膠質(zhì)母細(xì)胞瘤紫杉醇增敏放射的體外實(shí)驗(yàn)研究

1、    膠質(zhì)母細(xì)胞瘤紫杉醇增敏放射的體外實(shí)驗(yàn)研究        摘要目的：通過體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)紫杉醇對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的放射增敏作用。方法：應(yīng)用人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系BT325。(1)細(xì)胞暴露于不同濃度紫杉醇，分別于6、12、24、48、72小時(shí)收集標(biāo)本、作流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期分析。(2)細(xì)胞經(jīng)紫杉醇和(或)照射處理后，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，計(jì)算出10%存活率時(shí)的放射增敏比(SER)。結(jié)果：細(xì)胞暴露于紫杉醇后發(fā)生了G2-M期阻滯，當(dāng)紫杉醇作用時(shí)間較長(zhǎng)或濃度較高時(shí)，G2-M期細(xì)胞的比率也較高，

2、紫杉醇+照射組的細(xì)胞生長(zhǎng)受到顯著抑制；1、10、100nmol紫杉醇在10%存活率時(shí)的SER分別為1.1、1.9、3.0。結(jié)論：紫杉醇能將細(xì)胞阻滯在對(duì)射線最敏感的G2-M期；紫杉醇能增強(qiáng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的放射生物學(xué)效應(yīng)，值得進(jìn)一步研究。關(guān)鍵詞膠質(zhì)母細(xì)胞瘤紫杉醇放射增敏體外 In vitro studies on radiosensitizing effect of taxol in glioblastoma.Xiu Bo, Duan Guosheng, Liu Zonghui, et al. Dept. of Neurosurgery, Navy General Hospital, Beijing

3、 100037AbstractObjective: To assess the radiosensitisation properties of taxol on human glioblastoma cell line in vitro. Methods: A human glioblastoma cell line, BT325, was used for this experiment. (1) Cells were exposed to taxol at different concentrations for 6, 12, 24, 48 and 72h after which cel

4、l cycle analysis was performed with flow cytometer. (2) The cells were treated with taxol or/and radiation (RT). Growth curves were drawn and sensitizer enhancement ratios (SER) were evaluated. Results: The cells developed a G2-M block after exposure to taxol. The percentage of the cell population i

5、n G2-M was higher at longer taxol exposure time and at higher taxol concentration. The cell growth for taxol plus RT was significantly inhibited. The SERs at 10% survival for 1, 10 and 100nmol taxol were 1.1, 1.9 and 3.0, respectively. Conclusion: Taxol can block tumor cells in G2-M which are the mo

6、st radiosensitive phases. The results that taxol enhances effect of RT on glioblastoma in vitro suggest taxol may be a promising radiosensitive agent for glioblastoma.Key wordsGlioblastomaTaxolRadiosensitizing In vitro惡性膠質(zhì)瘤手術(shù)難以全切，極易復(fù)發(fā)。而常規(guī)放療的效果亦不夠滿意，主要原因是某些腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線不敏感（1，2）。一些腫瘤學(xué)家試應(yīng)用放射增敏劑來提高腫瘤的放射敏感性，有

7、的改善了膠質(zhì)瘤患者的生存期和生存質(zhì)量（3）。紫杉醇(taxol)是一種新型抗癌藥。近年來發(fā)現(xiàn)，它除具有抗癌活性外，還可增強(qiáng)某些腫瘤的放射效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)旨在通過體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)紫杉醇對(duì)腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的放射增敏效應(yīng)并探討其作用機(jī)制。材料與方法一、材料1. 人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系BT-325（4）。2. 紫杉醇(美國Sigma公司)。3. IM DM培養(yǎng)基，內(nèi)含15%新生牛血清，青霉素100U/ml，鏈霉素100g/ml。4.DNA熒光探針碘化丙啶(PI，美國Sigma公司)。5. 流式細(xì)胞儀(FACS420，美國BD公司)。6. 直線加速器(美國varian,clinacl800)，X線，8MeV，劑量

8、率400cGy/min。二、方法1. 紫杉醇對(duì)細(xì)胞周期的影響：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞5×106個(gè)細(xì)胞接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，貼壁培養(yǎng)24小時(shí)后，更換含有不同濃度(1、10、100、1000nmol)紫杉醇的培養(yǎng)液10ml。分別于給藥后6、12、24、48、72小時(shí)收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，用RNA酶消化，PI染色，尼龍網(wǎng)過濾標(biāo)本，上機(jī)檢測(cè)。每分標(biāo)本至少檢測(cè)1萬個(gè)細(xì)胞，測(cè)出細(xì)胞周期分布百分率。每個(gè)紫杉醇濃度組為兩瓶培養(yǎng)，重復(fù)一次實(shí)驗(yàn)，取檢測(cè)結(jié)果的平均值。2.生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)：(1)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：將培養(yǎng)細(xì)胞分成對(duì)照組、紫杉醇組、照射組及紫杉醇+照射組。將5×105個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞

9、接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，貼壁培養(yǎng)24小時(shí)。紫杉醇組和紫杉醇+照射組更換含有10nmol紫杉醇的培養(yǎng)基5ml，另兩組則仍用IMDM培養(yǎng)液5ml，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。照射組和紫杉醇+照射組用直線加速器照射6Gy。照射后立即收集各組培養(yǎng)細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)排除法計(jì)算細(xì)胞活力。將105個(gè)活細(xì)胞接種于25cm2培養(yǎng)瓶，加入不含紫杉醇的培養(yǎng)液。照射后每日每組抽取3瓶細(xì)胞，活細(xì)胞計(jì)數(shù)，求平均值，至照射后第5天結(jié)束實(shí)驗(yàn)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。(2)生存分析：培養(yǎng)細(xì)胞分組同上。紫杉醇組和紫杉醇+照射組分別加入含有1nmol、10nmol、100nmol、1000nmol紫杉醇的培養(yǎng)基5ml，對(duì)照組和照射組則仍用IMDM培

10、養(yǎng)液5ml，培養(yǎng)24小時(shí)。單純照射組和紫杉醇+照射組用直線加速器分別照射2、4、6、8、10Gy。照射后立即收集各組培養(yǎng)細(xì)胞，在帶格的6cm平皿中接種活細(xì)胞(接種細(xì)胞數(shù)目要使形成的集落數(shù)達(dá)到100200個(gè))，培養(yǎng)14天，細(xì)胞固定、染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)含有50個(gè)細(xì)胞的集落，計(jì)算細(xì)胞存活率(SF)SF=(處理組集落形成數(shù)接種細(xì)胞數(shù))/(對(duì)照組集落形成數(shù)接種細(xì)胞數(shù))每組3皿，實(shí)驗(yàn)兩次，結(jié)果取平均值，繪制放射生存曲線；由生存曲線計(jì)算出紫杉醇+照射組在10%存活率水平時(shí)的放射增敏比(SER)。結(jié)果一、流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期分析(見附表)附表BT325細(xì)胞暴露于紫杉醇后的細(xì)胞周期時(shí)相分布時(shí)間(h)紫杉醇(nmo

11、l)細(xì)胞周期時(shí)相(%)G1SG2-M0054301661522919104626281003730321000462925121473221102837351001835471000551629241175033101413731001098110001723604812841311012107810061183100063163721313237101417691001612721000529661經(jīng)紫杉醇及照射處理后的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線2BT325細(xì)胞經(jīng)不同濃度紫杉醇處理后的放射生存曲線A.相對(duì)于對(duì)照組的生存曲線B.相對(duì)于紫杉醇組的生存曲線二、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)1. 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見1。2. 生存分

12、析：經(jīng)紫杉醇和(或)照射處理的細(xì)胞存活率見2。1000nmol紫杉醇+照射組的集落形成數(shù)過少，無法計(jì)算細(xì)胞存活率，由2B可以測(cè)得在10%細(xì)胞存活率水平上，1nmol、10nmol、100nmol紫杉醇的SER分別為1.1、1.9、3.0。 討論一、紫杉醇放射增敏的機(jī)理細(xì)胞動(dòng)力學(xué)研究表明：增殖細(xì)胞大多數(shù)處于G1-S期，而這兩個(gè)時(shí)相的細(xì)胞恰恰具有抗放射線性質(zhì)（2，5）。因此，促使其腫瘤G1-S期細(xì)胞進(jìn)入并停留在對(duì)放射線敏感的G2-M期，是提高腫瘤放射敏感性、改善療效的一個(gè)重要途徑（2，3，6）。在細(xì)胞增殖周期中，紫杉醇與微管亞單位中的微管蛋白牢固結(jié)合，促進(jìn)微管聚合，抑制著絲點(diǎn)微管解聚，從而阻止染色

13、體的移動(dòng)及去極化，使細(xì)胞阻滯在晚G2-M期（7），這可能是紫杉醇增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞放射效應(yīng)的重要機(jī)理之一。本實(shí)驗(yàn)對(duì)BT-325細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析，證實(shí)紫杉醇具有很強(qiáng)的G2-M期阻滯作用，G2-M期細(xì)胞比率最高可達(dá)83%。二、紫杉醇的時(shí)間、濃度依賴效應(yīng)如何應(yīng)用紫杉醇以獲得最佳的增敏作用，是臨床上的一個(gè)重要問題。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紫杉醇的G2-M期阻滯作用呈時(shí)間依賴性。紫杉醇作用2472小時(shí)的G2-M期細(xì)胞組分明顯高于藥物作用612小時(shí)者，但作用時(shí)間24、48、72小時(shí)之間效應(yīng)相差較小。我們認(rèn)為，藥物作用時(shí)間接近一個(gè)細(xì)胞增殖周期(Tc)，即可獲得較高的G2-M期效應(yīng)。因此，臨床上腫瘤的每次照射時(shí)間點(diǎn)最好

14、選定在紫杉醇作用約一個(gè)Tc后。人類腫瘤的Tc一般為數(shù)十小時(shí)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明：在確定的藥物作用時(shí)間內(nèi)，紫杉醇濃度較高時(shí)，G2-M期細(xì)胞組分亦較大。但1000nmol時(shí)的G2-M期細(xì)胞組分低于10nmol和100nmol時(shí)的組分。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道（8）及我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是，過高濃度的紫杉醇可阻滯細(xì)胞于G1-S期或直接導(dǎo)致部分G2-M期細(xì)胞死亡。三、紫杉醇增敏放射的生物學(xué)效應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)顯示：?jiǎn)渭冋丈鋾r(shí)BT325瘤細(xì)胞具有一定的抗放射性；紫杉醇和放射合用可獲得協(xié)同作用，對(duì)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系BT325的抑制和殺死作用明顯優(yōu)于單純照射或單用紫杉醇；隨著合用紫杉醇濃度的增大，

15、細(xì)胞存活率明顯降低。在10%細(xì)胞存活率水平時(shí)，紫杉醇的SER很高，表明紫杉醇的放射增敏效應(yīng)顯著，提示值得進(jìn)一步研究。作者單位：100037北京，海軍總醫(yī)院神經(jīng)外科(修波、劉宗惠)；軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院(段國升、薛毅瓏)參考文獻(xiàn)1Prados MD, Wilsn CG. Neoplasms of the central nervous system. In: Holland JF, et al. eds. Cancer medicine. Philadelphia:Lea & febiger, 1993:1091-1094.2谷銑之，殷蔚伯，劉泰福,等主編.腫瘤放射治療學(xué).北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國

16、協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社.1993:242-256,280-285.3修波.惡性腦瘤增敏放療進(jìn)展.國外醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)分冊(cè)，1992:19(增刊)：91-93.4邵文釗.人腦多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系BT325.細(xì)胞生物學(xué)雜志，1985，7：92.5范朗娣，王開偉，張惹英，等.流式細(xì)胞儀對(duì)星形細(xì)胞腫瘤的評(píng)價(jià).中國腫瘤臨床，1994，21：90-92.6Rubin LL, Philpott KL, Brooks SF. The cell cycle and cell death. Curr Biol, 1993, 3:391-394.7Foa R, Norton L, Seidman AD. Taxol (paclitaxel): a novel investigational antimicrotubule agen