水4-72 hr2、離心：、離心：1500轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)3、透膜：、透膜： triton x -100 （intra 1、intra 2）細(xì)胞因子的檢測(cè)1、解決干擾碎片、解決干擾碎片（1）、）、-20靜置，靜置，24hr（2）、）、4500轉(zhuǎn)，離心轉(zhuǎn)，離心2、強(qiáng)度問(wèn)題：外延濃度、強(qiáng)度問(wèn)題：外延濃度 0、5、10、20Capture BeadsCapture BeadsLysate SampleLysate SampleDetector Ant

28、ibodiesDetector AntibodiesWashWashAnalyze on Analyze on flow flow cytometercytometer多種細(xì)胞因子FCM（STAT）的原理Color-coded MicrospheresFL4Main MenuDifferentiation of 10 Populations*Human Th1/Th2 Cytokine I KitFL2 (Reporter Parameter)FL4(Differentiator Parameter)Main MenuHLA-B27 檢測(cè)中的問(wèn)題 利用B27 熒光強(qiáng)度判定的陽(yáng)性率很低。 原因：

29、 通常B27的判定標(biāo)準(zhǔn)是熒光強(qiáng)度大于8 ，但這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是在加全量抗體的條件下做的，而目前大多數(shù)用戶只加半量或1/4量做，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。 解決方法： 1 加全量抗體。 2 判定標(biāo)準(zhǔn)改為用陽(yáng)性率大于90%。ANNEXIN V/PI檢測(cè)凋亡的問(wèn)題 結(jié)果偏低 原因：1 沒(méi)有用試劑配套的連接緩沖液。 2 消化貼壁細(xì)胞時(shí)用胰酶。 解決方法：1 消化細(xì)胞時(shí)不要用胰酶，要用EDTA，用配套的緩沖液。PNH檢測(cè)的問(wèn)題 粒細(xì)胞上CD55，CD59檢測(cè)結(jié)果偏低，而在紅細(xì)胞上正常。 原因：在進(jìn)行抗體染色之前，沒(méi)有進(jìn)行溶血，導(dǎo)致了抗體先和紅細(xì)胞結(jié)合，而無(wú)法與白細(xì)胞充分反應(yīng)，產(chǎn)生了陰性結(jié)果。 解決方法：在染色之前，先進(jìn)行溶血洗滌，然后再染色。