復(fù)方首烏降脂通脈顆粒防治大鼠高脂血癥和脂肪肝的實(shí)驗(yàn)研究

1、復(fù)方首烏降脂通脈顆粒防治大鼠高脂血癥和脂肪肝的實(shí)驗(yàn)研究 【摘要】 目的：研究復(fù)方首烏降脂通脈顆粒對(duì)大鼠高脂血癥和脂肪肝的防治作用。方法：大鼠在小劑量四氯化碳致肝損傷的基礎(chǔ)上，合并喂養(yǎng)高脂飼料復(fù)制大鼠脂肪肝模型。防治給藥組分別給予不同濃度的藥物，以血清總膽固醇(TC)、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶（SOD）含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，觀察藥物的防治效果。結(jié)果：與大鼠脂肪肝模型組相比，復(fù)方首烏降脂通脈顆粒可以顯著降低大鼠血清TC、TG、LDL、MDA、ALT和AST含量，升高SOD活性。

2、肝臟組織及病理形態(tài)學(xué)改變均有明顯的改善。結(jié)論：復(fù)方首烏降脂通脈顆粒能明顯降低高脂血癥大鼠的血脂水平，減輕脂肪肝形成的程度，對(duì)復(fù)合因素引起的脂肪肝有較好的防治作用。 【關(guān)鍵詞】 高脂血癥 脂肪肝 大鼠 高脂血癥是目前公認(rèn)的導(dǎo)致脂肪肝的主要病因之一 12，同時(shí)也是動(dòng)脈粥樣硬化(As)、冠心病等相關(guān)疾病的病理基礎(chǔ)，降低血脂是預(yù)防和控制相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的基本手段之一。目前臨床上使用的多數(shù)降血脂藥物是促進(jìn)血液中脂質(zhì)運(yùn)輸至肝臟進(jìn)行代謝排泄，降血脂藥若長(zhǎng)期服用，則會(huì)伴有肝功能低下和肝脂質(zhì)代謝障礙，易導(dǎo)致肝臟病變與脂肪沉積加劇。因此，研究具有降血脂功能，同時(shí)不妨礙肝臟正常功能的理想藥物具有重要實(shí)用價(jià)值。和化學(xué)

3、藥物相比，在我國(guó)很多中藥具有資源廣泛、毒副作用小、調(diào)脂療效肯定等優(yōu)點(diǎn)，有很好的開發(fā)前景。降脂通脈膠囊是以首烏和茵陳為主藥的一種新的中藥復(fù)方制劑。我們的實(shí)驗(yàn)初步研究了復(fù)方首烏降脂通脈顆粒對(duì)大鼠高脂血癥和脂肪肝的防治作用，發(fā)現(xiàn)其具有較顯著的降血脂、保護(hù)肝臟和減輕脂肪肝形成的作用，為更廣泛的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 1 材 料 11 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，體重180 200 g，健康成年雄性，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為 SCXK(蘇)20020031。飼養(yǎng)條件為空調(diào)房間，溫度18 24 ，相對(duì)濕度70%，12 h光照。 12 藥品與試劑 復(fù)方首烏降脂通脈顆粒由江蘇省藥物研究所植物

4、化學(xué)研究室提供，10 g提取物/50 g生藥，批號(hào)030517；洛伐他汀由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)H37020089；膽固醇(生化試劑)由上海源聚生物科技有限公司提供，批號(hào)0400522；牛膽鹽(生化試劑)由上海中國(guó)惠興生化試劑有限公司提供，批號(hào)20040313；甲基硫氧嘧啶由常州康普藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)0206221。 血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）采用酶法測(cè)定，血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）參照試劑盒說(shuō)明書，均采用美國(guó)ACE全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)其含量。上

5、述指標(biāo)測(cè)定由南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京第一醫(yī)院生化檢驗(yàn)科完成。 高脂飼料由79.3%基礎(chǔ)飼料、1%膽固醇、0.5%膽鹽、0.2%甲基硫氧嘧啶、10%豬油、5%黃豆、1%雞蛋和魚粉、2%蛋黃粉組成，由南京安立默科技有限公司提供。 2 方 法 21 動(dòng)物分組與用藥 SD大鼠60只，在實(shí)驗(yàn)條件下喂飼基礎(chǔ)飼料7 d，然后取尾血分別測(cè)定血清TC、TG，觀察指標(biāo)的正常值。根據(jù)血脂水平將大鼠分成正常對(duì)照組、脂肪肝模型對(duì)照組、防治給藥各劑量組（復(fù)方首烏降脂通脈顆粒，3.0、2.0、1.0 gkg-1）和陽(yáng)性對(duì)照組(洛伐他汀5.0 mgkg-1)6組，每組10只。參照Chojkier等方法復(fù)制脂肪肝動(dòng)物模型，除正常對(duì)

6、照組大鼠給予基礎(chǔ)飼料外，實(shí)驗(yàn)第1天給各實(shí)驗(yàn)組大鼠后肢一次性皮下注射四氯化碳植物油混合液（60%植物油和40%四氯化碳）3 mlkg-1,同時(shí)用高脂飼料喂養(yǎng)造模，并從實(shí)驗(yàn)第1天開始，各防治給藥組、陽(yáng)性對(duì)照組分別給予相應(yīng)劑量(10 m1kg-1d-1)的對(duì)應(yīng)藥物灌胃，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組以等量的0.5%CMCNa溶液灌胃，1次d-1，連續(xù)6周。于每次灌胃前后觀察大鼠皮毛、活動(dòng)和食量等情況，每周稱重1次，6周后全部動(dòng)物麻醉下頸動(dòng)脈取血，處死后取肝臟檢測(cè)。 22 檢測(cè)指標(biāo) 221 體重、肝指數(shù)（肝濕重/體重100%） 實(shí)驗(yàn)期間每日稱取剩余飼料量，比較各組大鼠平均進(jìn)食量、活動(dòng)和毛發(fā)等情況。每周測(cè)量大鼠

7、體重1次，比較各組大鼠體重變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱取肝重、體重，計(jì)算肝指數(shù)。 222 血脂、血清SOD、MDA、ALT和AST 所有大鼠在實(shí)驗(yàn)第48天停喂高脂飼料，禁食12 h，于實(shí)驗(yàn)第49天經(jīng)0.6%戊巴比妥鈉35 40 mgkg-1腹腔注射麻醉后頸動(dòng)脈取血，無(wú)菌狀態(tài)分離血清，測(cè)定生化指標(biāo)血清TC、TG、LDA、HDL、SOD、MDA、ALT和AST。觀察各給藥組的血脂指標(biāo)、SOD、MDA、ALT和AST，并與正常對(duì)照組、模型對(duì)照組比較。 223 肝組織標(biāo)本處理 采血后迅速剖取肝臟，在固定位置取組織塊置于10%福爾馬林中固定，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)、肝小葉結(jié)構(gòu)

8、、脂肪變程度、肝細(xì)胞變性和壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及纖維增生等情況。 23 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用Microsoft Exel統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)各組結(jié)果進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)以x-s表示，與正常對(duì)照組、模型對(duì)照組比較采用兩組間均數(shù)t檢驗(yàn)，P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3 結(jié) 果 31 大鼠體重及肝指數(shù)的測(cè)定 各實(shí)驗(yàn)組大鼠體重與正常對(duì)照組大鼠體重?zé)o明顯差異，模型對(duì)照組大鼠在喂養(yǎng)2周后食欲有所下降，體重增長(zhǎng)不明顯，至6周時(shí)，模型組大鼠體重略低于正常組，但各組間無(wú)顯著性差異。模型組肝指數(shù)明顯升高，與正常對(duì)照組比較有顯著性差異（P0.01）。見表1。 32 大鼠血脂測(cè)定結(jié)果 模型對(duì)照組大鼠血清TC、TG、LDL含量均顯著

9、高于正常對(duì)照組（P0.001）；與模型對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清TC、TG、LDL含量均有不同程度降低，且差異顯著（P0.05或P0.01），防治給藥小劑量組大鼠血清TC、TG含量有降低，但差異不顯著。其中防治給藥大劑量組降低幅度最大，但與陽(yáng)性對(duì)照組相比，差異不顯著（P0.05）。各實(shí)驗(yàn)組對(duì)HDL無(wú)影響。見表2。表1 復(fù)方首烏降脂通脈顆粒對(duì)大鼠體重及肝指數(shù)的影響 1）與正常對(duì)照組比較，P0.01表2 復(fù)方首烏降脂通脈顆粒對(duì)大鼠血清TC、TG、HDL和LDL的影響 3.3 大鼠血清ALT、AST變化情況 模型對(duì)照組大鼠血清ALT、AST顯著高于正常對(duì)照組（P0.01），防治給藥中劑量、大劑量組

10、與模型對(duì)照組比較，大鼠血清ALT、AST均有顯著降低（P0.05或P0.01）。防治給藥小劑量組與模型對(duì)照組比較，大鼠血清ALT、AST沒(méi)有顯著降低（P0.05），陽(yáng)性對(duì)照組與模型對(duì)照組比較，大鼠血清ALT、AST沒(méi)有顯著降低（P0.05）。見表3。表3 復(fù)方首烏降脂通脈顆粒對(duì)大鼠血清ALT和 AST的影響3.4 大鼠血清SOD和MDA變化情況 模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，大鼠血清MDA顯著升高（P0.01），SOD顯著降低（P0.01），防治給藥各劑量組與模型對(duì)照組比較，大鼠血清MDA均有降低，且差異顯著（P0.01），以防治給藥大劑量組降低幅度最大。防治給藥各劑量組與模型對(duì)照組比較，大鼠血

11、清SOD均升高，且差異顯著（P0.01或P0.05）。見表4。表4 復(fù)方首烏降脂通脈顆粒對(duì)大鼠血清SOD和MDA的影響3.5 大鼠肝臟形態(tài)學(xué)的改變 肉眼觀察正常對(duì)照組大鼠肝臟無(wú)異常變化。模型對(duì)照組大鼠肝臟體積明顯增大，包膜緊張，部分肝臟呈奶黃色，切面油膩。與正常對(duì)照組比，防治給藥各劑量組大鼠肝臟顏色紅潤(rùn)，被膜光滑，質(zhì)地接近正常肝組織。 光鏡下，正常對(duì)照組大鼠肝臟基本無(wú)異常情況。與模型對(duì)照組大鼠比，防治給藥各劑量組大鼠肝細(xì)胞的脂肪變性、炎癥反應(yīng)都有所減輕，肝細(xì)胞核周圍脂肪空泡明顯減少，匯管區(qū)、肝小葉內(nèi)有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，未見點(diǎn)狀壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞索排列較整齊，但未能恢復(fù)至正常對(duì)照組水平。

12、詳見圖1。 4 討 論 脂肪肝是由于多種因素導(dǎo)致脂肪過(guò)量，以肝細(xì)胞脂肪變性為主的臨床病理綜合征。中醫(yī)根據(jù)其發(fā)病特點(diǎn)及臨床表現(xiàn)大多歸屬于“積證”、“瘀證”、“痰濁”和“脅痛”等病證范圍。其理論認(rèn)為本病的發(fā)病機(jī)制與肝脾腎功能失調(diào)密切相關(guān)，痰濕、痰熱、痰瘀內(nèi)生，氣滯瘀積，阻塞脈道，清陽(yáng)不升，濁陰不降是其主要病理基礎(chǔ)。 根據(jù)本草綱目等資料記載，首烏味苦、甘、澀，性溫，歸肝、腎二經(jīng)，其具有“養(yǎng)血益肝，固精益腎”等作用。藥理研究表明，首烏富含卵磷脂、蒽醌類化合物，其主要藥理作用有：（1）蒽醌類可以促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，減少膽固醇的吸收；（2）卵磷脂參與肝臟HDL的合成，促進(jìn)TG和膽固醇的代謝；首烏中的四羥基乙烯D

13、葡萄糖甙是保肝的有效成分，它能防止脂肪肝、肝功能損害和肝臟過(guò)氧化脂質(zhì)含量升高，降低血清ALT和AST。此外，首烏增加肝糖原的作用也有利于對(duì)肝臟的保護(hù)。茵陳性味苦、辛，微寒，歸肝、膽、脾、胃經(jīng)，有清熱利濕、利膽退黃、護(hù)肝祛脂等功效?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，茵陳有明顯的降酶護(hù)肝作用。茵陳含有豐富的鋅、錳等機(jī)體所必需的微量元素，這些微量元素參與酸的組成，調(diào)節(jié)酶的活性，直接參與機(jī)體的核酸、糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝，因而有促進(jìn)肝細(xì)胞再生，保護(hù)肝細(xì)胞膜的完整性和明顯的保肝降酶作用10。 復(fù)方首烏降脂通脈顆粒是以上述兩味中藥為主藥的復(fù)方制劑，對(duì)高脂血癥合并脂肪肝具有良好的防治作用。 本實(shí)驗(yàn)以在小劑量四氯化碳致

14、肝損傷的基礎(chǔ)上，合并喂食高脂飼料的方法復(fù)制高脂血癥大鼠脂肪肝動(dòng)物模型。四氯化碳在肝臟中通過(guò)過(guò)氧化作用，阻斷載脂蛋白的合成，使脂肪在肝內(nèi)沉積，同時(shí)用含高脂肪的飼料喂養(yǎng)動(dòng)物，提供部分外源性脂肪，以加快、加重脂肪肝的形成11。此種造模過(guò)程周期短且模型穩(wěn)定，其特點(diǎn)為：（1）體重、肝指數(shù)明顯增加；（2）血脂水平、肝功能轉(zhuǎn)氨酶明顯升高；（3） 肝組織學(xué)呈大泡性脂肪變，伴有小葉和匯管區(qū)炎癥，甚至碎屑樣壞死。以上特點(diǎn)適合本課題的研究。復(fù)方首烏降脂通脈顆?？梢种茖?shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠體重的增加，并可顯著降低實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠血清TC、TG和LDL含量且呈一定量效關(guān)系，大劑量復(fù)方首烏降脂通脈顆粒與洛伐他汀的調(diào)脂療效相

15、當(dāng)。高脂血癥所致脂肪肝為非酒精性脂肪肝，因脂肪代謝紊亂，過(guò)量的脂肪在肝內(nèi)持久積聚，導(dǎo)致肝臟脂肪變性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)復(fù)方首烏降脂通脈顆?？山档透沃笖?shù)、血脂含量和轉(zhuǎn)氨酶，減輕病理改變等，說(shuō)明其具有顯著抑制高脂血癥引起的實(shí)驗(yàn)大鼠脂肪肝形成的作用。 現(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，脂肪肝的形成及其后續(xù)發(fā)展的整個(gè)過(guò)程與脂質(zhì)過(guò)氧化損傷有著密切的關(guān)系12。正常情況下，TG在外周脂肪組織和肝臟之間不斷循環(huán)，保持平衡。由于高脂血癥是脂質(zhì)和脂蛋白代謝紊亂的后果，代謝平衡失調(diào)，機(jī)體產(chǎn)生過(guò)多的氧自由基(oxygen free radical，OFR)4，脂肪酸，尤其是不飽和脂肪酸在OFR的作用下發(fā)生自我氧化反應(yīng)，并產(chǎn)生大量的自由基

16、，這就是所謂的脂質(zhì)過(guò)氧化。脂質(zhì)過(guò)氧化的主要作用是降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而改變細(xì)胞膜的特性和明顯破壞膜結(jié)合蛋白。脂質(zhì)過(guò)氧化在細(xì)胞膜的發(fā)生，破壞了細(xì)胞膜對(duì)脂肪的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，為大量脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)的堆積提供了條件13。SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化劑，可消除過(guò)剩的OFR及其衍生物，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。脂質(zhì)過(guò)氧化物(例如MDA)為過(guò)氧化物脂質(zhì)的降解產(chǎn)物，其高低間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基供給的嚴(yán)重程度。 本實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果亦表明，高脂血癥模型對(duì)照組大鼠的血清MDA顯著高于對(duì)照組，SOD顯著低于對(duì)照組，其原因可能是脂質(zhì)、磷脂、游離脂肪酸和膽固醇轉(zhuǎn)化利用發(fā)生障礙，已發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。 同時(shí)觀察到，與模型對(duì)照組比較，防治給

17、藥各劑量組SOD含量均升高,MDA的含量明顯降低，提示復(fù)方首烏降脂通脈顆粒能夠降低體內(nèi)自由基活性，加強(qiáng)抗氧化酶活性，減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)終產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，從而具有一定的調(diào)節(jié)和改善自由基代謝平衡、抗氧化和保護(hù)肝細(xì)胞的作用。 四氯化碳致肝損傷模型是篩選具有保肝降酶作用藥物的常用模型之一14l，并以血清轉(zhuǎn)氨酶為觀察指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)被篩選藥物的保肝降酶效果。四氯化碳在肝微粒體內(nèi)經(jīng)還原活化而產(chǎn)生自由基，通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化物的破壞，肝細(xì)胞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能受到損害，使細(xì)胞內(nèi)ALT、AST溢出至血液導(dǎo)致ALT、AST等活性升高，轉(zhuǎn)氨酶活性的高低與肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞受損的程度一致，也是肝細(xì)胞損傷的敏感指標(biāo)15。通過(guò)測(cè)量血液中AL

18、T、AST活性可反映肝細(xì)胞損害的程度及肝細(xì)胞的修復(fù)情況。在我們的實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組大鼠ALT、AST明顯升高，表明模型對(duì)照組大鼠肝功能嚴(yán)重受損。復(fù)方首烏降脂通脈顆粒能降低大鼠血清ALT、AST含量，提示具有抗肝細(xì)胞損傷，排毒保肝作用。作用原理可能是通過(guò)減輕對(duì)肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的破壞，達(dá)到緩解肝細(xì)胞變性壞死的作用。另外，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠亦可見ALT、AST有不同程度的升高，據(jù)報(bào)道，他汀類藥物的動(dòng)物試驗(yàn)及臨床研究均有肝臟酶輕微的升高，他汀類藥物最重要的副作用是肝臟和肌肉毒性，且與劑量相關(guān)，在臨床應(yīng)用時(shí)要求監(jiān)測(cè)肝功能16。這也提示本方對(duì)防治高脂血癥脂肪肝具有有效、低毒的優(yōu)勢(shì)。 在我們實(shí)驗(yàn)中觀察到

19、的復(fù)方首烏降脂通脈顆粒能夠降低大鼠血清中的脂質(zhì)含量，并且減輕肝臟中脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，降低血清轉(zhuǎn)氨酶含量，明顯改善組織病理形態(tài)學(xué)，說(shuō)明復(fù)方首烏降脂通脈顆粒具有多種機(jī)制，可以發(fā)揮其多靶點(diǎn)、多成分協(xié)同作用的特點(diǎn)，其主要機(jī)制可能是通過(guò)保護(hù)肝細(xì)胞,增強(qiáng)肝臟對(duì)脂質(zhì)的清除能力而達(dá)到作用，對(duì)防治高脂血癥脂肪肝顯示出了較好的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步深入研究。【參考文獻(xiàn)】 1陳灝珠實(shí)用內(nèi)科學(xué)M11版北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：9911866廖華，杜曉鋒高脂血癥與脂肪肝的相關(guān)性研究J中國(guó)誤診學(xué)雜志，2002，2(9)：1363.COMAR K M，STERLING R K.Review article：drug th

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