內(nèi)源性一氧化氮對致敏大鼠淋巴細(xì)胞凋亡的影響

1、    內(nèi)源性一氧化氮對致敏大鼠淋巴細(xì)胞凋亡的影響        觀察致敏大鼠支氣管肺組織Fas抗原表達、支氣管肺泡灌洗液中淋巴細(xì)胞及脾T淋巴細(xì)胞凋亡的情況及左旋精氨酸（L-arg）、硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)對其影響。探討哮喘炎癥發(fā)生不易被消除的原因與淋巴細(xì)胞凋亡情況及與內(nèi)源性NO的關(guān)系。 材料與方法儀器與試劑：流式細(xì)胞儀為美國Becton Dickinson產(chǎn)品，免疫組化sABC法檢測支氣管肺組織Fas抗原試劑盒購于武漢博士德生物工程公司。體內(nèi)實驗：雄性SD大鼠2

2、4只，體重200±50g，由同濟醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，隨機分為4組，每組6只，A組為正常對照組，以生理鹽水代替卵清蛋白(OVA)抗原；B組為陽性對照組，給予OVA抗原致敏和刺激，但不用左旋精氨酸甲酯(L-NAME)或左旋精氨酸(L-arg)，以生理鹽水代之；C、D均為用藥組：每天于1% OVA超聲霧化吸入前分別給予腹腔注射300mg/kg L-arg(C組)或30mg/kg L-NAME(D組)。B、C、D組大鼠的致敏及刺激參照文獻1方法進行。超聲霧化吸入后第7?d取右肺上葉肺組織置于液氮中保存待用于免疫組化染色，其余肺組織進行支氣管肺泡灌洗，灌洗液(BALF)細(xì)胞作細(xì)胞分類后，

3、用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)至5×106/ml，置于培養(yǎng)瓶內(nèi)貼壁培養(yǎng)2?h(37，5% CO2 )，取懸浮細(xì)胞即為BALF中的淋巴細(xì)胞，分別用TUNEL原位末端標(biāo)記法，流式細(xì)胞儀(FCM-DNA)及電鏡檢測凋亡。體外實驗：取B組大鼠脾臟，將脾細(xì)胞懸液用Tris-NH4Cl破紅細(xì)胞后，用淋巴細(xì)胞分離液分離出大鼠脾淋巴細(xì)胞, 濃度調(diào)至2×106/ml，加入培養(yǎng)瓶中，每瓶2ml，均加入終濃度為100mg/L OVA，分別加入終濃度為0、10-1mmol/L、5×10-1mmol/L、1mmol/L的L-arg；5×10-2mmol/L、5×

4、;10-1mmol/L、1mmol/L L-NAME于5% CO2、37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72?h后，將懸浮細(xì)胞用尼龍棉柱法分離出T淋巴細(xì)胞，將T淋巴細(xì)胞用TUNEL原位末端標(biāo)記法檢測凋亡細(xì)胞百分率。sABC法檢測各組大鼠肺組織Fas抗原表達： 參照試劑盒說明進行操作。每張玻片至少隨機觀察5個視野，以每視野支氣管粘膜下陽性細(xì)胞(呈棕色)的積分吸光度值(A值)表示。結(jié)果與討論1.體內(nèi)實驗：B組大鼠BALF中淋巴細(xì)胞及嗜酸細(xì)胞(Eos)數(shù)顯著多于A組(均為P<0.01)，C組淋巴細(xì)胞及Eos均顯著高于B組(P<0.01)，D組則相反(P<0.01)。電鏡顯示凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)凝集成塊狀，

5、或形成凋亡小體，但胞膜仍完整。TUNEL原位末端標(biāo)記可見核染色深紫藍色的凋亡細(xì)胞，A組BALF 中明顯較陽性對照組大鼠BALF中淋巴細(xì)胞凋亡數(shù)增多(P<0.01)，C組又較B組減少(P<0.01)，而D組則多于B組(P<0.01)。流式細(xì)胞FCM-DNA檢測結(jié)果的趨勢變化與TUNEL法一致，凋亡細(xì)胞顯著增多者在G0/G1期前有明顯的亞二倍體峰（pre-G1 峰）。B組大鼠支氣管肺組織Fas表達主要位于支氣管周圍炎性細(xì)胞，C組Fas抗原表達（22.37±3.2）較B組(73.06±14.43)減少(P<0.01)，D組(166.95±17.0

6、9)則明顯高于B組(P<0.01)，B組較A組(146.05±22.64)減少(P<0.01)。2.體外實驗(表1) ：TUNEL檢測顯示，10-1mmol/L、5×10-1mmol/L的L-arg使OVA刺激后培養(yǎng)72?h的脾淋巴細(xì)胞中凋亡T淋巴細(xì)胞百分率減少(P<0.05，P<0.01)；1mmol/L的L-arg則使凋亡T淋巴細(xì)胞增加(P<0.05)；5×10-2mmol/L L-NAME對凋亡無影響，5×10-1mmol/L、1mmol/L L-NAME均促進T淋巴細(xì)胞凋亡(P<0.05，P<0.01)。

7、NO與哮喘氣道炎癥關(guān)系的研究近年有不少新觀點，但有關(guān)NO與哮喘炎癥組織中淋巴細(xì)胞凋亡的關(guān)系研究尚少。本實驗觀察到，經(jīng)L-arg處理的致敏大鼠BALF中Eos數(shù)量增多的同時，BALF中凋亡淋巴細(xì)胞及氣道炎性細(xì)胞Fas抗原表達減少；而L-NAME則在減少致敏大鼠BALF中Eos數(shù)目的同時尚可使凋亡淋巴細(xì)胞及氣道炎性細(xì)胞Fas抗原表達增加。體外實驗結(jié)果與體內(nèi)實驗結(jié)果一致。NO抑制凋亡的機制尚不清楚，可能與NO直接或通過cGMP依賴方式間接抑制Caspase-3樣蛋白激酶活性而抑制凋亡有關(guān)3，或可能與一定水平NO促進TH2細(xì)胞因子IL-4分泌增加有關(guān)4，后者可明顯抑制T淋巴細(xì)胞Fas基因表達，從而抑制

8、T淋巴細(xì)胞凋亡并使其生存時間延長。表1體外L-NAME及L-arg對致敏大鼠脾T淋巴細(xì)胞凋亡的作用（%，±s）鼠數(shù)OVA對照(100mg/L)L-arg+OVA(100mg/L)L-NAME+OVA(100mg/L)F值P值10-1(mmol/L)5×10-1(mmol/L)1(mmol/L)5×10-2(mmol/L)5×10-1(mmol/L)1(mmol/L)610.26±2.677.45*±1.734.90±0.7213.77*±2.839.22±1.5814.21*±1.1816.86

9、±2.0919.02<0.01與OVA比*P<0.05；P<0.01 作者單位：薛建敏（武漢同濟醫(yī)科大學(xué)同濟醫(yī)院呼吸科）徐永健（武漢同濟醫(yī)科大學(xué)同濟醫(yī)院呼吸科）張珍祥（武漢同濟醫(yī)科大學(xué)同濟醫(yī)院呼吸科）沈關(guān)心（同濟醫(yī)科大學(xué)免疫室）參考文獻：1薛建敏，徐永健，張珍祥. 內(nèi)源性一氧化氮對致敏大鼠氣道炎癥及淋巴細(xì)胞功能的影響. 中華結(jié)核和呼吸雜志，1998，21：208-211.2Gochuico BR，Miranda KM，Hessel EM，et al. Airway epithelial Fas ligand expression: potential role in modulating bronchial inflammation. Am J Physiol, 1998, 274:L444-L449.3Taylor BS，Alaron LH，Billiar TR，et al. Inducible nitric oxide synthase in the liver: regulation and function. Biochemistry (M