魚(yú)腥草離體再生及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

1、魚(yú)腥草離體再生及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(1)                  作者：董燕，來(lái)慧麗，張雅明，周聯(lián)，王培訓(xùn)【摘要】  【目的】建立魚(yú)腥草離體再生系統(tǒng)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法?！痉椒ā恳贼~(yú)腥草葉片為外植體置于不同激素配比的MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和分化再生。以根癌農(nóng)桿菌EHA105/pCAMBIA13052進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將外源GUS(葡萄糖醛糖苷酶)基因、潮霉素抗性基因轉(zhuǎn)入魚(yú)腥草，以組織化學(xué)染色法檢測(cè)G

2、US活性，以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法鑒定基因組中的GUS基因?！窘Y(jié)果】 MS培養(yǎng)基中添加01 mg/L 奈乙酸(NAA)、20 mg/L 6其基腺嘌呤(6BA)、05 mg/L呋喃氨基嘌呤(KT)適于魚(yú)腥草葉片為外植體進(jìn)行離體再生，出芽率達(dá)967%。潮霉素作為篩選試劑，濃度為25 mg/L;頭孢霉素作為抑菌劑，濃度為250 mg/L。經(jīng)感染的外植體中GUS 反應(yīng)呈陽(yáng)性的占750 %;8周統(tǒng)計(jì)抗性芽比率55%，PCR分析表明GUS基因已整合到魚(yú)腥草基因組中?！窘Y(jié)論】通過(guò)魚(yú)腥草離體培養(yǎng)條件的研究及根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了較高的離體再生頻率，實(shí)現(xiàn)了魚(yú)腥草的遺傳轉(zhuǎn)化。 【關(guān)鍵詞】 

3、魚(yú)腥草/生長(zhǎng)和發(fā)育;離體再生;遺傳轉(zhuǎn)化;根癌農(nóng)桿菌魚(yú)腥草為三白草科植物蕺菜(Houttuynia cordata Thunb)的全草，是多年生的草本植物，具清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋等功效，在我國(guó)許多地區(qū)均有大面積人工栽培。魚(yú)腥草生長(zhǎng)旺盛，易于離體培養(yǎng)，是較好的轉(zhuǎn)基因受體材料，而目前未見(jiàn)魚(yú)腥草轉(zhuǎn)基因報(bào)道。本研究以魚(yú)腥草葉片為外植體，通過(guò)離體再生和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化建立了魚(yú)腥草遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，為魚(yú)腥草種質(zhì)資源優(yōu)化或作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白打下基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。1材料與方法11植物材料魚(yú)腥草無(wú)菌苗，自廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥圃取魚(yú)腥草植株的莖尖，自來(lái)水沖洗10 min，用體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡30 s

4、，1 g/L升汞浸泡810 min，無(wú)菌水沖洗68次，接種于MS培養(yǎng)基上，2528，光照14 h/d，光照度2 000 Lx，培養(yǎng)無(wú)菌苗。12質(zhì)粒和菌株質(zhì)粒pCAMBIA13052和根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光教授惠贈(zèng)，根癌農(nóng)桿菌工程細(xì)胞EHA105/pCAMBIA13052為本室構(gòu)建。質(zhì)粒pCAMBIA13052 攜帶葡萄糖醛糖苷酶報(bào)告基因(GUS)，具有潮霉素抗性基因(植物選擇標(biāo)記)和卡那霉素抗性基因(細(xì)菌選擇標(biāo)記)。13主要試劑與儀器植物激素奈乙酸(NAA)、呋喃氨基嘌呤(KT)、6芐基腺嘌呤(6BA)和頭孢霉素(

5、cefotaxine)均購(gòu)于廣州威佳生物技術(shù)公司,卡那霉素(kanamycin)和羧芐青霉素(carbenicillin)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品,氯霉素(chloramphenicol)為MEBCHEM公司產(chǎn)品,潮霉素(hygromycin，Hyg)為德國(guó)Roche公司產(chǎn)品,植物基因組DNA提取試劑盒(DP305)為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品，500 bp DNA Ladder為寶生物(大連)有限公司產(chǎn)品，乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)為美國(guó)MEBCHEM產(chǎn)品,5溴4氯3吲哚D葡萄糖苷酸酯(XGluc)為美國(guó)Ameresco公司產(chǎn)品。2720型聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)

6、增儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品，GDS7500凝膠成像及分析系統(tǒng)為英國(guó)UVP公司產(chǎn)品。14培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基為MS，用于無(wú)菌苗的培養(yǎng)。在基本培養(yǎng)基中添加植物激素用于離體再生，加入一定量抗生素用于篩選培養(yǎng)。LB培養(yǎng)基用于農(nóng)桿菌培養(yǎng)。15GUS基因轉(zhuǎn)化魚(yú)腥草取無(wú)菌苗的葉片，切下直徑為5 mm的葉圓片，葉面朝上置于培養(yǎng)基上，避光預(yù)培養(yǎng)2 d。挑取EHA105/pCAMBIA13052農(nóng)桿菌單菌落，接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基(含17 mg/L氯霉素和100 mg/L卡那霉素)中，28、200 r/min，振蕩培養(yǎng)24h后，取1 mL菌液，接種到30 mL LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至D600為0304時(shí)，

7、將預(yù)培養(yǎng)2 d后的葉圓片浸沒(méi)于菌液中侵染葉片15 min，取出后置于無(wú)菌濾紙上吸去附著的菌液，置于添加100 mol/L乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基上，避光共培養(yǎng)2 d，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上再避光培養(yǎng)7 d后，進(jìn)行光照培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度2528，光照14 h/d，光照度2 000 Lx。16GUS活性的組織化學(xué)鑒定參照植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南2，采用GUS組織化學(xué)染色法檢測(cè)葡萄糖醛糖苷酶活性。17GUS基因整合鑒定采用文獻(xiàn)報(bào)道1的GUS基因片段的引物序列如下：上游引物：5GTGGAATTGATCAGCGTTGG3;下游引物：5ATCGGCATGAACTTCGGTG3，委托上海生物工程技術(shù)有限公司合成。以植物D

8、NA提取試劑盒提取抗性植株總DNA，以GUS 上、下游引物進(jìn)行PCR鑒定：94變性5 min后進(jìn)入PCR循環(huán)，即94、1 min，59、1 min，72、1 min，35個(gè)循環(huán)，72延伸7 min。2結(jié)果與分析21不同激素組合對(duì)魚(yú)腥草離體再生的影響采用添加不同激素組合的MS培養(yǎng)基進(jìn)行以魚(yú)腥草葉片為外植體的離體培養(yǎng)(見(jiàn)表1)，結(jié)果顯示單獨(dú)添加2,4D時(shí)出愈率高，但不分化。添加NAA和6BA可誘導(dǎo)愈傷并出芽，而同時(shí)添加2,4D時(shí)出愈率提高，但不出芽，說(shuō)明2,4D有利于愈傷組織的形成，但抑制再生出芽。在NAA、6BA組合中再添加KT可明顯提高出芽率，表明KT有利于出芽。確定添加01 mg/L NAA

9、、20 mg/L 6BA、05 mg/L KT適于魚(yú)腥草離體再生，培養(yǎng)1周開(kāi)始出現(xiàn)愈傷組織顆粒，培養(yǎng)3周分化出芽，待芽長(zhǎng)至2cm左右從外植體上切下，轉(zhuǎn)至MS基本培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根(圖1)。表1激素對(duì)魚(yú)腥草離體再生的影響22篩選培養(yǎng)中潮霉素濃度確定質(zhì)粒pCAMBIA13052上有潮霉素(Hyg)抗性植物選擇標(biāo)記。取魚(yú)腥草切下的葉圓片在Hyg濃度分別為0、25、50、75 mg/L的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)5周，觀察愈傷組織芽分化的情況，當(dāng)Hyg濃度為25 mg/L時(shí)，魚(yú)腥草有愈傷組織，但極少有芽分化，濃度為50 mg/L時(shí)，愈傷組織很少且無(wú)芽分化，大部分葉片出現(xiàn)萎黃，失去活力。因此，采用25 mg/L H

10、yg的較低濃度進(jìn)行前期篩選，以利于植物組織的活力，8周后采用50 mg/L Hyg篩選以減少假陽(yáng)性植株。本篇論文由網(wǎng)友投稿，讀書(shū)人只給大家提供一個(gè)交流平臺(tái)，請(qǐng)大家參考，如有版權(quán)問(wèn)題請(qǐng)聯(lián)系我們盡快處理。23抑菌劑的確定植物材料受到農(nóng)桿菌侵染后，需要抗生素及時(shí)有效地抑制、殺死農(nóng)桿菌，以防農(nóng)桿菌的大量繁殖影響植物細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，且抗生素對(duì)植物組織培養(yǎng)具有抑制作用，因此篩選出合適的抗生素及使用濃度對(duì)后續(xù)的轉(zhuǎn)化十分必要。本研究通過(guò)抑菌圈實(shí)驗(yàn)比較頭孢霉素與羧芐青霉素對(duì)農(nóng)桿菌EHA105的抑菌效果和使用濃度。結(jié)果表明，羧芐青霉素對(duì)農(nóng)桿菌EHA105的抑菌效果不明顯，沒(méi)有明顯抑菌圈產(chǎn)生。頭孢霉素在濃度大于2

11、50 mg/L時(shí)，對(duì)農(nóng)桿菌EHA105有明顯抑制。而且通過(guò)抗生素耐性實(shí)驗(yàn)確定250 mg/L頭孢霉素對(duì)魚(yú)腥草的生長(zhǎng)活性無(wú)明顯影響。因此在篩選培養(yǎng)時(shí)添加250 mg/L頭孢霉素抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。24根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化和抗性植株再生經(jīng)比較農(nóng)桿菌濃度、侵染時(shí)間以及預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間等對(duì)轉(zhuǎn)化的影響，確定魚(yú)腥草葉圓片預(yù)培養(yǎng)2 d，以D600為0304的活化農(nóng)桿菌侵染15 min，轉(zhuǎn)入添加100 mol/L AS的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2 d，轉(zhuǎn)至添加25 mg/L Hyg和250 mg/L頭孢霉素的篩選培養(yǎng)基上，受侵染葉片能較好產(chǎn)生愈傷組織并分化。愈傷顆粒約2周開(kāi)始長(zhǎng)出，6周開(kāi)始分化出芽，8周統(tǒng)計(jì)抗性芽比率

12、55%的外植體分化出芽并保持活力。25GUS基因檢測(cè)質(zhì)粒pCAMBIA13052 攜帶GUS基因帶有內(nèi)含子序列，其表達(dá)產(chǎn)物葡萄糖醛糖苷酶作用于底物XGluc時(shí)，將無(wú)色的底物水解產(chǎn)生出深藍(lán)色的5溴4氯靛藍(lán)，用組織化學(xué)染色定位法可快速檢測(cè)GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)。農(nóng)桿菌侵染外植體3 d后取部分外植體進(jìn)行GUS 基因瞬時(shí)表達(dá)活性的檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)轉(zhuǎn)化的75 %的葉圓片顯藍(lán)色，未經(jīng)轉(zhuǎn)化處理的對(duì)照無(wú)任何藍(lán)色反應(yīng)，說(shuō)明GUS基因已轉(zhuǎn)入魚(yú)腥草組織細(xì)胞并表達(dá)。對(duì)再生抗性植株總DNA的PCR分析中(圖2)，轉(zhuǎn)基因植株中可獲得大小約18 kb的PCR產(chǎn)物，與預(yù)期相符，結(jié)果表明GUS基因已整合到魚(yú)腥草基因組中。3討論董燕，

13、等.魚(yú)腥草離體再生及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化第1期通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)基因藥用植物已有多種，而魚(yú)腥草作為一種兼有藥用和食用價(jià)值、已被大面積栽培的藥用植物還未見(jiàn)此方面的報(bào)道。建立一個(gè)高效穩(wěn)定的離體再生系統(tǒng)，是魚(yú)腥草遺傳轉(zhuǎn)化的先決條件。魚(yú)腥草具有再生能力強(qiáng)、再生方式多樣的特點(diǎn)，主要以莖節(jié)、莖尖和帶側(cè)芽莖段為外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織,再分化形成叢生芽進(jìn)行快速繁殖3-5，雖有以葉片為外植體的研究，但培養(yǎng)周期較長(zhǎng)6。本試驗(yàn)建立了以魚(yú)腥草葉片作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織并分化的再生體系，具有培養(yǎng)周期短、再生率較高的優(yōu)點(diǎn)，不僅為魚(yú)腥草離體再生提供了新途徑，也為魚(yú)腥草遺傳轉(zhuǎn)化工作的開(kāi)展及轉(zhuǎn)化效率的提高創(chuàng)造了條件。在以

14、農(nóng)桿菌工程細(xì)胞EHA105/pCAMBIA13052介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化魚(yú)腥草的研究中，將報(bào)告基因GUS和植物選擇標(biāo)記潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hygromycin B phosphotransferase，HPT)導(dǎo)入魚(yú)腥草，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有潮霉素抗性。用組織化學(xué)染色法快速檢測(cè)GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)，鑒定GUS基因已轉(zhuǎn)入魚(yú)腥草植物細(xì)胞內(nèi)，對(duì)再生抗性植株基因組的PCR分析初步證明GUS基因已整合到魚(yú)腥草染色體中，說(shuō)明已初步建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的魚(yú)腥草遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，為利用基因工程技術(shù)進(jìn)行魚(yú)腥草新品種的開(kāi)發(fā)、種質(zhì)資源的優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1葉華，王嫻，王敬喬，等帶植物內(nèi)含子的GUS 基因強(qiáng)表達(dá)載體的構(gòu)建J思茅師范高等專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào)， 2005, 21(3): 12P 馬利加, D F克萊森, W 格瑞森姆 植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南M 北京：科學(xué)出版社，2000: 473Tauzuki K， Miyasita S，Kono N，et al Report on the plant regeneration from the callus made of the leaf segments of Houttuynia cordata Thunb.J Bulletin of Nippon Veterinary and Animal Science University, 19