猴子瘦素leptin酶聯(lián)免疫分析

1、猴子瘦素(leptin)酶聯(lián)免疫分析試劑盒利用說明書本試劑盒僅供研究利用。檢測(cè)范圍：96T80ng/L-2000ng/L利用目的：本試劑盒用于測(cè)定猴子血清、血漿及相關(guān)液體樣本中瘦素(leptin)含量。實(shí)驗(yàn)原理本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中猴子瘦素(leptin)水平。用純化的猴子瘦素(leptin)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入瘦素(leptin),再與HRP標(biāo)記的瘦素(leptin)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，通過完全洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的瘦素(leptin

2、)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中猴子瘦素(leptin)濃度。試劑盒組成130倍濃縮洗滌液20mlX1瓶7終止液6mlX1瓶2酶標(biāo)試劑6mlX1瓶8標(biāo)準(zhǔn)品(4000ng/L)XI瓶3酶標(biāo)包被板12孔X8條9標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液XI瓶4樣品稀釋液6mlX1瓶10說明書1份5顯色劑A液6mlX1瓶11封板膜2張6顯色劑B液6MX1/瓶12密封袋1個(gè)標(biāo)本要求1 .標(biāo)本搜集后及早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。假設(shè)不能馬上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20C保留，但應(yīng)幸免反復(fù)凍融2 .不能檢測(cè)含NaM3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HR

3、P)活性。操作步驟1 .標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可依照以下圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。2000ng/L5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150M的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150W標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1000ng/L4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150M的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150川標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液500ng/L3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150M的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150川標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液250ng/L2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150M的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150川標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液125ng/L1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150M的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入1501標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2 .加樣：別離設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50卜山待測(cè)樣品孔中先加樣品

4、稀釋液40卜山然后再加待測(cè)樣品10川(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡可能不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。3 .溫育：用封板膜封板后置37溫育30分鐘。4 .配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸鐳水30倍稀釋后備用5 .洗滌：警惕揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。6 .加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50回，空白孔除外。7 .溫育：操作同3。8 .洗滌：操作同5。9 .顯色：每孔先加入顯色劑A50M，再加入顯色劑B50g,輕輕震蕩混勻，37避光顯色15分鐘.10 .終止：每孔加終止液50出，終止反映（現(xiàn)在藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。11 .測(cè)定：以空白空調(diào)零，

5、450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘之內(nèi)進(jìn)行。操作程序總結(jié)：準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37T反應(yīng)30分鐘洗板5次，加入酶標(biāo)試劑，37反應(yīng)30分鐘洗板5次，加入顯色液A、B,37顯色10分鐘加入終止液15分鐘之內(nèi)讀0D值計(jì)算計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，依照樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度：再乘以稀釋倍數(shù)：或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值比算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。注意事項(xiàng)1 .試劑盒從冷藏環(huán)境中掏出應(yīng)在室溫平穩(wěn)15-30分

6、鐘后方可利用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保留。2 .濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不阻礙結(jié)果。3 .各步加樣均應(yīng)利用加樣器，并常常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以幸免實(shí)驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)刻最好操縱在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦利用排槍加樣。4 .請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量太高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋必然倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)（XnX5）。5 .封板膜只限一次性利用，以幸免交叉污染。6 .底物請(qǐng)避光保留。7 .嚴(yán)格依照說明書的操作進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定必需以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).8 .所有