金黃色葡萄球菌基因組DNA提取方法的比較研究

1、 1468中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志2008年8月第18卷第8期Chinese Journal of Health Laboratory Technology,Aug2008;Vol18No81.3培養(yǎng)方法將金黃色葡萄球菌株、單核細(xì)胞增生李斯特菌分別在平板上劃線分離,挑取單菌落,接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中, 37搖振(180r/m過(guò)夜培養(yǎng)(16h。1.4基因組DNA提取應(yīng)用4種方法進(jìn)行對(duì)比研究,每種方法所用菌量都相等(應(yīng)用上述培養(yǎng)方法離心后收集菌體,加入TE(10mmol/L Tris.C1,1mmol/L EDTA,pH8.0懸浮菌體,制成菌懸液備用。方法1【l:取300肛l菌懸液,加入30出10

2、%SDS和3Ixl 10mg/ml蛋白酶K,55水浴1h;加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1混勻,離心取上清;加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1混勻,離心取上清;加入0.1倍體積的3mol/L NaAc和2倍體積的冰的無(wú)水乙醇混勻,一20。C靜置30min,離心去上清,沉淀用75%的乙醇洗滌,干燥,沉淀溶于50斗l雙蒸水中,于一20保存。方法2¨:取300斗l菌懸液,離心,沉淀加入含10%蔗糖的TE緩沖液400一,然后加20mg/ml的溶菌酶20一,37。C,作用45min,再加入30txl,10%SDS和3山,10mg/ml蛋白酶K,55。C水浴1h;加入等體積的酚/氯仿

3、/異戊醇(25:24:1混勻,離心取上清;加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1混勻,離心取上清;加入0.1倍體積的3moVL NaAc和2倍體積的冰的無(wú)水乙醇混勻,一20靜置30min,離心去上清,沉淀用75%的乙醇洗滌,干燥,沉淀溶于50止雙蒸水中,于一20保存。方法3¨“:取300¨1菌懸液,離心,沉淀加500Ixl丙酮,混勻,冰浴5min,離心,棄上清,沉淀加入TE緩沖液210出, 20m#ml溶菌酶40斗l,37作用2h,再加入10%SDS20山,放置5min,煮沸5min,再加入TE150山、飽和酚200一、氯仿:異戊醇(24:1200“l(fā),充分振蕩混勻,離心,吸取

4、上清,加人等體積的氯仿/異戊醇(24:1混勻,離心取上清;加入0.1倍體積3moL/L NaAc和2倍體積的冰無(wú)水乙醇,置一20。C, 30min,離心去上清,沉淀用75%的乙醇洗滌,干燥,沉淀溶于50m雙蒸水中,于一20保存。方法4¨5“o(改進(jìn):取300斗l菌懸液,離心,沉淀加入1止70%乙醇混勻后,0。C,靜置20min處理后,離心,收集菌體,加入TE緩沖液共467山,20mg/ml溶菌酶12“l(fā)和1一RNase(1mg/m1,0。C1h,并間隔搖晃幾次,取出放置一20, 20min,立即放入68水浴10min,加入10%SDS53山,680C 水浴15min,取出加入5m0L

5、/L NaCl87斗l,CTAB/NaCl(1% CTAB,0.73moL/L NaCl69以68水浴15rain,一20置30min,取出加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1混勻,離心取上清;重復(fù)上述步驟一次,加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1混勻,離心取上清;最后用2倍體積的冰的無(wú)水乙醇混勻,一20靜置30min,離心去上清,沉淀用70%的乙醇洗滌,干燥,沉淀溶于50山雙蒸水中,于一20保存。1.5金黃色葡萄球菌分離菌株、李斯特氏桿菌DNA提取采用上述4種方法進(jìn)行,各種不同方法所用菌量相同,并進(jìn)行3次以上平行提取。1.6DNA得率和質(zhì)量檢測(cè)DNA定量:通過(guò)紫外260nm處吸光值計(jì)算,各方法提

6、取DNA按1:100稀釋,測(cè)260nm和280nm吸光值,DNA質(zhì)量檢測(cè)通過(guò)凝膠電泳、EB染色后紫外檢測(cè)比較¨1。1.7PCR驢增應(yīng)用金黃色葡萄球菌16S rRNA的保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物(理論擴(kuò)增長(zhǎng)度565bp來(lái)評(píng)價(jià)所提取的DNA,引物序列:上游引物一5一GTGCACATCTrGACGGTACC一3,下游引物一5一CGAAGGGGAAGGCTCTATC一37。PCR擴(kuò)增條件:95, 5min,95。C30S,4430S,72。C30S,35個(gè)循環(huán),72。C,延伸8min。擴(kuò)增產(chǎn)物4¨l進(jìn)行電脈,EB染色,紫外觀察,比較電泳圖象。2結(jié)果2.14種不同方法提取的DNA結(jié)果與分析

7、通過(guò)多次平行實(shí)驗(yàn)表明方法1、2和4提取純度較高, A260/280的值在1.82.1之間,方法3和4提取得率較高,但方法3純度偏低,從圖l可以看出,方法3DNA降解較多,其余3種方法DNA幾乎沒(méi)有降解,純度較高。綜合考慮純度和得率,選擇方法4為最佳提取方法(見(jiàn)表l和圖1。表14種不同方法提取DNA得率的比較圖14種不同方法提取DNA凝膠電泳圖泳道M為DNA Marker,1、2、3為方法2提取,4、5、6為方法4提取,7、8、9為方法3提取,10、11、12為方法1提取,分別按菌株s6、S2和26111順序上樣2.2應(yīng)用方法4分別提取三株金黃色葡萄球茵分離菌株、單核細(xì)胞增生李斯特菌DNA結(jié)果見(jiàn)

8、圖2。圖2應(yīng)用方法4提取三株金黃色葡萄球菌分離菌株、單核細(xì)胞增生李斯特菌DNA凝膠電泳圖A:三株金黃色葡萄球菌分離菌株的DNA; B:單核細(xì)胞增生李斯特菌的DNA中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志2008年8月第18卷第8期Chinese Journal of Health Laboratory Technology,Aug2008;Vol18No82.3PCR擴(kuò)增結(jié)果應(yīng)用設(shè)計(jì)的16SrRNA引物對(duì)方法4提取的6株不同金黃色葡萄球菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增,每種菌株都出現(xiàn)了很亮的條帶(見(jiàn)圖3,表明方法4提取的DNA可以用于分子生物學(xué)方面研究。圖3方法4提取六株不同金黃色葡萄球菌PCR擴(kuò)增結(jié)果3討論(1對(duì)病原微生物來(lái)說(shuō),為

9、了提取相對(duì)完整和純的基因組DNA,首先要理解病原細(xì)菌的分子特征、生理學(xué)和流行病學(xué)等特點(diǎn)。金黃色葡萄球菌為革蘭陽(yáng)性細(xì)菌,細(xì)胞壁較厚,葡萄球菌蛋白A是它細(xì)胞壁最主要的一種蛋白質(zhì),90%以上金黃色葡萄球菌都含有此蛋白,與細(xì)胞壁中的肽聚糖以共價(jià)交聯(lián)形式形成致密結(jié)構(gòu),不同菌株之間含量有明顯的差別,所以不同菌株的破壁難易程度也不一樣。(2細(xì)菌DNA的提取通常采用化學(xué)方法,提取DNA時(shí)主要依賴溶菌酶并結(jié)合其它裂解脂類和蛋白質(zhì)的酶,但是,金黃色葡萄球菌對(duì)溶菌酶具有抗性m1,與分枝結(jié)核桿菌和化膿性鏈球菌一樣對(duì)溶菌酶不敏感,因?yàn)樗鼈兌季哂袕?fù)雜的細(xì)胞壁。方法4在DNA提取之前應(yīng)用了70%乙醇處理細(xì)菌細(xì)胞¨

10、5”J,70%乙醇處理另一個(gè)作用是增加后來(lái)細(xì)胞對(duì)裂解液的敏感性,經(jīng)過(guò)乙醇處理后的細(xì)胞,再用溶菌酶處理可被很好地消化。實(shí)驗(yàn)表明,經(jīng)70%乙醇處理后提取的DNA質(zhì)量更高、更好。(3本研究參考不同文獻(xiàn)報(bào)道方法對(duì)金黃色葡萄球菌DNA提取得率和質(zhì)量進(jìn)行比較,并對(duì)方法4進(jìn)行了部分改進(jìn)¨“,使得提取的程序更為簡(jiǎn)潔,方便,方法3雖然提取得率最高,但DNA降解較多,降解的主要原因是1000C進(jìn)行5min煮沸。方法4是一個(gè)適合較寬范圍的病原細(xì)菌基因組DNA提取方法,采用16SrRNA的通用引物對(duì)所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證,證實(shí)了方法4提取的DNA對(duì)PCR擴(kuò)增無(wú)任何抑制作用,適用于其它分子生物學(xué)基本

11、操作,方法4同樣也適用于單增李斯特氏桿菌DNA的提取。綜上所述,本研究為金黃色葡萄球菌高純度DNA的提取找出了一種最好的方法,從而為金黃色葡萄球菌和其它病原菌基因操作和快速檢測(cè)技術(shù)打下基礎(chǔ),有利于實(shí)驗(yàn)室快速分子診斷和流行病學(xué)的調(diào)查研究。參考文獻(xiàn)1Franklin D,Lowy MD.Staphylococcus aureus InfectionsJ.N Engl JMed,1998,339(8:520532.2Schuenck RP,Lourenco MC,Iorio NL,et a1.Improved and rapid detection of methicillin-resistant

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