樣本采集與處理

1、樣本采集與處理Company Document number : WTUTWT88YW8BBGBBWYTT 19998樣本采集樣本采集要注意的重點(diǎn)是，所采集的臨床標(biāo)本一定要正確和采集的時間合適, 并注意采用正確的標(biāo)本容器，采集的方法程序?qū)τ行┡R床標(biāo)本非常重要。在疾 病發(fā)展過程中，標(biāo)本采集過早或過晚都可能會給出假陰性結(jié)果。盡可能在最短的時間內(nèi)完成樣本的采集（應(yīng)該保證30min內(nèi)完成，不適當(dāng) 的處理時間將直接影響和干擾研究的結(jié)果），應(yīng)盡快降低所采集組織樣本的溫 度。腫瘤組織標(biāo)本的采集和處理應(yīng)遵循嚴(yán)格的生物安全處理規(guī)范，也可根據(jù)研 究者所提出的特殊要求，按照對方提供的操作模式進(jìn)行相關(guān)處理。（1）患者

2、入院后進(jìn)行生物安全性檢查。檢測HIV以及嗜肝病毒HBV及HCV感染情況。HIV感染患者不列為采集對象。HBV及HCV感染者，須在樣本上明確注明。（3）組織標(biāo)本取材時間腫瘤外科手術(shù)后，標(biāo)本離體30min內(nèi)。（4）標(biāo)本采集每種腫瘤主要采集3類生物樣本，并要保證這些樣本的質(zhì)量和數(shù)量能夠用于DNA. RNA和蛋白質(zhì)提取及滿足相關(guān)的實驗分析。1）新鮮組織（包括手術(shù)和活檢組織）實體組織樣本采集包括外科手術(shù)切除的或活檢和尸檢得到的正常、良性 和惡性腫瘤組織。手術(shù)結(jié)束后，在臨床腫瘤病理專家的指導(dǎo)下，在不影 響病理診斷取材需要的前提下，采集組織樣本。A。標(biāo)本取材部位：腫瘤組織、癌旁組織（癌組織旁1cm）和正常組

3、織（癌組織旁5cm以外或最遠(yuǎn)處）。a）臨床診斷明確，未經(jīng)放療和化療的手術(shù)切除標(biāo)本，在病理醫(yī)生指導(dǎo)下取材。b）盡量保證癌組織沒有壞死（有壞死的標(biāo)本很難提取高質(zhì)量的RNA和蛋白）。C）配對，癌旁組織J選擇距離癌灶邊緣3 cm范圍內(nèi)的組織樣本，配對“正常組織；要選擇距癌灶邊緣5 CM以上或距離癌灶邊緣最遠(yuǎn)段（或手術(shù)切緣處）取組織樣本，應(yīng)注明距離。對于空腔器官，如食管、胃、腸、膽囊、膀胱等，*18旁組織正常組織應(yīng)取相應(yīng)部位的郵占膜組織樣本。d）在保障病理學(xué)檢測所需標(biāo)本的前提下，盡量提供足量的腫瘤和癌旁正常組織，一般不少于200mg或10E7細(xì)胞。e）手術(shù)切除的組織樣本必須迅速置于液氮中，然后保存于液氮

4、罐或80C。冰箱這一過程盡量在手術(shù)標(biāo)本離體后30分鐘內(nèi)完成。f）其中一塊組織可用OCT處理后凍存，可用于形態(tài)學(xué)觀察和顯微切割。（OCT（OptimaI Cutting Temperature）包埋劑是一種常用的固形劑。用其包埋組織進(jìn)行速凍后，能與組織固定成形，有利于保存組織結(jié)構(gòu)完整性，便于其形態(tài)結(jié)構(gòu)的分析）Bo過程：使用數(shù)碼相機(jī)拍攝標(biāo)本外觀后，將標(biāo)本切成小塊（直徑X,厚度）,為減少處理時間，標(biāo)本不應(yīng)切得太小，然后放入凍存管中，標(biāo)記后放入標(biāo) 本盒中，盒蓋上附有記錄標(biāo)本編號.采集時間及標(biāo)本類型的標(biāo)簽。每例病人樣 本保存35份凍存管標(biāo)本。每份組織重量原則上不低于2g。2）石蠟包埋組織a）中性福爾馬林

5、固定手術(shù)切除標(biāo)本按病理學(xué)操作規(guī)范進(jìn)行取材b）取材部位包括癌灶，以及癌灶周圍3cm以內(nèi)的癌旁組織，35cm的近癌組織和5cm以外的遠(yuǎn)癌組織或距癌灶邊緣最遠(yuǎn)段分別取2-3塊。取材盡量以癌灶為中心水平向兩側(cè)取材，盡量保證足夠大的組織樣本。取材應(yīng)該以遠(yuǎn)癌近癌癌灶的順序。癌灶處取材包括癌與正常組織的交界及腫瘤浸潤最深處。所有取材的組織塊應(yīng)標(biāo)明取材部位。C）采集完整的臨床病理和隨訪資料，其中治療過程和生存期的資料最為關(guān)鍵。3）血液（包括血漿、血清）始終遵循標(biāo)準(zhǔn)防護(hù)方法，所有操作均要戴手套。在抽取靜脈血時，應(yīng)當(dāng)使用一次性的安全*空采血管取代傳統(tǒng)的針頭和注射器，因為這樣可以使血液直接采集到帶塞的運(yùn)輸管和（或）

6、培養(yǎng)管中。用完后自動廢棄針頭。每例不低于全血lOmL,分裝兩份。以全血作為待測標(biāo)本時，必須注意抗凝劑的選擇，一般使用EDTA-K3或枸椽酸鈉，不可使用肝素。全血樣本如用于DNA提取檢測，可4C。下短期保存如用于RNA檢測，則應(yīng)在取血后盡快提取RNA。a）及時采集入組病例的外周血標(biāo)本，初診患者3-5 mt EDTA抗凝,3OOOrpm離心，血漿和有形成份（白細(xì)胞成分）分別用統(tǒng)一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的容器保存（盡量在2h內(nèi)完成血漿的分離工作）。b）特殊病例要保存治療前后的外周血標(biāo)本各5 ml （血漿或血清）。C）采集的血漿或血清樣本在無菌條件下分裝，mL/每管，用螺紋口管d）手術(shù)前后血漿或血清，明確臨床診斷后

7、在術(shù)前取血，術(shù)后第14天或出院前取血。e）化療前后血漿或血清采集按照臨床試驗操作規(guī)程和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)制定。0非癌患者/正常對照血漿或血清樣本，選擇年齡.性別與實驗組相匹配的非癌患者為對象。2. 根據(jù)研究課題的具體目標(biāo)，所采集的生物樣本主要用于3類實驗研究:1）測試樣本：主要用于基因、蛋白表達(dá)譜建立，基因組測序分析，樣本質(zhì)量優(yōu)先。主要考慮的因素為腫瘤分型和分類，每一類型要達(dá)到統(tǒng)計學(xué)小樣本數(shù) 目。2）驗證樣本：主要用于標(biāo)志基因變異的確認(rèn)，進(jìn)行RT-PCR. WB、IHC/ISH.突變檢測.ELISA的實驗分析。主要考慮的因素為腫瘤分型.分類和分期，包括不同階段癌前病變組織樣本，病理學(xué)診斷要明確，每一類型

8、要保 障統(tǒng)計學(xué)大樣本數(shù)目。3）分型樣本：主要用于腫瘤標(biāo)志基因或蛋白的大樣本、多中心臨床驗證,包括IHC. ELISA, REALTIMERT/PCR,基因/蛋白臨床檢測芯片的分析。臨床隨訪資料和生存期為考慮的主要因素，每一類型要保障符合多中心、大樣本 的統(tǒng)計學(xué)要求。采樣及運(yùn)輸容器標(biāo)本的采集材料如棉簽、拭子等均應(yīng)為一次性使用，采樣所用的防腐劑、 抗凝劑及相關(guān)試劑材料不應(yīng)對核酸擴(kuò)增及檢測過程造成干擾。如全血.和血漿 樣本，首先要抗凝，抗凝劑的選擇很重要。一般應(yīng)使用EDTA和構(gòu)椽酸鹽作為 抗凝劑，肝素因其對PCR擴(kuò)增有很強(qiáng)的抑制作用，且在后面的核酸提取中很難去除，故應(yīng)盡量避免使用。此外，標(biāo)本運(yùn)輸中的

9、保存液對其有稀釋作用，因此 應(yīng)考慮稀釋對測定的影響。現(xiàn)已有廠商專門有用于PCR檢測標(biāo)本采集的無核酸 酶容器供應(yīng)。樣本采集中的防污染 樣本采集最好采用一次性無菌及無核酸酶的材料，不用處理便可直接使用，采 集中要特別注意污染，防止混入操作者的頭發(fā)、表皮細(xì)胞、痰液等。如使用玻 璃器皿，必須經(jīng)DEPC水處理后高壓，以使可能存在的RNase失活，并降解 對PCR有抑制作用的DEPC。采樣質(zhì)量的評價 血清（漿）標(biāo)本可觀察標(biāo)本是否溶血、脂血及其程度，并明確這種情況是否會 對相應(yīng)的檢測造成影響。總而言之，標(biāo)本的收集及適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，對用于PCR測定的核酸模板的成功提 取，具有決定性作用。附件5腫瘤樣本采集的基本

10、技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)（適用于部分小量生物樣本提供單位 使用）1-所有入組病例要按要求采集腫瘤組織標(biāo)本、血液和具有臨床檢測意義的體液。2.送檢腫瘤組織和血液標(biāo)本最好在未經(jīng)放療和化療前采集。3送檢腫瘤標(biāo)本必須病理診斷明確，盡量保證有足夠多的癌細(xì)胞（50%以上為好）O4.癌組織沒有壞死。（有壞死的標(biāo)本很難提取高質(zhì)量的RNA和蛋白）5.在保障病理學(xué)檢測所需標(biāo)本的前提下，盡量提供足量的腫瘤標(biāo)本和癌旁正常組織，至少12克。6手術(shù)標(biāo)本必須迅速置于液氮中，然后保存于80C?；?30C。冰箱，這一過程要求在手術(shù)離體后30分鐘內(nèi)完成）。7.如果不能提供與病理學(xué)檢測平行的活檢組織標(biāo)本，至少提供5-10張組織切片。&要提

11、供與病理學(xué)檢測平行的石臘組織塊或福爾馬林固定組織標(biāo)本，或至 少提供510張組織切片。9.提供腫瘤脫落細(xì)胞涂片或組織印片5-10張10.及時采集入組病例的外周血標(biāo)本初診患者5-10 mt EDTA抗疑 3000rp.n離心，血漿和有形成份分別用統(tǒng)一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的容器保存。特殊病例要保存治療前后的外周血標(biāo)本各5 ml （血漿）。附件8 （供參與國際合作的課題組參考）國際腫瘤基因組協(xié)作研究（ICGC）腫瘤組織樣本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)三.樣本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及操作規(guī)范:1-在ICGC計劃實施一開始，就應(yīng)保證所采用的腫瘤類型和樣本的高度均-性。2.在ICGC計劃實施的一開始，應(yīng)保證使用的腫瘤樣本未經(jīng)過任何治療即原發(fā)灶，不要復(fù)發(fā)

12、的腫瘤組織樣本解剖學(xué)上為單一起源，并能代表單一組織學(xué) 類型或亞型，（最好為同一組織病理學(xué)級別）。3. 采用樣本中的腫瘤細(xì)胞要在80%以上，壞死細(xì)胞或正常細(xì)胞（炎性細(xì)胞，免疫細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞或癌前病變細(xì)胞）應(yīng)少于20%。某些種類的腫瘤可能需要適當(dāng)降低以上標(biāo)準(zhǔn)/旦是如果腫瘤細(xì)胞數(shù)低于60%時，就需要考慮利用一些物理的方法 進(jìn)行富集。4. 需要備有組織學(xué)鑒定的文檔和圖像資料能夠提供給從事特定腫瘤的研究者參考。要明確評估組織的等級1）壞死;2）碎片;3）炎性組織;4）纖維化;7.原則上海例樣本需要200 mg實體瘤組織或10E7流式細(xì)胞儀分選的細(xì)胞（血液腫瘤）。如果必須采用顯微切割分離細(xì)胞具體需要多少細(xì)胞

13、還不確定，需 進(jìn)一步明確。&雖然需要提取多種大分子但首先考慮提取高質(zhì)量的DNA同樣能夠提取 高質(zhì)量的RNA。樣本處理全血標(biāo)本血清的分離是臨床樣本收集中的一項重要內(nèi)容.所得血清可用來直接檢測 樣本中腫瘤抗原和（或）抗體；分析血清中某種標(biāo)志物以及相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn) 行細(xì)胞因子以及DNA和蛋白質(zhì)的定性和定量分析。臨床腫瘤標(biāo)本庫主要采集 接受腫瘤外科手術(shù)患者之全血標(biāo)本，采集分為術(shù)前.術(shù)后兩部分。（1）術(shù)前血 指臨床診斷明確，患者未經(jīng)任何治療，即放療.化療及免疫 治療等，已接受上述治療的患者樣本需詳細(xì)注明。（2）術(shù)后血 指接受手術(shù)后2周，患者未接受任何治療，即放療.化療及 免疫治療等。采集血清操作

14、時要嚴(yán)格注意安全防護(hù)，避免對人.環(huán)境造成污染，需認(rèn)真 注意以下事項:1）人員要求：操作時應(yīng)戴手套以及眼睛和粘膜的保護(hù)裝置。只有經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)的技術(shù)人員才能進(jìn)行這項工作。2）實驗操作技術(shù)要求：規(guī)范的操作可以避免或盡量減少噴濺和氣溶膠的產(chǎn)生。血液和血清應(yīng)當(dāng)小心吸取，而不能傾倒。嚴(yán)禁用口吸液。3）移液管使用后應(yīng)完全浸入適當(dāng)?shù)南疽嚎?。移液管?yīng)在消毒液中浸泡適當(dāng)?shù)臅r間，然后再丟棄或滅菌清洗后重復(fù)使用。4）帶有血凝塊等的廢棄標(biāo)本管，在加蓋后應(yīng)防止在適當(dāng)?shù)姆缆┤萜鲀?nèi)高壓蒸汽滅菌和（或）焚燒。5）應(yīng)備有適當(dāng)?shù)南緞﹣砬逑磭姙R和溢出標(biāo)本。步驟（1）取血液標(biāo)本，每例采集lOmL （不少于5mL） , ACD （構(gòu)

15、椽酸鹽葡萄 糖抗凝劑）抗凝（或肝素、EDTA,首選ACD其次EDTA）,用于細(xì)胞培養(yǎng) 的血液標(biāo)本，室溫保存；準(zhǔn)備DNA提取的血液標(biāo)本，4保存。約lOmL全血 分裝入紅帽管（不含抗凝劑）和紫帽管（含2%EDTA抗凝劑）中。（2）紅帽管用于分離血清，室溫放置30niin后離心。紫帽管用于分離血漿。（3）盡快離心（30min內(nèi)）。此時懸液分為三層，上層為淡黃色血漿，底層為紅細(xì)胞，在紅細(xì)胞層上呈灰白色的白細(xì)胞層為外周血淋巴細(xì)胞。（4）輕輕吸取淡黃色血漿上層液放入離心管中，每管lOOpL,共9管，余液放入1管中。做好標(biāo)記，P代表血漿，S代表血清。（5）編號后放入低溫冰箱保存。組織組織樣本可立即固定，備病

16、例診斷用；或分割后，采取不同方式進(jìn)行保 存。樣本DNA. RNA的提取按常規(guī)實驗方法提取腫瘤組織和癌旁、正常組織的基因組DNA、總RNA。石蠟切片用于核酸提取，需先用辛烷或二甲苯脫蠟，再用蛋白酶K消化后即可 進(jìn)行DNA提取。新鮮組織塊的處理步驟首先用生理鹽水洗兩次，然后將其搗 碎或切碎，加入生理鹽水后劇烈震蕩混勻，離心，棄上清，再用蛋白酶K消化 后提取核酸。3組織芯片制備組織芯片制作流程包括：陣列設(shè)計.入選樣本病理復(fù)診與標(biāo)記、取芯（供 體蠟塊）、點(diǎn)陣（受體蠟塊、切片制成組織芯片）：1）檢測芯片：主要用于檢測標(biāo)志蛋白表達(dá)狀況和水平，可以使用具有明確臨床病理學(xué)資料但隨訪時間短或無患者生存期的組織標(biāo)

17、本制備。2）分型芯片：在用于檢測標(biāo)志蛋白表達(dá)狀況和水平的基礎(chǔ)上，能夠用于臨床分子分型研究和評價。所用的組織要求有系統(tǒng)的臨床隨訪和生存期資料，這 是一個關(guān)鍵問題。樣本保存1采集的生物樣本分裝.標(biāo)記和保存是十分重要的，有些樣本要在幾年或更長的時間以后才會用于實驗研究，因此質(zhì)量監(jiān)控和檢索的方便尤為關(guān)鍵。要保 證實驗樣本的質(zhì)量和數(shù)量能夠在若干年后用于DNA、RNA和蛋白質(zhì)提取和實 驗分析。2所有生物樣本應(yīng)分裝貯存，盡量避免多次反復(fù)解凍。長期保存樣本的最適保存條件為在液氮或135C。保存。3生物樣本的容器應(yīng)采用螺口的凍存管，能夠在低溫下長期儲存，玻璃管或彈出式蓋子的管子不適合長期儲存。標(biāo)本儲存分為組織標(biāo)

18、本保存和提取物保存兩大類。1組織標(biāo)本保存(1)新鮮標(biāo)本：可用來保存新鮮標(biāo)本的實驗體系包括：細(xì)胞培養(yǎng)液、緩沖液如磷酸鹽緩沖液(PBS)、核酸保護(hù)劑(如RNA laterTM)中，或直接做干燥處理，或于室溫保存或置于冰浴中。組織標(biāo)本可在切割后的24h內(nèi)轉(zhuǎn)送到研 究者的實驗窒中。新鮮組織最好是保存于50%乙醇中，具體做法是，先用生理 鹽水將組織洗1次，切成寬度lcm的小片，加入適量的生理鹽水，然后，邊搖 邊加入無水乙醇至終濃度為50%。這樣固定的組織標(biāo)本室溫下可保存數(shù)日，4C。可保存6年。(2)凍存標(biāo)本：標(biāo)本凍存管可直接凍存于液氮,再轉(zhuǎn)移到70C。冰箱，或OCT包埋后儲存于液氮或-70C標(biāo)本在運(yùn)送過

19、程中,可將其置于冰中保存。(3)石蠟固定標(biāo)本：采用石蠟包埋，蠟塊編號,分類存放。定期整理液氮保存樣本移入80C。低溫冰箱內(nèi)長期保存。2血清樣本保存編號后分裝、低溫凍存，可置于-20C -70C冰箱或液氮罐中。有研究表明，用于RNA測定，最好是使用EDTA抗凝(嚴(yán)禁使用肝素，因其對PCR擴(kuò) 增有抑制作用，且很難再核酸提取過程中完全去除)全血標(biāo)本，抗凝后6h內(nèi)分離血漿，如使用血清標(biāo)本，則需盡快（2h內(nèi)）分離血清，標(biāo)本的短期（1-2 周）保存可在ac。下，較長期保存應(yīng)在ec。下。3體液標(biāo)本臨床體液標(biāo)本包括胸腔積液.腹水、腦脊液、尿液等.可按水樣標(biāo)本的方 式離心去沉淀后，提取核酸。臨床體液標(biāo)本長期（超

20、過2周）保存應(yīng)在70C。下。4提取物保存按常規(guī)實驗方法提取腫瘤組織和癌旁、正常組織的基因組DNA、總RNA。定量后分裝提取的核酸，保證每份標(biāo)本可供五個研究者使用，具備50100次核 酸研究用量，并保存使用記錄。由于靶核酸（尤其是RNA）易受核酸酶的作用而迅速降解，因此標(biāo)本的保 存對于核酸擴(kuò)増測定的有效性極為重要。檢測靶核酸為DNA的標(biāo)本，可在28C。下保存 3d,也可于 lOmmol/LTris, lininol/L EDTA ()緩沖液中 4C。下保存。而檢測靶核酸為RNA的標(biāo)本，一旦采集送到實驗窒后，則應(yīng)在20C%乂下 凍存。為使臨床標(biāo)本中可能存在的核酸酶失活，可加入chaotropic物

21、質(zhì)，最常用的 是4moi/L異硫氧酸肌鹽（Guanidinium isothiocyanate, GITC）,并同時與還原劑如0號基乙醇或二弦基乙醇一起使用。使用終濃度為5moI/L的GITC,可使RNase不可逆的失活，如濃度4inol/L則失去對RNase的抑制作用，而使RNA迅速降解。使用GITC作為穩(wěn)定劑保存靶核酸為RNA的標(biāo)本，標(biāo)本可在窒溫下 穩(wěn)定約7d。此外，如測定的靶核酸為血循環(huán)中的RNA,為避免窒溫放置過久而致RNA的降解，最好不要使用血清標(biāo)本，而應(yīng)使用EDTA抗凝后盡快分離 后的血漿標(biāo)本。臨床標(biāo)本置于經(jīng)過處理的濾紙片上，如靶核酸為DNA,可室溫保存數(shù)月至 數(shù)年，如靶核酸為RNA.則可穩(wěn)定數(shù)周。研究表明，保存在濾紙上的標(biāo)本，保 存時間長，還可因為標(biāo)本中的PCR抑制物如血紅蛋白、酶、免疫球蛋白等吸附 于濾紙上，而不對后面的擴(kuò)增檢測造成影響。標(biāo)本加于濾紙片上，對于標(biāo)本的 室溫運(yùn)送非常方便，適用于特定病原體的分子流