分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與步驟(共35頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上表達(dá)蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析一、原理 細(xì)菌體中含有大量蛋白質(zhì)，具有不同的電荷和分子量。強(qiáng)陰離子去污劑SDS與某一還原劑并用，通過加熱使蛋白質(zhì)解離，大量的SDS結(jié)合蛋白質(zhì)，使其帶相同密度的負(fù)電荷，在聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）上，不同蛋白質(zhì)的遷移率僅取決于分子量。采用考馬斯亮蘭快速染色，可及時(shí)觀察電泳分離效果。因而根據(jù)預(yù)計(jì)表達(dá)蛋白的分子量，可篩選陽性表達(dá)的重組體。二、試劑準(zhǔn)備1、30%儲(chǔ)備膠溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亞甲雙丙烯酰胺（Bis）1.0g，混勻后加ddH2O，37OC溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室溫。2、1.5M Tris-HC

2、l(pH 8.0)：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 濃鹽酸調(diào)pH至8.0,定容至100ml。3、1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 濃鹽酸調(diào)pH至6.8,定容至100ml。4、10% SDS：電泳級(jí)SDS 10.0 g加ddH2O 68助溶,濃鹽酸調(diào)至pH 7.2,定容至100ml。5、10´電泳緩沖液(pH 8.3)：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。6、10%過硫酸銨（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。7、2´SDS電泳上樣緩沖液：

3、1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml，b-巰基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚蘭 1.0ml，ddH2O 3.5ml。8、考馬斯亮蘭染色液：考馬斯亮蘭 0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。9、脫色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以316配制而成。二、操作步驟采用垂直式電泳槽裝置（一）聚丙烯酰胺凝膠的配制1、   分離膠(10%)的配制:    ddH2O 4.0ml   30%儲(chǔ)備膠 3.3ml   1.5M Tris-HCl 2.5m

4、l   10% SDS 0.1ml   10% AP 0.1ml  取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺)10l封底,余加TEMED 4l ,混勻后灌入玻璃板間，以水封頂，注意使液面平。（凝膠完全聚合需30-60min）2、   積層膠（4%）的配制： ddH2O 1.4 ml 30%儲(chǔ)備膠 0.33 ml 1M Tris-HCl 0.25 ml 10%SDS 0.02 ml 10%AP 0.02 ml TEMED 2 l 將分離膠上的水倒去,加入上述混合液,立即將梳子插入玻璃板間，完全聚合需15-

5、30min。（二）樣品處理：將樣品加入等量的2×SDS上樣緩沖液，100加熱3-5min，離心12000g×1min，取上清作SDS-PAGE分析，同時(shí)將SDS低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作平行處理。（三）上樣: 取10l誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)的處理后的樣品加入樣品池中,并加入20l低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照。（三）  電泳:在電泳槽中加入1´電泳緩沖液，連接電源，負(fù)極在上，正極在下，電泳時(shí)，積層膠電壓60V,分離膠電壓100V,電泳至溴酚蘭行至電泳槽下端停止（約需3hr）。（四）  染色:將膠從玻璃板中取出，考馬斯亮蘭染色液染色，室溫4-6hr。（五） 

6、 脫色:將膠從染色液中取出,放入脫色液中,多次脫色至蛋白帶清晰。（六）  凝膠攝像和保存：在圖像處理系統(tǒng)下將脫色好的凝膠攝像，結(jié)果存于軟盤中，凝膠可保存于雙蒸水中或7%乙酸溶液中。三、注意事項(xiàng)1、實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組所加總蛋白含量要相等。2、為達(dá)到較好的凝膠聚合效果，緩沖液的pH值要準(zhǔn)確，10%AP在一周內(nèi)使用。室溫較低時(shí)，TEMED的量可加倍。3、未聚合的丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，可通過皮膚和呼吸道吸收，應(yīng)注意防護(hù)。表達(dá)蛋白的分離與純化大腸桿菌表達(dá)蛋白以可溶和不溶兩種形式存在，需要不同的純化策略。現(xiàn)在，許多蛋白質(zhì)正在被發(fā)現(xiàn)而事先并不知道它們的功能，這些自然需要將蛋白質(zhì)分離出來

7、后，進(jìn)行進(jìn)一步的研究來獲得。分析蛋白質(zhì)的方法學(xué)現(xiàn)已極大的簡化和改進(jìn)。必須承認(rèn)，蛋白質(zhì)純化比起DNA克隆和操作來是更具有藝術(shù)性的，盡管DNA序列具有異乎尋常的多樣性（因而它是唯一適合遺傳物質(zhì)的），但它卻有標(biāo)準(zhǔn)的物理化學(xué)性質(zhì)，而每一種蛋白質(zhì)則有它自己的由氨基酸序列決定的物理化學(xué)性質(zhì)（因而它具有執(zhí)行眾多生物學(xué)功能的用途）。正是蛋白質(zhì)間的這些物理性質(zhì)上的差異使它們得以能進(jìn)行純化但這也意味著需要對(duì)每一種待純化的蛋白質(zhì)研發(fā)一套新的方法。所幸的是，盡管存在這種固有的困難，但現(xiàn)已有多種方法可以利用，蛋白質(zhì)純化策略也已實(shí)際可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的獲得已是相當(dāng)普遍的事?？烧T導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)特別是Studier

8、等發(fā)展的以噬菌體T7RNA聚合酶為基礎(chǔ)的表達(dá)系統(tǒng)的出現(xiàn)使人們能近乎常規(guī)地獲得過表達(dá)（overexpression），表達(dá)水平可達(dá)細(xì)胞蛋白的2%以上，有些甚至高達(dá)50%。一、可溶性產(chǎn)物的純化（融合T7·Tag的表達(dá)蛋白）（一）試劑準(zhǔn)備采用T7· Tag Affinity Purification Kit1T7·Tag抗體瓊脂。2B/W緩沖液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，2.7 mM KCl，3. 0.137mM NaCl，1%吐溫-20，pH7.3。4. 洗脫緩沖液: 0.1M檸檬酸，pH2.2。5. 中和緩沖液：2M Tris，pH

9、10.4。1.  PEG 20000。（二）操作步驟1.100ml 含重組表達(dá)質(zhì)粒的菌體誘導(dǎo)后，離心5000g×5min，棄上清，收獲菌體，用10ml預(yù)冷的B/W緩沖液重懸。2. 重懸液于冰上超聲處理，直至樣品不再粘稠，4離心 14000g×30min，取上清液，0.45m膜抽濾后作為樣品液。3. 將結(jié)合T7·Tag抗體的瓊脂充分懸起，平衡至室溫，裝入層析柱中。4. B/W緩沖液平衡后樣品液過柱。5. 10ml B/W緩沖液過柱，洗去未結(jié)合蛋白。6. 用5ml洗脫緩沖液過柱，每次1ml，洗脫液用含150l中和緩沖液的離心管收集，混勻后置于冰上，直接SDS

10、-PAGE分析。7. 將洗脫下來的蛋白放入透析袋中，雙蒸水透析24hr，中間換液數(shù)次。8.  用PEG 20000濃縮蛋白。（三）注意事項(xiàng)    蛋白在過層析柱前，要0.45m膜抽濾，否則幾次純化后，柱子中會(huì)有不溶物。二、包涵體的純化    包涵體是外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，尤其在大腸桿菌中高效表達(dá)時(shí)，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質(zhì)顆粒，在顯微鏡下觀察時(shí)為高折射區(qū)，與胞質(zhì)中其他成分有明顯區(qū)別。包涵體形成是比較復(fù)雜的，與胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)生成速率有關(guān)，新生成的多肽濃度較高，無充足的時(shí)間進(jìn)行折疊，從而形成非結(jié)晶、無定形的蛋白質(zhì)

11、的聚集體；此外，包涵體的形成還被認(rèn)為與宿主菌的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基成分、溫度、pH值、離子強(qiáng)度等因素有關(guān)。細(xì)胞中的生物學(xué)活性蛋白質(zhì)常以可融性或分子復(fù)合物的形式存在，功能性的蛋白質(zhì)總是折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)型。包涵體內(nèi)的蛋白是非折疊狀態(tài)的聚集體，不具有生物學(xué)活性，因此要獲得具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)必須將包涵體溶解，釋放出其中的蛋白質(zhì)，并進(jìn)行蛋白質(zhì)的復(fù)性。包涵體的主要成分就是表達(dá)產(chǎn)物，其可占據(jù)集體蛋白的40%95%，此外，還含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂類及糖類物質(zhì)，所以分離包涵體后，還要采用適當(dāng)?shù)姆椒ǎㄈ缟V法）進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的純化。（一）試劑配制1緩沖液A：50mM Tris

12、-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100mM NaCl。2緩沖液B：50mM Tris-HCl（pH8.0）,1mM EDTA,100 mM NaCl,1%NP-40。3緩沖液：50mM Tris-HCl （pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100(V/V),4M脲素。4緩沖液：50M Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,3% Triton X-100 。1緩沖液：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100,2M 鹽酸胍。5緩沖

13、液C：8M脲素，10mM-巰基乙醇，100 mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA及脫氧膽酸鈉。（二）操作步驟1用緩沖液A漂洗菌體細(xì)胞（10ml/g）, 離心6000g×15min，收集菌體細(xì)胞，重復(fù)此步驟，將菌體細(xì)胞再在緩沖液A中洗滌一次。2將漂洗過的菌體細(xì)胞懸浮于緩沖液B中，超聲破碎，鏡檢，破碎率高于95%，離心1500g×30min，收集包涵體沉淀。3將包涵體沉淀用緩沖液、緩沖液、緩沖液分別超聲洗滌一次，1500g 離心收集包涵體沉淀。4包涵體的溶解：用含高濃度脲素的緩沖液室溫放置30min，然后離心1500g×30min，留上清。將溶解后的

14、蛋白質(zhì)適當(dāng)稀釋，磁力攪拌，透析過夜。5溶解后的包涵體蛋白可通過親和層析進(jìn)一步純化。表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性的檢測  一、MTT比色法檢測細(xì)胞活性（一）原理    活細(xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶能催化無色的MTT形成藍(lán)色的甲肷，其形成的量與活細(xì)胞數(shù)和功能狀態(tài)呈正相關(guān)。對(duì)細(xì)胞活力有影響的表達(dá)蛋白活性檢測可以通過MTT比色法進(jìn)行。（二）試劑準(zhǔn)備1、   青鏈霉素溶液（100X）：青霉素100萬U，鏈霉素100萬U，溶于100mlddH2O中, 抽濾除菌。2、   L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基：1000mlL15培養(yǎng)基，加2g碳酸氫鈉，10m

15、l 100X青鏈霉素，5mlHEPES。3、   MTT液：5mg/ml溶于L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基。4、   SDS處理液：20gSDS，50l二甲基甲酰胺，加雙蒸水50ml溶解。5、   L-多聚賴氨酸：50g溶于1ml雙蒸水中。6、   L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解的不同濃度的蛋白液。（三）操作步驟（以背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)為例）1、 無菌條件下取新生一天的SD大鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG）。2、 鏡下去除神經(jīng)根和外膜，放入1ml 0.1%膠原酶中37消化30min，每5min搖勻一次。3、 洗去膠原酶，吹打分散后，接種于預(yù)先涂有L-

16、多聚賴氨酸的96孔培養(yǎng)板中，每孔含100l無血清L15培養(yǎng)基，細(xì)胞約800個(gè)。4、 實(shí)驗(yàn)組分別加入純化的表達(dá)蛋白（分別以不同的蛋白濃度），陰性對(duì)照加入等體積表達(dá)蛋白的溶劑。5、 37 5%CO2培養(yǎng)48hr后，每孔加入10l MTT，37 5%CO2孵育4hr。6、 加入100l 20%的SDS處理液，37孵育20hr。7、 用EL×800微孔酶標(biāo)儀測定OD570值，數(shù)據(jù)分析。 二、DRG無血清培養(yǎng)檢測促神經(jīng)生長作用（一）   操作步驟：1、無菌條件下取新生一天的SD大鼠DRG。2、鏡下去除神經(jīng)根和外膜，接種于預(yù)先涂有L-多聚賴氨酸的96孔培養(yǎng)板中，每孔1個(gè)DRG

17、。3、待DRG貼壁后加入100l無血清L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入純化的表達(dá)蛋白（分別以不同的蛋白濃度），陰性對(duì)照加入等體積的溶解表達(dá)蛋白的溶劑。4、37 5%CO2培養(yǎng)，每天在Olympus倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況，并進(jìn)行測量，其數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)分析。二、注意事項(xiàng)1、MTT有毒，注意防護(hù)。2、單個(gè)DRG貼壁實(shí)驗(yàn)操作難度較大，需仔細(xì)耐心。放射性同位素標(biāo)記的DNA序列測定分析 測定DNA的核苷酸序列是分析基因結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的前提。從小片段重疊法到加減法、雙脫氧鏈終止法、化學(xué)降解法、自動(dòng)測序，DNA測序技術(shù)發(fā)展很快。目前在實(shí)驗(yàn)室手工測序常用Sanger雙脫氧鏈終止法。Sanger法就是使用DNA聚

18、合酶和雙脫氧鏈終止物測定DNA核苷酸序列的方法。它要求使用一種單鏈的DNA模板或經(jīng)變性的雙鏈DNA模板和一種恰當(dāng)?shù)腄NA合成引物。其基本原理是DNA聚合酶利用單鏈的DNA模板，合成出準(zhǔn)確互補(bǔ)鏈，在合成時(shí)，某種dNTP換成了ddNTP，這時(shí)，DNA聚合酶利用2,3-雙脫氧核苷三磷酸作底物，使之摻入到寡核苷酸鏈的3末端，導(dǎo)致3末端無3-OH，從而終止DNA鏈的生長，雙脫氧核苷酸的種類不同，摻入的位置不同就造成了在不同的專一位置終止的長度不同的互補(bǔ)鏈。通過摻入放射性核苷酸和聚丙烯酰胺凝膠電泳，即可讀出模板DNA的互補(bǔ)鏈序列。一、 試劑準(zhǔn)備 硅化液：四氯化碳 250ml，二氯二甲基硅烷 25ml。 6

19、%變性PAGE膠的配制：丙烯酰胺 28.5g，N，N-亞甲基雙丙烯酰胺1.5g，10×TBE 50ml，尿素210g，加ddH2O至500ml攪拌溶解，0.22m濾膜過濾，4貯存于棕色瓶中。使用時(shí)取50ml加入催化劑過硫酸銨（25%）50l，TEMED 50l，輕搖混勻，立即灌膠。3.質(zhì)粒DNA堿變性液：NaOH 2M，NaAc 3M（pH4.8），無水乙醇，70%乙醇。4.T7測序試劑盒。二、操作步驟1.  測序板硅化，流水、ddH2O洗，無水乙醇洗，晾干。2.  灌膠：裝好測序板，玻璃板以15-30°角度傾斜放置，用50ml注射器將凝膠灌到兩塊玻璃之

20、間，將鯊魚齒梳子的平端插入膠的上緣，深約0.5-1cm。夾好，將測序板放水平。聚合約3hr后預(yù)電泳。3.  預(yù)電泳：按照說明要求安裝好電泳裝置，在上槽和下槽注入1×TBE。設(shè)置溫度50，功率100W，時(shí)間約30min。（同時(shí)準(zhǔn)備測序反應(yīng)）4.  質(zhì)粒DNA雙鏈堿變性：DNA 3-5g溶于32l ddH2O中，加2N NaOH 8l，混勻，室溫靜置15min。加3M NaAc 7l，無水乙醇120l，混勻，-20放置30min。離心12000g× 15min，棄上清，70%乙醇500l洗一次，離心12000g×7min。棄上清，晾干沉淀，10l滅

21、菌ddH2O溶解。5.  模板與引物復(fù)性：加2l測序引物、2l Annealing buffer，混勻，稍稍離心，65溫育 5min，立即放置于3710min，室溫5min以上。6.  標(biāo)記反應(yīng)：加 3l labeling mixture 、1l相應(yīng)放射性同位素（10Ci）、2l T7測序酶（使用前以稀釋液15稀釋），混勻，離心，置375min。7.  預(yù)先準(zhǔn)備四個(gè)0.5ml微量離心管，標(biāo)上A、C、G、T，分別在其中加入2.5l的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。8.  鏈終止反應(yīng)：在A、C、G、T四個(gè)微量離心管中分別加入反應(yīng)液4.5l，3

22、7 5min。加入stop solution 5l，短暫離心。9.  上樣：關(guān)上預(yù)電泳電源，沖洗膠平面，將鯊魚齒插入膠平面中約1-2mm形成加樣孔。將四個(gè)反應(yīng)管置80 2min。立即取1.5-2l加到加樣孔上。10電泳: 50，100W，電泳2.5hr后，暫停電泳，在預(yù)留孔二次上樣后，繼續(xù)電泳2.5hr。11下膠：停止電泳，取下測序板，倒掉電泳緩沖液。拆開測序板，凝膠應(yīng)粘在未硅化的的玻璃板上。裁一張比膠稍大一些的濾紙，平鋪在膠上，掀起濾紙，凝膠就被一起掀起。12壓片：將凝膠蓋上保鮮膜，用monitor測讀放射強(qiáng)度，以估計(jì)曝光時(shí) 間。在暗室中覆上X光片，置暗夾中，-70放射自顯影。13

23、洗片、讀片：取出暗夾，回到室溫。經(jīng)D72顯影、酸性定影液定影，水洗, 晾干。在X光片燈上讀出序列。三、注意事項(xiàng)1.    測序板清洗、硅化的好壞直接影響灌膠及下膠。處理不好時(shí)容易導(dǎo)致灌膠時(shí)氣泡的產(chǎn)生，下膠時(shí)則易使電泳膠損壞。2. 灌膠時(shí)要避免膠的滲漏；注射器將凝膠灌到兩塊玻璃之間時(shí)，注意速度的控制，防止氣泡的產(chǎn)生。3. 測序反應(yīng)及電泳上樣時(shí)要注意小心操作，防止放射性同位素污染，同時(shí)要加強(qiáng)整個(gè)后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中自身的防護(hù)。4. 規(guī)范、妥善處理放射性同位素接觸物品及廢棄物。 手工測序需要使用同位素，這給操作帶來許多不便，對(duì)操作者也有一定的損害。DNA測序儀的出現(xiàn)解決了這一

24、問題，它不使用同位素標(biāo)記，自動(dòng)化程度高，測序效果好。雖然DNA測序儀的價(jià)格目前仍比較高，但每次測序的花費(fèi)并不算高，而且商品化服務(wù)也令人滿意。聚合酶鏈反應(yīng)一單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析 (PCR-SSCP) 聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（Single Strand Conformation Polymorphism Analysis of Polymerase Chain Reaction Products, PCR-SSCP）是近年來發(fā)展起來的一種基因分析方法。 PCR-SSCP分析的基本程序?yàn)椋菏紫萈CR擴(kuò)增特定靶序列，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物變性為單鏈，進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。在不含變性劑的中性聚丙

25、烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，DNA單鏈的遷移率除與DNA鏈的長短有關(guān)外，更主要的是取決于DNA單鏈所形成的構(gòu)象。在非變性條件下，DNA單鏈可自身折疊形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。這種構(gòu)象由DNA單鏈堿基決定，其穩(wěn)定性靠分子內(nèi)局部順序的相互作用（主要為氫鍵）來維持。相同長度的DNA單鏈其順序不同，甚至單個(gè)堿基不同，所形成的構(gòu)象不同，電泳遷移率也不同。PCR產(chǎn)物變性后，單鏈產(chǎn)物經(jīng)中性聚丙烯酰胺凝膠電泳，靶DNA中含單堿基置換，或數(shù)個(gè)堿基插入或缺失等改變時(shí)，因遷移率變化會(huì)出現(xiàn)泳動(dòng)變位，從而可將變異DNA與正常DNA區(qū)分開。由此可見，PCR-SSCP分析技術(shù)是一種DNA單鏈凝膠電泳技術(shù)，它根據(jù)形成不同構(gòu)象的等長

26、DNA單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率變化來檢測基因變異。該技術(shù)已被廣泛用于癌基因和抗癌基因變異的檢測、遺傳病的致病基因分析以及基因診斷、基因制圖等領(lǐng)域。為了高靈敏特異性地顯示SSCP分析結(jié)果，現(xiàn)已發(fā)展多種PCR-SSCP技術(shù)，各有其優(yōu)勢及適用領(lǐng)域。例如，可以在PCR擴(kuò)增中用同位素或熒光素等標(biāo)記引物或核苷，也可以在電泳后用銀染或溴化乙錠染色以顯示結(jié)果。這里將重點(diǎn)介紹最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。在進(jìn)行PCR擴(kuò)增特定靶基因序列時(shí)，利用-32P-ATP標(biāo)記引物或直接在PCR反應(yīng)體系中加入-32P-dCTP進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使擴(kuò)增產(chǎn)物帶有同位素標(biāo)記物，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物變性為單鏈進(jìn)行非變性

27、聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影顯示結(jié)果。利用引物標(biāo)記或堿基摻入法使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物帶有同位素標(biāo)記物，均可使產(chǎn)物信號(hào)增強(qiáng)幾個(gè)數(shù)量級(jí)。二者相比較，前者經(jīng)濟(jì)、擴(kuò)增特異性強(qiáng)，多用于大樣本的檢測和篩選；后者操作簡便，適于一般實(shí)驗(yàn)室開展，可用于小樣本或大樣本的檢測和篩查。本節(jié)僅介紹同位素標(biāo)記堿基摻入法。一、試劑準(zhǔn)備PCR相關(guān)試劑-32P-dCTP30聚丙烯酰胺（29：1）：丙烯酰胺29g、甲叉雙丙烯酰胺 1g，溶于100ml ddH2O中，4 OC保存。10過硫酸胺配制方法：1g 過硫酸胺，溶于10ml ddH2O中，4 OC保存（可用數(shù)周）。TEMED（N，N，N，N，N-四甲基乙二胺） 5×T

28、BE緩沖液：Tris堿54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA(pH 8.0) 20ml，加ddH2O至1000ml。7變性上樣液：95% 甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚藍(lán)、 20mM EDTA(pH 8.0)二、操作步驟 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)總體積為10l，在0.5ml微量離心管中加入下列反應(yīng)成分： 10×buffer    1l dNTPmix    70M DNA模板 100ng 引物及Taq DNA酶 依實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求按比例加入 -32P-dCTP 0.1l 加ddH2O至    10l 按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)循環(huán)參數(shù)進(jìn)

29、行擴(kuò)增，獲取擴(kuò)增產(chǎn)物。 聚丙烯酰胺凝膠電泳 電泳槽玻璃板的處理：用洗滌劑清洗玻璃板，自來水反復(fù)沖凈洗滌劑，雙蒸水沖洗3次，晾干，95乙醇擦拭，自然干燥。用棉簽沾取SigmaCote涂于玻璃的貼膠面上， 510min后再用軟紙擦拭除去多余的SigmaCote溶液。在兩塊玻璃內(nèi)的兩側(cè)放好襯條對(duì)齊，用固定夾夾緊兩塊玻璃，并用玻璃膠帶封邊。 制膠：按照被分離DNA片段的大小、含量及玻璃板、襯條的大小決定凝膠的濃度與體積，一般來講使用58的凝膠較為合適。輕輕搖勻配制的膠液于真空抽氣（開始時(shí)要緩慢）除氣泡，加 35l TEMED至聚丙烯酰胺混合液中，混勻。用10ml玻璃吸管或50ml注射器吸取膠液，將玻璃

30、模具傾斜成60O角，緩慢注入兩玻璃板間的空隙中，直至灌滿模具頂部。立即插入相應(yīng)的點(diǎn)樣梳，（小心勿使梳齒下帶進(jìn)氣泡，并且不要將梳齒全部插入膠內(nèi)，留約2mm梳齒于玻璃板上端，以免拔梳時(shí)把膠孔拔斷）。由于凝膠在聚合過程中有回縮，所以應(yīng)小心添加些膠液于梳子處，水平放置，室溫聚合1hr。將封口玻璃膠帶掀去，放入電泳槽，凹型玻璃貼緊電泳緩沖液槽，用大號(hào)固定夾固定住兩側(cè)。在上下電泳槽內(nèi)灌入 1×TBE電泳緩沖液。小心取出點(diǎn)樣梳，用槽內(nèi)的緩沖液反復(fù)沖洗點(diǎn)樣孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和氣泡。 擴(kuò)增產(chǎn)物的處理：將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與變性上樣液按1：5的比例加入0.5ml微量離心管中，混勻。樣品

31、上膠前應(yīng)98 o C變性10min，立即冰浴驟冷。取約35l變性樣品（根據(jù)點(diǎn)樣孔的大小決定上樣量），以微量加樣器上樣，（上樣時(shí)要注意不要有氣泡沖散樣品，而且速度要快，時(shí)間長了樣品易于擴(kuò)散）。 電泳：電泳槽接上電極（上槽接負(fù)極，下槽接正極）開啟電源，根據(jù)擴(kuò)增片段的大小及電泳槽和凝膠的大小，決定電泳的電壓及電泳時(shí)間。通常室溫下以l5Vcm電泳。 剝膠：電泳結(jié)束后，倒棄電泳緩沖液，取下電泳膠玻璃，用塑料楔子從玻璃板底部一角小心分開玻璃，凝膠應(yīng)附著在一塊玻璃上，切去凝膠左上角，作為點(diǎn)樣順序標(biāo)記。剪一張與玻璃同樣大小的濾紙，嚴(yán)密覆蓋于凝膠上，順一個(gè)方向?qū)⒛z緩慢取下，用保鮮膜蓋于膠面并包好，避免膜和膠之

32、間產(chǎn)生氣泡或皺折，將凝膠固定在X線片夾中。放射自顯影：在暗室中將X線片貼于膠面，蓋嚴(yán)片夾，用黑布將X線片夾包裹，置-70OC放射自顯影。曝光時(shí)間根據(jù)同位素的強(qiáng)度而定，約 24h10d。 沖洗膠片從-70oC取出X線片夾，在暗室內(nèi)迅速取出X線片，立即顯影，以免使X線片上出現(xiàn)過多的冷凝水。（如果想再得到一張放射自顯影影像，可立即在片夾中裝一張新X線片并盡快放回到一70oC繼續(xù)顯影。如果來不及再加入新片即已出現(xiàn)冷凝水則應(yīng)使樣品凝膠和X線片夾都恢復(fù)到室溫，并擦去冷凝水后再裝入新的X線片）。依次按以下程序操作進(jìn)行顯影： X線片顯影液顯影 1-5min 水洗 lmin 定影液定影 5min 流動(dòng)水沖洗 1

33、5min    所有使用液的溫度應(yīng)為1820OC為宜。三、注意事項(xiàng) 核酸片段的大小: 用于SSCP分析的核酸片段越小，檢測的敏感性越高。對(duì)于<200bp的片段，SSCP可發(fā)現(xiàn)其中70的變異；對(duì)于300bP左右的片段則只能發(fā)現(xiàn)其中50的變異；而500bp的片段，則僅能檢出103O的變異，因此，<300bP，尤其是150bP左右的核酸片段更適于SSCP分析。對(duì)于大于400bp的PCR產(chǎn)物就需要設(shè)法進(jìn)一步處理，可以用限制性酶消化PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生小于400bP的DNA片段，再進(jìn)行SSCP分析。 游離引物: 游離引物可能同 PCR產(chǎn)物結(jié)合而改變其泳動(dòng)率，即使游離

34、引物量為6nM都有明顯影響。因此，應(yīng)盡可能除去游離引物?？梢圆捎貌粚?duì)稱引物擴(kuò)增方法，盡可能消耗多余的引物。也可以運(yùn)用過柱或磁性球方法純化PCR產(chǎn)物?；蛘呤窍♂孭CR產(chǎn)物，減少游離引物的干擾。 低濃度變性劑: 凝膠中加入低濃度的變性劑，如5-10甘油、5尿素或甲酸胺、10二甲亞砜（DMSO）或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因?yàn)檩p微改變單鏈DNA的構(gòu)象，增加分子的表面積，降低單鏈DNA的泳動(dòng)率。但有些變異序列卻只能在沒有甘油的凝膠中被檢出。因此，對(duì)同一序列使用23種條件做SSCP，可能提高敏感性。 電泳溫度: 一般認(rèn)為保持凝膠內(nèi)溫度恒定是SSCP分析最關(guān)鍵的因素，溫度有可能直接影響DNA分子內(nèi)部穩(wěn)

35、定力的形成及其所決定的單鏈構(gòu)象，從而影響突變的檢出。室溫下電泳適于大多數(shù)情況，但由于在電泳時(shí)溫度會(huì)升高，為確保電泳溫度相對(duì)恒定，應(yīng)采取以下措施：減少凝膠厚度，降低電壓，有效的空氣冷卻或循環(huán)水冷卻等。 凝膠的長度: 可用測序板進(jìn)行SSCP分析，凝膠板長度在40cm以上。 凝膠濃度及厚度: 凝膠濃度很重要，一般使用58的凝膠，凝膠濃度不同，突變帶的相對(duì)位置也不相同，如果在進(jìn)行未知突變種類的SSCP分析時(shí)，最好采用兩種以上凝膠濃度，這樣可以提高突變種類的檢出率。凝膠的厚度對(duì)SSCP分析也很重要，凝膠越厚，背景越深，在上樣量較多的前提下，盡量使凝膠越薄越好。 假陰性: 一般認(rèn)為，如沒有污染，PCRSS

36、CP分析不存在假陽性結(jié)果，但可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果，后者是由于點(diǎn)突變引起的空間構(gòu)象變化甚微，遷移率相差無幾所致，尤其是點(diǎn)突變發(fā)生在擴(kuò)增片段的兩端時(shí)。如果有陽性和陰性對(duì)照，結(jié)果可以重復(fù)確定的突變帶是可信的，如果沒有陽性對(duì)照，應(yīng)經(jīng)測序來確定其是否為突變帶。由于PCRSSCP的不足之處主要是可能檢出假陰性結(jié)果。應(yīng)通過設(shè)置陽性對(duì)照，摸索電泳條件，假陰性結(jié)果在很大程度上是可以避免的。但對(duì)未知基因變異的檢測，假陰性結(jié)果就難以百分之百地消除。8. 結(jié)果分析: 單鏈凝膠電泳時(shí)，互補(bǔ)單鏈遷移率不同，一般形成兩條單鏈帶。PCR產(chǎn)物進(jìn)行單鏈凝膠電泳之前，通過加熱變性產(chǎn)生單鏈。如變性不徹底，殘留雙鏈亦可形成一條帶因此，P

37、CRSSCP分析結(jié)果至少顯示三條帶。但是，由于一種DNA單鏈有時(shí)可形成兩種或多種構(gòu)象，檢出三條或四條單鏈帶就不足為奇。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。典型的PCR由（1）高溫變性模板；（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)，通過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。其主要步驟是：將待擴(kuò)增的模板DNA置高溫下（通常為93-94）使其變性解成單鏈；人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補(bǔ)結(jié)合，兩個(gè)

38、引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴(kuò)增片段的長短；耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在72將單核苷酸從引物的3端開始摻入，以目的基因?yàn)槟０鍙?3方向延伸，合成DNA的新互補(bǔ)鏈。 PCR能快速特異擴(kuò)增任何已知目的基因或DNA片段，并能輕易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因擴(kuò)增達(dá)到納克、微克、毫克級(jí)的特異性DNA片段。因此，PCR技術(shù)一經(jīng)問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。它不僅可以用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析，還可以用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達(dá)調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病的診斷，腫瘤機(jī)制的探索，法醫(yī)鑒定等諸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有著

39、以下多種用途：(1) 生成雙鏈DNA中的特異序列作為探針；(2) 由少量mRNA生成 cDNA文庫；(3) 從cDNA中克隆某些基因；(4) 生成大量DNA以進(jìn)行序列測定；(5) 突變的分析；(6) 染色體步移；(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多態(tài)性分析等。一、試劑準(zhǔn)備1. DNA模版2對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物310×PCR Buffer 42mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM5Taq酶二、操作步驟 1在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。 10×PCR buffer 5 l dNTP mix （2

40、mM） 4 l 引物1（10pM） 2 l 引物2（10pM） 2 l Taq酶 （2U/l） 1 l DNA模板（50ng-1g/l） 1 l 加ddH2O至                     50 l 視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。2 調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93 40s 58 30s 7

41、2 60s，循環(huán)30-35次，最后在72 保溫7min。3 結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4待電泳檢測或-20長期保存。4PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100l氯仿進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10l電泳檢測。三、PCR反應(yīng)體系的組成與反應(yīng)條件的優(yōu)化 PCR反應(yīng)體系由反應(yīng)緩沖液（10×PCR Buffer）、脫氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分組成。各個(gè)組份都能影響PCR結(jié)果的好壞。1 反應(yīng)緩沖液：一般隨Taq DNA聚合酶供應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)緩沖液含：5

42、0mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3室溫），1.5mM MgCl2。Mg2+的濃度對(duì)反應(yīng)的特異性及產(chǎn)量有著顯著影響。濃度過高，使反應(yīng)特異性降低；濃度過低，使產(chǎn)物減少。在各種單核苷酸濃度為200M時(shí)，Mg2+為1.5mM較合適。若樣品中含EDTA或其它螯合物，可適當(dāng)增加Mg2+的濃度。在高濃度DNA及dNTP條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，也必須相應(yīng)調(diào)節(jié)Mg2+的濃度。據(jù)經(jīng)驗(yàn)，一般以1.5-2mM（終濃度）較好。2 dNTP ：高濃度dNTP易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，過高則可能不擴(kuò)增；但濃度過低，將降低反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量。PCR中常用終濃度為50-400M的dNTP。四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度應(yīng)相同，如果

43、其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)誘發(fā)聚合酶的錯(cuò)誤摻入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應(yīng)。此外，dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。因此，dNTP的濃度直接影響到反應(yīng)中起重要作用的Mg2+濃度。3 Taq DNA聚合酶酶：在100l反應(yīng)體系中，一般加入2-4U的酶量，足以達(dá)到每min延伸1000-4000個(gè)核苷酸的摻入速度。酶量過多將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。但是，不同的公司或不同批次的產(chǎn)品常有很大的差異，由于酶的濃度對(duì)PCR反應(yīng)影響極大，因此應(yīng)當(dāng)作預(yù)試驗(yàn)或使用廠家推薦的濃度。當(dāng)降低反應(yīng)體積時(shí)（如20l或50l），一般酶的用量仍不小于2U，否則反應(yīng)效率將降

44、低。4 引物：引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計(jì)在PCR反應(yīng)中極為重要。要保證PCR反應(yīng)能準(zhǔn)確、特異、有效地對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通常引物設(shè)計(jì)要遵循以下幾條原則： 引物的長度以15-30bp為宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55Tm=4(G+C)+2(A+T)。應(yīng)盡量避免數(shù)個(gè)嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，堿基的分布應(yīng)表現(xiàn)出是隨機(jī)的。 引物的3端不應(yīng)與引物內(nèi)部有互補(bǔ)，避免引物內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，兩個(gè)引物在3端不應(yīng)出現(xiàn)同源性，以免形成引物二聚體。3端末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。兩條引物間配對(duì)堿基數(shù)少于5個(gè)，引物自身配對(duì)若形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對(duì)數(shù)不能超過3個(gè)由于影響引物

45、設(shè)計(jì)的因素比較多，現(xiàn)常常利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)。 人工合成的寡聚核苷酸引物需經(jīng)PAGE或離子交換HPLC進(jìn)行純化。 引物濃度不宜偏高，濃度過高有兩個(gè)弊端：一是容易形成引物二聚體（primer-dimer），二是當(dāng)擴(kuò)增微量靶序列并且起始材料又比較粗時(shí)，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般說來，用低濃度引物不僅經(jīng)濟(jì)，而且反應(yīng)特異性也較好。一般用0.25-0.5pM/l較好。 引物一般用TE配制成較高濃度的母液（約100M），保存于-20。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10M或20M的工作液。5 模板：PCR對(duì)模板的要求不高，單、雙鏈DNA均可作為PCR的樣品。雖然PCR可以用極微量的樣品（甚至是來自單一

46、細(xì)胞的DNA）作為摸板，但為了保證反應(yīng)的特異性，一般還宜用g水平的基因組DNA或104拷貝的待擴(kuò)增片段作為起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至僅需用溶劑一步提取之后即可用于擴(kuò)增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結(jié)合DNA的蛋白，將可能干擾PCR反應(yīng)。6 PCR循環(huán)加快，即相對(duì)減少變性、復(fù)性、延伸的時(shí)間，可增加產(chǎn)物的特異性。四、注意事項(xiàng)PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。最好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中

47、均應(yīng)戴手套。PCR試劑配制應(yīng)使用最高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22m濾膜過濾除菌或高壓滅菌。試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。帶有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必須克隆到具有匹配末端的線性質(zhì)粒載體中,但是在連接反應(yīng)時(shí),外源DNA和質(zhì)粒都可能發(fā)生環(huán)化,也有可能形成串聯(lián)寡聚物。因此，必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩個(gè)DNA 的濃度，以便使“正確”連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到最佳水平，此外還常常使用堿性磷酸酶去除

48、5磷酸基團(tuán)以抑制載體DNA的自身環(huán)化。利用T4 DNA連接酶進(jìn)行目的DNA片段和載體的體外連接反應(yīng)，也就是在雙鏈DNA 5磷酸和相鄰的3羥基之間形成新的共價(jià)鍵。如載體的兩條鏈都帶有5磷酸（未脫磷），可形成4個(gè)新的磷酸二酯鍵；如載體DNA已脫磷，則只能形成2個(gè)新的磷酸二酯鍵，此時(shí)產(chǎn)生的重組DNA帶有兩個(gè)單鏈缺口，在導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞后可被修復(fù)。（二）T4 DNA連接酶對(duì)目的DNA片段和載體連接的一般方案1連接反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。210l體積反應(yīng)體系中：取載體50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般線性載體DNA分子與外源DNA分子摩爾數(shù)為11-15），補(bǔ)足ddH2O

49、 至8l。3輕輕混勻，稍加離心，56水浴5min后，迅速轉(zhuǎn)入冰浴。4加入含ATP的10×Buffer 1l，T4 DNA連接酶合適單位， 用ddH2O 補(bǔ)至10l，稍加離心，在適當(dāng)溫度（一般14-16水?。┻B接8-14hr。四、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化1.感受態(tài)細(xì)胞的制備 保存于-70的DH5（或其他菌種）用接種環(huán)劃菌于1.5%瓊脂平板上，37恒溫倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)（約14-16 hr）。 挑取單菌落，接種于2.0ml LB液體培養(yǎng)基中，37恒溫，250g振蕩培養(yǎng)過夜（約12hr）。 取0.5ml 過夜培養(yǎng)液，接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)2-2.5hr，至OD600為0.

50、4-0.5時(shí)，放置于4冰箱冷卻1-2hr。（注：以下操作均應(yīng)在冰浴中進(jìn)行。） 將培養(yǎng)液分入兩個(gè)50ml離心管中，4離心，4000g×10min，棄去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml懸浮30min。 4離心,4000g×10min，棄去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml懸浮。 以100l/管分裝入1.5ml離心管中，-70凍存?zhèn)溆谩?注：此法制備感受態(tài)細(xì)胞，可使每微克超螺旋質(zhì)粒DNA產(chǎn)生5×106-2×107個(gè)菌落，這樣的轉(zhuǎn)化效率足以滿足所有在質(zhì)粒中進(jìn)行的常規(guī)克隆的需要，制備的感受態(tài)細(xì)胞可貯存于-70，但保存時(shí)間過長會(huì)使轉(zhuǎn)化效

51、率在一定程度上受到影響，一般三個(gè)月以內(nèi)轉(zhuǎn)化效率無多大改變。2. 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 取100l貯存于-70鈣化菌，冰浴化開； 加入適量連接產(chǎn)物（一般不超過10l，輕輕混勻，冰浴20min； 于42熱休克90s，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，繼續(xù)冰浴2-3min； 加入LB液體培養(yǎng)基200l，于37緩搖孵育45min； 將培養(yǎng)物適量涂于1.5%瓊脂LB平板（根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)添加抗生素或/和X-Gal/IPTG），待膠表面沒有液體流動(dòng)時(shí)，37溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr。五、重組子的篩選 根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如-互補(bǔ)、抗生素基因等?，F(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有-半乳糖苷酶基因（

52、lacZ）的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為-互補(bǔ)。由-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無-互

53、補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。如用藍(lán)白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后，有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。六、注意事項(xiàng)1.    目的DNA片段制備、回收、純化時(shí)，應(yīng)避免外來DNA污染。2. 不同廠家生產(chǎn)的T4 DNA連接酶反應(yīng)條件稍有不同，但其產(chǎn)品說明書上均有最適反應(yīng)條件，包括對(duì)不同末端性質(zhì)DNA分子連接的T4 DNA連接酶的用量、作用溫度、時(shí)間等。同時(shí)提供有連接酶緩沖液（10×、5×、2×），其中多已含有要求濃度的ATP，應(yīng)避免高溫放置和反

54、復(fù)凍融使其分解。2.    連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)特殊試劑處理后在適當(dāng)?shù)臈l件下具有接收外源DNA的能力，因此可將上述連接產(chǎn)物通過熱刺激或電脈沖轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)菌大量增殖的同時(shí)，導(dǎo)入的重組DNA也得到增殖。3.    制備感受態(tài)細(xì)胞所用離心管、培養(yǎng)瓶最好經(jīng)酸堿處理或使用新的，15 lbf/in2高壓滅菌20min。5. 白色菌落中重組質(zhì)粒內(nèi)插入片段是否是目的片段需通過鑒定。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的

55、原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。一、反轉(zhuǎn)錄酶的選擇1 Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性，RNA酶H活性相對(duì)較弱。最適作用溫度為37。2 禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42。3The

56、rmus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在Mn2+存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA，以消除RNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)。4MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H-突變體：商品名為SuperScript 和SuperScript。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，這一特性允許從含二級(jí)結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。二、合成cDNA引物的選擇1   隨機(jī)六聚體引物：當(dāng)特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時(shí)，可采用隨機(jī)六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時(shí)，

57、體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴(kuò)增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。2   Oligo(dT)：是一種對(duì)mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物與其配對(duì)，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。3   特異性引物：最特異的引發(fā)方法是用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應(yīng)用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA 3端最靠近的配對(duì)引物起始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增。二、 試劑準(zhǔn)備1RMA提取試劑2第一鏈cDNA合成試劑盒3dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM4Taq DNA聚合酶三、操作步驟1. 總RNA的提?。阂娤嚓P(guān)內(nèi)容。2. cDN