王鏡巖生物化學(xué)第7章蛋白質(zhì)的分離純化和表征

1、 蛋白質(zhì)含有酸蛋白質(zhì)含有酸/ /堿堿aaaa殘基具有兩性殘基具有兩性 堿堿/ /酸越大酸越大pi pi 越大越大 pi通常在通常在 6.0 左右左右一、蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn) 蛋白質(zhì)的分子量蛋白質(zhì)的分子量 一般在一萬(wàn)至一百萬(wàn)道爾頓之間一般在一萬(wàn)至一百萬(wàn)道爾頓之間 1道爾頓道爾頓1c12絕對(duì)質(zhì)量絕對(duì)質(zhì)量/12 1.6610-27千克千克二、蛋白質(zhì)分子的大?。ㄒ唬└鶕?jù)化學(xué)組成測(cè)定最小分子量（一）根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最小分子量1 1、測(cè)定蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量、測(cè)定蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量2 2、假設(shè)蛋白質(zhì)中僅含一個(gè)鐵原子、假設(shè)蛋白質(zhì)中僅含一個(gè)鐵原子最低相對(duì)分子質(zhì)量最低相對(duì)分子質(zhì)量= 100*

2、55.8/鐵的百分含量鐵的百分含量（二）（二）sdspagepage測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)顆粒電泳時(shí)遷移率取決于：蛋白質(zhì)顆粒電泳時(shí)遷移率取決于：w所帶電荷所帶電荷w分子量分子量w分子形狀分子形狀十二烷基磺酸鈉十二烷基磺酸鈉原態(tài)蛋白質(zhì)變性？磺酸基磺酸基 極性親水極性親水烷基烷基 親油親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）遷移率與電荷和形狀無(wú)關(guān)，僅取決于遷移率與電荷和形狀無(wú)關(guān)，僅取決于相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量巰基乙醇破壞二硫鍵（三）凝膠過(guò)濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量（三）凝膠過(guò)濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)混合樣蛋白質(zhì)混合樣w凝凝膠法只適于球狀蛋白分子測(cè)量凝凝膠法只適于球狀蛋白分子測(cè)量三、蛋白質(zhì)

3、的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀（一）膠體性質(zhì)（一）膠體性質(zhì)（colloidal system）膠體溶液的特點(diǎn)：膠體溶液的特點(diǎn)：w分子直徑在分子直徑在1-100 nm1-100 nm內(nèi)內(nèi)w溶于水溶于水w不易聚集沉淀不易聚集沉淀大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：1.1.同種蛋白帶同種電荷，相互排斥同種蛋白帶同種電荷，相互排斥2.2.水膜彈性水膜彈性w蛋白質(zhì)溶液具有丁達(dá)爾效應(yīng)、布朗蛋白質(zhì)溶液具有丁達(dá)爾效應(yīng)、布朗運(yùn)動(dòng)以及不能通過(guò)半透膜等性質(zhì)運(yùn)動(dòng)以及不能通過(guò)半透膜等性質(zhì)（二）蛋白質(zhì)的（二）蛋白質(zhì)的沉淀沉淀 pr從膠體

4、溶液中析出從膠體溶液中析出 可逆沉淀：可逆沉淀：溫和條件，改變?nèi)芤簻睾蜅l件，改變?nèi)芤簆h或或pr所所帶電荷帶電荷pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒(méi)有變化結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒(méi)有變化適當(dāng)條件下可重新溶解適當(dāng)條件下可重新溶解 非變性沉淀非變性沉淀 pi沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等 不可逆沉淀不可逆沉淀 強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件 破壞破壞pr膠體溶液穩(wěn)定性膠體溶液穩(wěn)定性 也破壞也破壞pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 沉淀不能再重新溶解沉淀不能再重新溶解變性沉淀變性沉淀 如加熱沉淀、強(qiáng)酸如加熱沉淀、強(qiáng)酸/ /堿沉淀、重金屬鹽堿沉淀、重金屬鹽 和生物堿沉淀等和生物堿沉淀等1.1.鹽析法鹽析法加入中性鹽脫

5、去蛋白質(zhì)的水化層，加入中性鹽脫去蛋白質(zhì)的水化層，鹽析一般不引起變性鹽析一般不引起變性 等電點(diǎn)沉淀的蛋白質(zhì)溶液中加入nacl后沉淀溶解鹽溶 原因？鹽溶鹽析分子在等電點(diǎn)時(shí)，相互吸引，聚合沉淀，分子在等電點(diǎn)時(shí)，相互吸引，聚合沉淀，加入少加入少量鹽離子量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中于水中鹽溶鹽析 向蛋白質(zhì)溶液中加入大量硫酸銨后蛋白質(zhì)會(huì)沉淀析出 原因？蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀鹽析（nh4）2so4）2.2.有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑沉淀脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用3.3.等電點(diǎn)沉淀

6、等電點(diǎn)沉淀4.4.重金屬鹽沉淀重金屬鹽沉淀 與帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)結(jié)成不溶性鹽與帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)結(jié)成不溶性鹽5.5.生物堿試劑和某些酸類(lèi)沉淀生物堿試劑和某些酸類(lèi)沉淀 與帶正電荷蛋白質(zhì)生成不溶性鹽與帶正電荷蛋白質(zhì)生成不溶性鹽6.6.加熱變性沉淀加熱變性沉淀 天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露， 破壞水化層及帶電狀態(tài)破壞水化層及帶電狀態(tài)四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則總目標(biāo)：增加制品純度或比活總目標(biāo)：增加制品純度或比活1.1.前處理：因動(dòng)前處理：因動(dòng)/ /植物植物/ /細(xì)菌而異細(xì)菌而異2.2.粗分級(jí)分離：采用鹽析粗分級(jí)分離：采用鹽析/ /等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀/ /有有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法機(jī)溶劑

7、分級(jí)分離等方法3.3.細(xì)分級(jí)分離：采用凝膠過(guò)濾、離子交換細(xì)分級(jí)分離：采用凝膠過(guò)濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等層析、吸附層析以及親和層析等4.4.結(jié)晶結(jié)晶五、蛋白質(zhì)的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法根據(jù)分子大小不同的純化方法 1、透析和超過(guò)濾、透析和超過(guò)濾w利用蛋白質(zhì)分子不能透過(guò)半透膜將其利用蛋白質(zhì)分子不能透過(guò)半透膜將其 與小分子物質(zhì)分開(kāi)與小分子物質(zhì)分開(kāi)w半透膜為玻璃紙或纖維素材料半透膜為玻璃紙或纖維素材料血液透析血液透析小分子溶出小分子被帶出小分子被帶出透析機(jī)透析機(jī)透析液透析液加加壓壓血液血液2 2、密度梯度（區(qū)帶）離心、密度梯度（區(qū)帶）離心6000080000轉(zhuǎn)/分重力

8、60萬(wàn)80萬(wàn)倍3、凝膠過(guò)濾、凝膠過(guò)濾（二）利用溶解度差別的純化方法（二）利用溶解度差別的純化方法 1. 1.等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀 調(diào)整溶液調(diào)整溶液ph 不同蛋白在各自不同蛋白在各自 pi處依次沉淀處依次沉淀 2.2.鹽溶和鹽析鹽溶和鹽析3.3.有機(jī)溶劑分級(jí)分離法有機(jī)溶劑分級(jí)分離法w降低介電常數(shù)降低介電常數(shù)w爭(zhēng)奪水化膜爭(zhēng)奪水化膜（三（三) )根據(jù)電荷不同的分離方法根據(jù)電荷不同的分離方法電泳電泳原理：原理： 蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)時(shí)所帶總電荷不為蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)時(shí)所帶總電荷不為0 0 分子大小不同，電場(chǎng)中移動(dòng)速度也不同分子大小不同，電場(chǎng)中移動(dòng)速度也不同等電聚焦電泳等電聚焦電泳雙向電泳雙向電泳離子交換層析離子交換層析（四）利用蛋白質(zhì)選擇性吸附的性質(zhì)（四）利用