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1、第24卷第1期河北工程大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)Vol124No112007年3月JournalofHebeiUniversityofEngineering(NaturalScienceEdition)Mar12007文章編號:1673-9469(2007)01-0070-04培養(yǎng)條件對冬蟲夏草菌絲重量和多糖的影響劉彥威1,劉娜1,蘇敬良2,韓博2,田向榮2(1.河北工程大學(xué)農(nóng)學(xué)院,河北邯鄲056021;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京100094)摘要:為檢測天然冬蟲夏草和人工培養(yǎng)菌絲體的多糖含量,以及振蕩培養(yǎng)和氮源對菌絲重量、多糖的影響,用硫酸苯酚法測定天然冬蟲夏草和菌絲體中多糖含量,菌絲干燥

2、后直接稱重,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌絲體中多糖的含量高于天然冬蟲夏草,但差異不明顯,振蕩培養(yǎng)在一定時間內(nèi)使菌絲重量增加,卻使菌絲多糖減少,不同氮源對菌絲重量和多糖均產(chǎn)生影響,較適宜的氮源為硝酸銨。因此,為保證多糖的含量,應(yīng)控制振蕩培養(yǎng)的時間,選擇合適的氮源。關(guān)鍵詞:冬蟲夏草;菌絲體重量;多糖;振蕩培養(yǎng);氮源中圖分類號:Q949.95文獻(xiàn)標(biāo)識碼EffectofofCordycepssinensisLIUYan2wei1,LIUNa1,SUJing2liang2,HANBo2,TIANXiang2rong2(1.AgriculturalCollege,HebeiEngineeringUniversity,Han

3、dan056038China;2.AnimalMedicineCollege,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China)Abstract:TomeasurepolysaccharidescontentinnaturalCordycepssinensisandmycelium,andtostudyeffectofflasecultureandnitrogensourceonpolysaccharidescontentandmyceliumweightinculturemycelium,Thephenol2sulphuricacidmethod

4、wasusedinthepolysaccharidescontent.ThecontentofpolysaccharidesinmyceliumwashigherthanthatinnaturalCordycepssinensis(p0.05).Thecontentofpolysaccharideswasinhibitedasresultofdecreaseofmyceliumlevelbyflasksculture,butmyceliumweightwasincreasdduring0-16daysofswing.Thecontentexaminationofregulatoryaspect

5、sonpolysaccharidesandmyceliumweightbydifferentnitrogenshowedthatNH4NO3wasappropriatesource.Therewaseffectonpolysaccharidescontentandmyceliumweightbyflasecultureandsourceofnitrogen.Keywords:Cordycepsinensis;myceliumweight;polysaccharides;flaseculture;nitrogensource多糖是冬蟲夏草中主要的生理活性物質(zhì)之一,具有多方面的藥理作用。它可調(diào)節(jié)免

6、疫功能1,2,降低血糖,抗腫瘤3-5,對肝有保護(hù)作用6。另有報道冬蟲夏草多糖有抗疲勞、抗壓力、7降低血液膽固醇的功效。最近有人用HPIC對天然和人工冬蟲夏草多糖組分進(jìn)行了分析,結(jié)果表明天然冬蟲夏草多糖各組分構(gòu)成比相似,人工冬蟲夏草多糖各組分構(gòu)成則差異明顯,多糖的組分和含量與藥理作用密切相關(guān),因此,目前已把多糖作為冬蟲夏草質(zhì)量指標(biāo)之一8。鑒于多糖重要作用,本實(shí)驗(yàn)對天然和人工培養(yǎng)冬蟲夏草的多糖進(jìn)行比較,并測定不同培養(yǎng)條件和不同氮源對多糖的影響。1材料和方法1.1主要儀器和試劑電熱恒溫水槽,分光光度計(UV755B),電子分析天平(德國產(chǎn)),葡聚糖(Japan分裝),硫酸,苯酚。上述藥品均為分析純。

7、收稿日期:2006-12-15作者簡介:劉彥威(1963-),男,河北辛集市人,博士,教授,從事動物病理學(xué)和藥用真菌分子生物學(xué)研究。第1期劉彥威等:培養(yǎng)條件對冬蟲夏草菌絲重量和多糖的影響711.2菌絲水提液制備天然冬蟲夏草和人工培養(yǎng)的菌絲體放在45恒溫干燥過夜,研磨碎,準(zhǔn)確稱量,放入燒杯中,調(diào)節(jié)pH值達(dá)7.58.0,加蒸餾水85恒溫水浴24h,離心4000r/min,10min,取上清液,無損耗放入容量瓶,離心洗滌2次,最后定容,即為菌絲水提液。直接測其多糖的含量。1.3多糖的測定(硫酸-苯酚法)4制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程:y=0.0084x+0.0105,=0.9968,結(jié)果在20140g/ml

8、范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,且重復(fù)性較好(見圖2)。分別吸取葡聚糖(0.1mg/ml)溶液0.25、0.50、0.75、1.0、1.25、1.50、1.75ml,各以雙蒸水補(bǔ)至2.0ml,然后加入80%苯酚100l及濃硫酸5.0ml,靜置10min,搖勻,室溫放置20min,于分光光度計上測定光密度值,每管作三個重復(fù)取平均值,以2.0ml雙蒸水同樣操作為空白對照標(biāo),1.4振蕩培養(yǎng):將液體培養(yǎng)的菌絲劇烈振蕩、混勻,制成菌絲懸液,按5%的比例接入有200ml的液體加富培養(yǎng)基(葡萄糖50g、蛋白胨10g、酵母1g、MgSO40.5g、K2HPO41g、CaCl20.5g加水至1000ml)。溫度為18,

9、轉(zhuǎn)速為70-90轉(zhuǎn)/min,培養(yǎng)20d。不同氮源培養(yǎng):在無蛋白胨加富培養(yǎng)基(無氮)基礎(chǔ)上分別加1%氯化銨、亞硝酸鈉、硝酸銨、尿素、蛋白胨等不同的氮源,接種5%菌絲懸液,18,靜置培養(yǎng)160d。無論是振蕩培養(yǎng)的菌絲體,還是氮源培養(yǎng)的菌絲體,4000r/min,10min,用蒸餾水沖洗2次,將菌絲放入恒溫箱45干燥,稱重。2.3冬蟲夏草和菌絲體多糖的含量從表1可看出,在天然冬蟲夏草不同的部分其多糖的含量不同,子實(shí)體多糖含量略高于僵蟲,但沒有顯著差異(P0.01),菌絲體的多糖含量高于天然冬蟲夏草,差異也不顯著(P0.01)。表1菌絲、子實(shí)體和僵蟲多糖含量Tab.1Polysaccharidecon

10、tentofmycelium,muscardincadaverandfruitingbody2結(jié)果2.1供試液吸收曲線組別菌絲僵蟲子實(shí)體OD值0.9430.0340.7840.0790.8040.068含量(%)培養(yǎng)時間(d)5.554.6044.72330-取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測樣品均按多糖測定的方法處理,用紫外可見光度計(Thermospectro2mio)在400600nm范圍進(jìn)行掃描,以波長為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制吸收曲線,從圖1可以讀出約在490nm處為最大吸收峰,這與資料報道一致。2.2葡聚糖線性范圍2.4振蕩培養(yǎng)對菌絲多糖和菌絲重量的影響振蕩培養(yǎng)對菌絲多糖和菌絲重量的影響見

11、圖3。從圖3可明顯看出,隨著振蕩培養(yǎng)時間持續(xù),以光密度為縱坐標(biāo),葡聚糖濃度為橫坐標(biāo),繪菌絲重量逐漸增加,到16d達(dá)高峰,繼續(xù)振蕩培養(yǎng)反而使菌絲量減少。同時也可看出隨振蕩培養(yǎng)的72河北工程大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)2007年持續(xù),菌絲多糖明顯減少,但不同的振蕩培養(yǎng)時間減少的幅度不同,在08d隨振蕩培養(yǎng)時間的延長,多糖直線下降,812d多糖下降進(jìn)入第一個穩(wěn)定期,1618d突然下降進(jìn)入第二個穩(wěn)定期。含有多糖,兩者相差無幾,人工發(fā)酵菌絲體也含有多糖,且比天然冬蟲夏草還高。若僅以多糖為質(zhì)控指標(biāo),人工冬蟲夏草可替代天然冬蟲夏草。然而冬蟲夏草含有多種有效成分,人工培養(yǎng)的菌絲能否完全替代天然冬蟲夏草還得比較其他有

12、效成分含量。不同的報道冬蟲夏草多糖含量不同,菌絲多糖含量的報道也不一樣,這可能與樣品的產(chǎn)地、處理、培養(yǎng)方式和測定方法等不同有關(guān)11,12。3.2振蕩培養(yǎng)抑制菌絲多糖產(chǎn)生本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)振蕩培養(yǎng)使菌絲多糖的含量明顯減少,盡管振蕩培養(yǎng)時間不同,菌絲多糖減少的程度不同,可使菌絲產(chǎn),2.5,一定控制振蕩培養(yǎng)時間。至于振蕩培養(yǎng)引起菌絲多糖含量減少的原因,目前還不清楚,也未見類似的報道。3.3氮源對菌絲多糖影響4。不同氮源對菌絲多糖的影響不同,與無氮組相比,蛋白胨、尿素、氯化銨不利于對菌絲多糖產(chǎn)生,使菌絲多糖含量減少,只有硝酸銨促進(jìn)菌絲多糖產(chǎn)生,使菌絲多糖含量增加。氮源對菌絲重量的影響與對菌絲多糖的影響基本是一

13、致的。氮源是冬蟲夏草菌絲非常重要的營養(yǎng)因素,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同的氮源對菌絲多糖的影響不同,因此,在培養(yǎng)基添加氮源時,一定選用合適的氮源。在諸多氮源中,硝酸銨較適合菌絲多糖的產(chǎn)生,與無氮培養(yǎng)基相比,其它氮源包括氯化銨、尿素和蛋白胨等均不利于菌絲多糖產(chǎn)生,這提示在培養(yǎng)基添加氮源時,一定選用適合菌絲多糖產(chǎn)生的氮源,以免影響菌絲多糖的含量。另外,本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)不同氮源對菌絲的產(chǎn)量亦有影響,在我們實(shí)驗(yàn)的氮源中,只有硝酸銨促進(jìn)菌絲產(chǎn)生,使菌絲重量增加,其它則抑制菌絲產(chǎn)生,使菌絲重量減少。綜合考慮,無論是對菌絲多糖,還是菌絲重量,較適宜的氮源為硝酸銨。至于氮源對菌絲多糖和菌絲重量影響的機(jī)制,目前還不清楚,也未見有

14、關(guān)的報道,因此弄清其相關(guān)機(jī)理還需進(jìn)一步的研究。3討論3.1冬蟲夏草和菌絲多糖含量4結(jié)論1)人工培養(yǎng)冬蟲夏草菌絲體中含有多糖,且冬蟲夏草有著廣泛的醫(yī)療作用,這與冬蟲夏草所含的有效成分密切相關(guān)。多糖作為冬蟲夏草主要有效成分之一,具有廣泛的醫(yī)療作用,并且其新的作用不斷被發(fā)現(xiàn),具有潛在的開發(fā)前景10。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),天然冬蟲夏草的子實(shí)體和僵蟲中均略高于天然冬蟲夏草多糖含量。2)振蕩培養(yǎng)可使菌絲量增加,但降低菌絲多糖的含量。3)氮源對菌絲量和多糖含量有影響,較適宜第1期劉彥威等:培養(yǎng)條件對冬蟲夏草菌絲重量和多糖的影響73的氮源為硝酸銨。參考文獻(xiàn):1藏其中,何光星,鄭振源,等.蟲草多糖的藥理作用J.中草藥,1

15、985,16(7):18-23.2邱德凱,靖大道,蕭樹東.冬蟲夏草多糖脂質(zhì)體對肝regionofpolygalactosaminecontainingfungalglycoproteinfromCordycepsophioglossoidesJ.Biochem.Biophys.Res.Commun.B,1986,140(1):350-356.6董彩虹.冬蟲夏草多糖的研究進(jìn)展J.食品科學(xué),2004,25(7):195-198.7許周善,周曉燕.冬蟲夏草多糖的研究進(jìn)展J.工業(yè)炎后肝硬化患者T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的研究J.中華消化雜志,1995,15(5):265-7.3ONMORIT,TAMURAK,

16、TAKACKH,etal.Componentanalysisofprotein2boundpolysaccharides(SN2C)fromcordy2cepsophioglossoidesanditseffectsonsyngeneicmurinetu2morJ.Che.Pharm.Bull,1988,36(11):4505-4511.4ONMORIT,TAMURAK,WAKAIKIA,etal.Dissociationofaglucanfraction(CO1)fromprotein2boundpolysaccharideofcordycepsophioglossoidesandanaly

17、sisofitsantitumoref2fectJ.Che.Pharm.Bull,1988,36(11):4512-5KAWAGUCHIN,ONMORITetal.OccurrenceofGal(the微生物,2000,30(1):5657.8朱荃,黃趙剛,夏泉,等.天然和人工冬蟲夏草多糖組分的HPLC分析J.藥物分析雜志,2003,23(1):34-36.9魯曉巖.硫酸-苯酚法測定北冬蟲夏草多糖的含量J.食品工業(yè)科技,2002;4:60-70.10劉彥威,劉娜,劉利強(qiáng).冬蟲夏草有效成分的研究進(jìn)展J.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2004,25(3):51-53.11,張旭東.2003,31(5):36-37

18、.,.正交設(shè)計優(yōu)化冬蟲夏草多J.安徽醫(yī)藥,2004,8(6):404-405.(責(zé)任編輯閆純有)(上接第63頁)2程水源,郝瑞霞,喬文麗,等.三維多箱模型預(yù)測大氣從擬合曲線(圖3圖5)可以看出,模型計算值和實(shí)測值擬合良好,完全能夠滿足實(shí)際生產(chǎn)問題的要求,所建立的模型能夠反映邯鄲市區(qū)采暖期內(nèi)的SO2濃度遷移轉(zhuǎn)化的規(guī)律。環(huán)境方法的研究J.環(huán)境科學(xué)進(jìn)展,1998,6(3):62-66.3CHENGSY.EstimationofmixingheightsusingdatafromairportmeteorologicalstationsoverlargeareaJ.JournalofEnvironmentalScienceandHealth,2002,37(6):997-1005.4孫揚(yáng),王躍思,劉廣仁,等.北京地區(qū)一次大氣環(huán)境持5結(jié)束語由上可知,以大氣地面污染帶為研究對象,進(jìn)行大氣污染物的數(shù)值模擬在理論上和實(shí)際應(yīng)用中都是可行的,具有

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