實(shí)驗(yàn)十二 DNA的限制性內(nèi)切酶酶切分析

1、教案首頁(yè)第_5_次課 授課時(shí)間：2007年11月27日11月30日課程名稱生物化學(xué)與分子生物實(shí)驗(yàn)課年級(jí)2006專業(yè)、層次臨床醫(yī)學(xué)本科授課教師許成山職稱課 型(大、小)小學(xué)時(shí)4授課題目（章、節(jié)）實(shí)驗(yàn)十二 DNA的限制性內(nèi)切酶酶切分析基本教材或主要參考書(shū)自編 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教學(xué)目的與要求：1、實(shí)現(xiàn)DNA的體外重組，鑒定Bcl-2重組質(zhì)粒中的插入片段。2、學(xué)會(huì)設(shè)計(jì)構(gòu)建體外重組DNA分子，根據(jù)目的基因合理選擇載體與限制性內(nèi)切酶以及DNA的酶切技術(shù)。大體內(nèi)容與時(shí)間安排，教學(xué)方法：1、DNA限制性內(nèi)切酶酶切分析與瓊脂糖凝膠電泳的原理 10min2、DNA瓊脂糖凝膠電泳的操作過(guò)程（錄像） 5m

2、in3、EcoR酶切操作步驟的改動(dòng)及實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 5min4、學(xué)生做實(shí)驗(yàn) 140min教學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)+示教教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：重點(diǎn)：1、DNA限制性內(nèi)切酶酶切分析與瓊脂糖凝膠電泳的原理2、DNA限制性內(nèi)切酶酶切分析的注意事項(xiàng)難點(diǎn)：DNA限制性內(nèi)切酶酶切分析的原理教研室審閱意見(jiàn)：教研室主任簽名：年 月 日基本內(nèi)容輔助手段和時(shí)間分配一、實(shí)驗(yàn)原理（一）EcoR酶切重組質(zhì)粒Bcl-2的原理：限制性內(nèi)切酶(RE)是由細(xì)菌自己產(chǎn)生的能識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定堿基順序，并以內(nèi)切方式水解核酸中的磷酸二酯鍵的核酸水解酶。它可分為三種類型：、和型，型酶就是通常所指的RE，能識(shí)別雙鏈DNA的特異順序，并在這個(gè)順序內(nèi)進(jìn)

3、行切割。本實(shí)驗(yàn)是將實(shí)驗(yàn)十制備的人Bcl-2重組質(zhì)粒DNA作為EcoR酶切底物。人Bcl-2重組質(zhì)粒是EcoR單酶切的pBluescriptKS(-)載體與EcoR單酶切的人Bcl-2 cDNA重組而成的，大小為4 861bp，前者是一種由pUC19質(zhì)粒衍生而來(lái)的具有2 961bp的質(zhì)粒載體。因此用EcoR酶切則應(yīng)得到空載pBluescriptKS(-)載體(2.96kb)和人Bcl-2 cDNA (1.9kb) 兩個(gè)片段。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可較容易鑒定鑒定該質(zhì)粒中的插入片段。（二）瓊脂糖凝膠電泳的原理瓊脂糖凝膠電泳是重組DNA研究中常用的技術(shù)，可用于分離，鑒定和純化DNA片段。不同大小、不同形

4、狀和不同構(gòu)象的DNA分子在相同的電泳條件下(如凝膠濃度、電流、電壓、緩沖液等)，有不同的遷移率，所以可通過(guò)電泳使其分離。凝膠中的DNA可與熒光染料SYBR Green I結(jié)合，在紫外燈下可看到桔紅色熒光條帶，籍此可分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。二、DNA瓊脂糖凝膠電泳的操作過(guò)程三、操作步驟（改動(dòng)）1、第1步改為2人/組，每組加入質(zhì)粒DNA 10l ，用微量移液器吹打混勻，加蓋，稍微離心，37水浴反應(yīng)1h。2、第2步改為稱取0.48g瓊脂糖倒入三角瓶中，加入1×TAE緩沖液60ml ，置微波爐加熱至完全熔化，取出搖勻 。3、第6步DNA存在處應(yīng)顯出桔紅色熒光條帶改為DNA存在處應(yīng)顯出綠色的熒光條帶 。

5、4、取消第7步。四、注意事項(xiàng)1、本實(shí)驗(yàn)可先進(jìn)行酶切反應(yīng)，酶切過(guò)程等時(shí)間的間隙灌好瓊脂糖凝膠。2、進(jìn)行DNA酶切時(shí)，要在其最適溫度下(大多數(shù)為37)進(jìn)行。最好是用每一種酶的專用緩沖液，以達(dá)到最佳酶切效率。如遇2種酶酶切應(yīng)先用低鹽緩沖液后用高鹽緩沖液，或一種酶切結(jié)束后加TE至400l，再進(jìn)行酚/氯仿抽提、乙醇沉淀，重新建立第二個(gè)酶切反應(yīng)體系。3、RE一定要在低溫(20)下貯存，因含50%甘油，在此溫度下一般不會(huì)結(jié)冰，如結(jié)冰則表明冰箱溫度低于20，應(yīng)避免結(jié)冰。新購(gòu)的大包裝酶，應(yīng)先分裝。每次吸取后均應(yīng)將RE管放在冰盒內(nèi)，用完后立即放在20，每次取酶盡可能使用新的滅菌tip，避免污染。4、進(jìn)行大量酶切時(shí)

6、，先要確定RE的濃度。一般1U RE于37條件下作用底物DNA 1h以上可切割1g DNA。一般來(lái)說(shuō)，要用23倍才能保證完全消化，對(duì)基因組DNA尤其如此。5、酶切基因組DNA是否完全可通過(guò)紫外觀察結(jié)果來(lái)判斷，如看到DNA片段呈均一遞減的一條區(qū)帶，則表示酶切完全。6、對(duì)多個(gè)樣品基因組DNA分別酶切電泳攝影，繪制出多個(gè)樣品的DNA限制性內(nèi)切酶圖譜，即可分析作出基因診斷。10min簡(jiǎn)圖示意圖圖片5min (錄像)5min實(shí)驗(yàn)+示教140min 小 結(jié)限制性核酸內(nèi)切酶能特異地識(shí)別雙鏈DNA中的堿基序列，通過(guò)“切割”雙鏈DNA中每一條鏈上的磷酸二酯鍵使DNA斷裂。利用它可方便地按需要對(duì)DNA進(jìn)行“剪切”

7、加工。限制性核酸內(nèi)切酶單位的定義為：在限定的溫度和反應(yīng)環(huán)境中，1小時(shí)消化1g DNA所需的酶量為一個(gè)酶單位。由于種種原因，在實(shí)際使用時(shí)需適當(dāng)增加增加酶量?，F(xiàn)在一般用35單位的酶消化1g NDA；反應(yīng)時(shí)間亦可延長(zhǎng)到3小時(shí)以上乃至過(guò)夜；從而使得酶切反應(yīng)更為完全。內(nèi)切酶一般均保存在50%的甘油緩沖液中，但進(jìn)行酶切反應(yīng)時(shí)，過(guò)高的甘油濃度會(huì)抑制酶活性。在反應(yīng)體系中甘油的終末濃度不能高于5%，故酶儲(chǔ)存液至少需稀釋10倍。通常各種核酸內(nèi)切酶反應(yīng)都需要Mg2+和一定的鹽濃度及適宜的pH，這就需要提供特定的緩沖液。為方便操作，一般習(xí)慣于配制10倍濃度的貯存緩沖液，在臨用時(shí)按110比例稀釋即可?，F(xiàn)在各廠家均配售各種與酶相應(yīng)的緩沖液，如配套使用，效果更佳。本實(shí)驗(yàn)中所用的Bcl-2重組質(zhì)?？傞L(zhǎng)為4