三七非皂苷類成分分析方法研究進(jìn)展

1、三七非皂苷類成分分析方法研究進(jìn)展        【摘要】     目的為三七提取的工藝研究提供有效的分析方法。方法對(duì)近年來國內(nèi)外有關(guān)三七中非皂苷成分分析方法的大量文獻(xiàn)進(jìn)行總結(jié)。結(jié)果所綜述的分析方法都在非皂苷成分的含量測(cè)定中都取得了成功。結(jié)論綜述非皂苷成分的分析方法對(duì)三七的提取工藝有著重要意義。     【關(guān)鍵詞】  三七； 非皂苷； 分析方法    Research Advan

2、cement  Analysis Methods of Non-saponin Constituents in Sanqi ResearchLIU Bo, WU Yanhong, SHEN Jiayin, ZHU Shengshan*(Research & Development Institute of Chinese Materia Medica of Guangdong College of Pharmacology, Guangzhou 510006, China)Abstract：ObjectiveTo provide effective analysis meth

3、ods for extraction technology in Sanqi.MethodsIt is aggreated by collecting lots of documents home and abroad on analysis methods of non-saponin constituents in Sanqi.ResultsThe analysis methods we summarized succeed in the determination of non-saponin constituents.ConclusionThe overview on analysis

4、 methods of non-saponin constituents in Sanqi is important to the establishment of extraction technology in Sanqi.Key words：Sanqi;  Non-saponin;  Analysis method     三七是云南道地特產(chǎn)中藥材,來源于五加科人參屬植物Panax notoginseng(Burk. ) F. H. Chen 的干燥根，主產(chǎn)于云南省文山州。三七主要含有皂苷、多糖、氨基酸等多種化學(xué)成分。三七總皂苷含有人參皂

5、苷Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rf，Rg1，Rg2，Rh1 和三七皂苷R1，R2，R3，R4，R6 等20 余種皂苷成分。其中人參皂苷Rb1 (Rb1) 、人參皂苷Rg1 (Rg1) 是三七總皂苷中含量最高的兩個(gè)成分,而三七皂苷R1 (R1) 則是三七總皂苷的特征化合物，但含量較低。三七皂苷的測(cè)定方法主要有：HPLC法、比色法、薄層掃描法等。很多人已對(duì)三七皂苷的檢測(cè)與分析方法進(jìn)行了綜述，如饒高雄1、陸方等2。越來越多的研究揭示了三七皂苷在抗菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝及免疫、治療心血管疾病和糖尿病等方面具有良好的前景3。近年來的研究還表明，三七中的非皂苷成分如：揮發(fā)油、黃酮類成分、糖類成分、

6、氨基酸成分、微量元素等也具有很好的生物活性，但是非皂苷成分分析方法的綜述尚未報(bào)道。本文重點(diǎn)就三七中的常見的非皂苷類成分的檢測(cè)和分析方法進(jìn)行較全面的綜述。1  三七中揮發(fā)油成分的測(cè)定    三七中的揮發(fā)油具有強(qiáng)烈三七香氣。揮發(fā)油總油中分離鑒定出34種化合物4，主要有酮、烯烴、環(huán)烷烴、倍半萜類、脂肪酸酯、苯取代物、萘取代物。在醫(yī)藥上三七揮發(fā)油具有微弱消毒及殺菌作用，局部有刺激作用，可松弛肌肉或有興奮作用，內(nèi)服可促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)和瀉下。三七中的部分揮發(fā)油更有抑制大腦延髓，鎮(zhèn)靜安神等特殊活性，其中-欖香烯具有抗癌作用。    胥聰?shù)?運(yùn)

7、用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和標(biāo)準(zhǔn)圖譜，對(duì)三七花揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行了分析研究。氣相色譜條件為：30 m×0.25 mm SE-54石英毛細(xì)管柱；柱溫80200（3·min-1）；柱前壓力6p·h-2；載氣：He；氣化室溫度230；進(jìn)樣量0.2 l。質(zhì)譜測(cè)定條件：電離方式EI；電子源溫度170；倍增電壓1 200 V；電離電壓70eV；發(fā)射電流0.25 mA；掃描范圍35350；掃描速度1次/s。最終氣相色譜測(cè)出106個(gè)峰，質(zhì)譜測(cè)出59個(gè)化合物，從中鑒定出37種成分，并測(cè)定其相對(duì)含量，以倍半萜類化合物為主。    施麗娜等6用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

8、并利用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖集分析了市售三七藥材揮發(fā)油的組成，從中鑒定了34種成分，測(cè)定了相對(duì)含量，其中有13個(gè)倍半萜烯和2個(gè)倍半萜醇。    呂晴等7采用自制的同時(shí)蒸餾萃取裝置提?。ㄋ魵庹麴s，乙醚萃?。┰颇衔纳饺呋ǖ膿]發(fā)油成分，然后經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。結(jié)果揮發(fā)油中共分離出91個(gè)成分，鑒定了53個(gè)化合物，主要為萜烯類及其含氧衍生物（71.15%）。該方法提取和測(cè)定揮發(fā)油高效、適用、準(zhǔn)確。2  三七中糖類成分的測(cè)定    三七含有單糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖以及低聚糖和多糖。多糖是三七的有效成分之一,具有多方面的生理活性，部分多

9、糖具有抗腫瘤活性。三七多糖還具有增強(qiáng)免疫功能等活性8, 毒性很低，在較低劑量即有效,對(duì)增強(qiáng)T細(xì)胞功能有較高的選擇性。中國科學(xué)院上海藥物研究所1987年對(duì)三七多糖進(jìn)行了分離純化, 證明其PNB組分有較強(qiáng)的免疫活性。PNB為分子量110,000道爾頓的雜多糖,由阿位伯糖及半乳糖組成, 其摩爾比為0.611。    劉剛等9采用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定了三七和三七根莖中總糖和還原糖的含量。將樣品、蒸餾水和3，5-二硝基水楊酸混合均勻，在沸水浴中加熱5 min，隨后冷水冷卻，最后于722分光光度計(jì)520 nm處測(cè)定吸光度A。結(jié)果總糖和還原糖的回收率分別為：98.78%(

10、RSD=0.78%)，99.29%（RSD=0.23%）。    崔秀明等10采用苯酚-硫酸比色法分析不同產(chǎn)地、不同規(guī)格、不同采收期三七中的多糖含量，并考察其變化規(guī)律。作者取樣品溶液于具塞試管中，加水至0.4 ml，加入5 %苯酚0. 2  ml混勻，迅速加入濃硫酸1 ml,搖勻，沸水浴加熱20 min，取出，迅速在冰上冷卻，用Beckman 650UV/ V 分光光度計(jì)于490 nm 處測(cè)定吸光度A。結(jié)果顯示，加樣回收率為99%，效果較好，可作為檢測(cè)三七中多糖成分的有效方法。3  三七中脂肪酸成分的測(cè)定    三

11、七種子進(jìn)行風(fēng)干后，用索氏提取器提取得到種仁油。種仁油呈淡黃色，具有三七特有的香氣，其組成主要為脂肪酸。    魯歧等11用GC法分析測(cè)定了人參屬植物的脂肪酸含量。其GC條件為：氯離子化檢測(cè)器，量程2，衰減4；擔(dān)體：Gas Chromsorb Q 100-200目；固定液為DEGS；色譜柱為毛細(xì)管玻璃柱（300 mm×32 mm）；固定相配比5%；載氣流速：氮?dú)?0 ml·min-1，氫氣60 ml·min-1，空氣500 ml·min-1；柱溫180，氣化室溫度240，檢測(cè)室溫度240。最后確定三七脂肪酸的組成：棕櫚酸18.

12、02%，油酸14.14%，亞油酸62.80%，亞麻油酸5.04%。    劉潤民等12用氣相色譜法鑒定了三七種仁油脂肪酸的組成。作者對(duì)種仁油進(jìn)行皂化，總脂肪酸得率為73.3%，不皂化物2.0%?？傊舅峒柞セ笥脷庀嗌V法分析，其條件為：(1)SE-54-30 m毛細(xì)管柱， 柱溫80-200，程序升溫3·min-1，進(jìn)樣量0.1 l；(2)10%DEGSCHRO填充柱，柱溫180，進(jìn)樣量0.13 l。結(jié)合紅外光譜法（IR）確定了脂肪酸的組成為：棕櫚酸3.0%，硬脂酸0.54，花生酸0.46%，棕櫚油酸0.53%，油酸87.48%，亞油酸7.07% ，亞油

13、烯酸0.21%。不皂化物用IR進(jìn)行分析，確定其組成為羽扇豆醇，白樺脂醇，16-羥基羽扇豆醇和豆甾醇。由此可見，紅外光譜和氣相色譜相結(jié)合可有效地鑒定三七種仁油中的成分和測(cè)定其各自的含量。4  三七中黃酮成分的測(cè)定    三七絨根中含有少量的黃酮類成分,魏均嫻等13 從中分離出兩種黃酮類成分：一種是槲皮素，另外一種苷元為槲皮素，糖元鑒定為木糖、葡萄糖和葡萄糖酸，糖的連接次序及位置未定。    鄭瑩等14從三七莖葉中分離得到6個(gè)黃酮類單體化合物，分別為：山柰酚、槲皮素、山柰酚-7-O-L-鼠李糖苷、山柰酚-3-O-D-半乳糖苷、山

14、柰酚-3-O-D-半乳糖葡萄糖苷、槲皮素-3-O-D-半乳糖（21）葡萄糖苷。    槲皮素及其導(dǎo)入親水性基團(tuán)后的衍生物，具有祛痰、止咳、平喘、強(qiáng)心、降血壓、擴(kuò)冠、降血酯、抗炎、抗過敏、解痙、抗癌、抗出血作用，可作為治療循環(huán)障礙、動(dòng)脈粥樣硬化及閉塞性腦血管疾病藥物。三七黃酮與皂苷合用, 生理活性最強(qiáng), 分開使用則證明黃酮能顯著增加心肌冠脈流量。    張仕秀15采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法對(duì)三七莖葉內(nèi)的黃酮類物質(zhì)含量進(jìn)行了初步測(cè)定。作者采用索氏提取法70%的乙醇為溶劑加熱回流4 h，過濾，取濾液加5%NaNO2 溶液，放置6 min，加

15、10%Al（NO3）3 ，反應(yīng)生成紅色絡(luò)合物，再放置6 min，加4%NaOH溶液加水放置15 min，在500 nm處測(cè)定吸光度，測(cè)定效果可行。    鄭瑩等16用RP-HPLC法測(cè)定了三七葉中兩種主要的黃酮類成分：山柰酚-3-O-D-半乳糖（2 1）葡萄糖苷()和槲皮素-3-O-D-半乳糖（2 1）葡萄糖苷（）的含量。采用ZORBAX Extend C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流動(dòng)相為甲醇-0.15%乙酸水溶液（35：65），流速1.2 ml·min-1，檢測(cè)波長268 nm，柱溫25。結(jié)果顯示，化合物的平均加樣回收率為

16、97.5%，RSD為0.78%；化合物的平均加樣回收率為101.8%，RSD為1.1%。該方法簡便快捷，準(zhǔn)確度高。5  三七中三七素的測(cè)定    文山三七中含有19種以上的氨基酸，有7種是體內(nèi)必需的17，其中一種特殊氨基酸稱為三七素（dencichine），具有非常好的止血作用。人參屬的幾種名貴中藥均含有止血成分三七素，但以三七含量最高（0.90），人參次之（0.50），西洋參最低（0.31），因此，三七的止血活性最好。三七素的結(jié)構(gòu)為：    1981年日本小菅卓夫首次從三七中得到了三七素并證明有止血活性。 

17、60;  付春梅等18用HPLC法測(cè)定了三七及其制劑中三七素的含量。迪馬DiamonsilTM C18色譜柱(200 mm×4.6 mm，5 m)，自填國產(chǎn)CYW C18保護(hù)柱(10 mm×4.5 mm，5 m)，流動(dòng)相為含3.5 mmol·L-1磷酸二氫鈉的甲醇-0.03%四丁基氫氧化胺(2080，磷酸調(diào)pH為3.8)，體積流量為1 ml·min-1，柱溫40，檢測(cè)波長為220 nm，進(jìn)樣量為20 l。結(jié)果顯示平均加樣回收率為98.8%，RSD為1.7%。    朱靜等19采用柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定了三七及

18、其制劑中三七素的含量。以硼砂緩沖液(pH 9.18)為提取溶劑，回流提取藥材及制劑中的三七素；以氯甲酸芴甲酯( FMOC)作為衍生化試劑，對(duì)三七素提取液進(jìn)行柱前衍生化，采用RP-HPLC，ODS柱分離，并通過紫外檢測(cè)的方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果三七素的線性范圍為1.76352 mg·L - 1 ，最低檢測(cè)限為60g·L - 1。衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定，過量的衍生化試劑無干擾。平均加樣回收率為95.3%, RSD為1.7%。該方法操作簡單，快速，靈敏度高，可用于三七藥材及制劑中三七素的分析測(cè)定和三七素的藥物代謝研究。    魯歧等20用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定了三七

19、中三七素的含量。首先是三七素的分離，采用滲漉法用甲醇進(jìn)行洗脫，滲漉液用等量的水飽和正丁醇反復(fù)萃取，其中水層濃縮后加到Sephadex LH-20凝膠柱（2.6×100 cm）上蒸餾水洗脫。然后對(duì)各管流出液進(jìn)行紙層析。展開劑：（A）n、AuOH-HAC-H2O（411），（B）n-BuOH-HAC-EtOH- H2O（4112）。顯色劑：茚三酮。顯色溫度：110。合并與標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)顏色及Rf相同的流出液，然后加到CM Sephadex C-25離子交換層析柱（3.0×60 cm）上，用純蒸餾水洗脫。流速、收集方法及紙層析檢識(shí)方法同上。最后放置，析出晶體。水中重結(jié)晶，得精制無色板

20、狀結(jié)晶。再用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)品的進(jìn)樣量與其測(cè)得峰面積求得Fact值，再根據(jù)Fact和樣品的峰面積，求得樣品進(jìn)樣量中三七素的毫克數(shù)。    章觀德等21利用三七素與衍生化試劑熒光胺反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光的特性測(cè)定了三七中三七素的含量。反應(yīng)原理如下：    三七素衍生化后進(jìn)行薄層層析，展開劑采用混合溶劑乙醇-丙酮-水-濃氨水（2.51.70.80.5），此時(shí)Rf=0.39，紫外燈下呈亮黃綠色熒光；隨后進(jìn)行薄層掃描，激發(fā)波長為395 nm，選擇發(fā)射濾光片，以二號(hào)濾光片最佳，基線噪音小，靈敏度高。結(jié)果顯示；三七素對(duì)照品在1083 ng范

21、圍內(nèi)是通過原點(diǎn)的直線，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，精密度為RSD為2.09%。實(shí)驗(yàn)還通過比較層析前后熒光衍生化發(fā)現(xiàn)，將樣品在試管中進(jìn)行衍生化，然后將反應(yīng)溶液點(diǎn)在薄層上，測(cè)定熒光強(qiáng)度，即層前衍生化效果較好。因?yàn)槿咚卦谒芤褐胁环€(wěn)定，放置一星期后薄層層析，在三七素的斑點(diǎn)上方出現(xiàn)另一斑點(diǎn)，樣品的水溶液放置后也有相應(yīng)斑點(diǎn)存在。因此對(duì)照品用10%丙醇或50%乙醇配置溶液，低溫可保存數(shù)周。三七素?zé)晒獍费苌镌谏珊?0 min響應(yīng)值逐漸降低，因此衍生化反應(yīng)后溶液應(yīng)隨即點(diǎn)樣層析測(cè)定。6  三七中微量元素的測(cè)定    隨著中藥生產(chǎn)的現(xiàn)代化和精細(xì)化, 在人工栽培過程中,

22、 若不考慮三七的生長、生理需求和根據(jù)土壤中礦質(zhì)元素含量, 確定化肥的最佳用量、施用日期以及營養(yǎng)元素的最佳比例, 則會(huì)對(duì)三七體內(nèi)有機(jī)化合物代謝產(chǎn)生不利影響。三七中某些微量元素對(duì)人體有重要生理作用?，F(xiàn)代研究表明，微量元素與人體的內(nèi)分泌、生長發(fā)育、免疫和感染、致畸形、腫瘤、心血管疾病、創(chuàng)傷愈合等密切相關(guān)。因此對(duì)三七中的微量元素進(jìn)行測(cè)定非常有必要。    三七中微量元素的檢測(cè)方法主要有原子吸收分光光譜法、原子熒光光譜法。    李學(xué)章等22用原子吸收法測(cè)定了三七中的銅、鎘和鋰的含量。優(yōu)化的最佳儀器工作條件見表1(902AB型原子吸收光譜儀)。

23、表1  銅、鎘、鋰測(cè)定的最佳儀器工作條件（略）    銅、鎘、鋰的檢出限分別為：0.002 3 g·ml-1,0.002 6 g·ml-1和0.002 0 g·ml-1，精密度RSD分別為：2.50%,10.08%和9.92%，回收率分別在96%103%，92%108%和96%104%之間。表明該方法準(zhǔn)確、靈敏度高、切實(shí)可行。    劉世熙等23用微波消解、流動(dòng)注射-氫化物發(fā)生原子熒光光譜法測(cè)定了三七中的硒含量。實(shí)驗(yàn)最優(yōu)的測(cè)定條件見表2（AF-610A 原子熒光光譜儀）。表2  硒含量

24、測(cè)定的最優(yōu)條件（略）    該方法的檢出限為0.30g·L-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%，線性范圍為0100g·L-1，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，回收率為96.7%100.7%。表明該方法具有消化效率高、損失小、測(cè)定簡便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。7  總結(jié)    本文較全面地總結(jié)了近年來三七中非皂苷類成分的分析方法。以上各分析方法都在非皂苷類成分的定量分析中取得了成功。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，三七中非皂苷成分的分析方法將會(huì)朝著更靈敏、更便捷、更環(huán)保、高通量、高精度的方向發(fā)展。   

25、60;【參考文獻(xiàn)】  1饒高雄，王興文三七皂苷的檢測(cè)與分析方法J.云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，24（3）：4.2陸方，宋海峰皂苷分析方法研究進(jìn)展J.天津中醫(yī)藥，2005，22（3）：257.3孫麒，巨勇，趙玉芬具有生物活性的甾體皂苷J(rèn).中成藥，2002,33(3)：2764魯歧，李向高三七揮發(fā)油成分的研究J.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1987，22（9）：528.5胥聰 ，龍普明，魏均嫻，等三七花揮發(fā)油的化學(xué)成分研究J.華西藥學(xué)雜志.，1992，7（2）：79.6施麗娜 ，劉潤民，曹樹明，等市售三七揮發(fā)油成分的研究J.昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1989，10（4）：6.7呂晴，秦軍，章平，等同時(shí)蒸餾萃取三七花揮發(fā)油成分的氣相色譜-質(zhì)譜分析J.藥物分析雜志，2005，25（3）：284.8GaoH，Wang F ,Lien EJ，Trousdale MDImmunostimulating polysaccharides from Panax notog