一代測(cè)序規(guī)范操作規(guī)范

1、PCR 產(chǎn)物測(cè)序?qū)嶒?yàn)操作流程實(shí)驗(yàn)試劑和耗材準(zhǔn)備（一）實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑主要用途核酸提取試劑盒主要用于DNA或RNA的提?。ㄔ敿?xì) 步驟參考相應(yīng)說明書）上、下游引物PCR或測(cè)序反應(yīng)Extender PCR-to-Gel Master Mix, 2XPCRddH2OPCR、測(cè)序反應(yīng)及其它用途核酸熒光染料（4s Green）瓊脂糖凝膠電泳DNA Marker瓊脂糖凝膠電泳TBE電泳緩沖液瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖瓊脂糖凝膠電泳核酸外切酶1 （Exo I）PCR產(chǎn)物的純化堿性磷酸酶（ALP）PCR產(chǎn)物的純化經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物測(cè)序反應(yīng)BigDye v3.1測(cè)序反應(yīng)100%酒精測(cè)序產(chǎn)物純化125mM EDTA (

2、PH=8)測(cè)序產(chǎn)物純化70%酒精測(cè)序產(chǎn)物純化POP7 膠上機(jī)測(cè)序過程（毛細(xì)管電泳）Hi-Di甲酰胺上機(jī)測(cè)序過程（毛細(xì)管電泳）毛細(xì)管電泳Buffer上機(jī)測(cè)序過程（毛細(xì)管電泳）Seque nee Sta ndar(3500)測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)品邙陽性對(duì)照）（二）、實(shí)驗(yàn)耗材實(shí)驗(yàn)耗材主要用途1.5ml EP 管各種試劑的分裝、盛放、儲(chǔ)存等1.5mlEP管支架1.5ml或2mlEP管的支撐或存放0.2mlPCR 管PCR八連管及八連管蓋PCR96孔板PCR、測(cè)序反應(yīng)及上機(jī)測(cè)序各種規(guī)格微量移液器微量試劑的定量和移取各種規(guī)格移液器吸頭配合移液器的使用（吸附試劑）96孔板支架固定和支撐96孔板、八連管以及PCR單管96

3、孔板圭寸墊封板用封板滾輪封板用冰維持待反應(yīng)試劑低溫環(huán)境各種規(guī)格量筒溶液的稀釋或試劑的配置錐形瓶瓊脂糖凝膠的熔化容量瓶溶液的稀釋與試劑的配置藥匙和稱量紙?jiān)噭┑姆Q量凝膠槽和凝膠梳瓊脂糖凝膠的凝固和加樣孔的形成計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)記號(hào)筆做各種記號(hào)或標(biāo)記一次性手套防污染和保護(hù)作用鋁箔封 96孔板二、實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器主要用途制冰機(jī)制冰電冰箱試劑的儲(chǔ)存高速臺(tái)式離心機(jī)試劑的離心Mini式離心機(jī)瞬離試劑旋渦式混合振蕩器混勻試劑電子分析天平試劑的稱量核酸檢測(cè)儀核酸純度和濃度的檢測(cè)PCR儀PCR電泳儀和水平電泳槽瓊脂糖凝膠電泳凝膠成像儀核酸瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)和分析基因分析儀DNA的測(cè)序或片段分析蒸汽式高壓濕熱消毒器試劑、

4、實(shí)驗(yàn)耗材及用具的消毒電熱鼓風(fēng)干燥箱實(shí)驗(yàn)用品的干燥恒溫水浴鍋提供恒溫環(huán)境三、實(shí)驗(yàn)操作具體步驟（一）核酸的提取按照DNA或RNA提取試劑盒操作（具體操作步驟參考試劑盒操作說明書），如是RNA需進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄為cDNA O -20 C保存?zhèn)溆?。（二）測(cè)序PCR模板的制備（1）、預(yù)先制備適量冰(2) 、在冰上融化模板 DNA、引物以及 Extender PCR-to-Gel Master Mix（3）、按照以下反應(yīng)體系進(jìn)行 PCR并保持反應(yīng)體系在冰上成分體積（20 J體系）終濃度Exte nder P CR-to-GelMaster Mix, 2X10 J1 X10pM上游引物0.5-2 J0.25-1

5、 JM10pM下游引物0.5-2 J0.25-1 JM50ng/ J的模板0.1-1 J5-5 0ngddH2O根據(jù)需要（4）將反應(yīng)體系放入PCR儀，執(zhí)行以下反應(yīng)程序95C 5min(95C 30sec , 67C 30sec -0.5 C/循環(huán)，72C 1min ) x14 循環(huán)f(95C 30sec , 57C 30sec , 72C 1min ) x 30 循環(huán) f 72C 7min f 4C Forever(5) 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：量取適量1X TBE緩沖液并稱取一定量瓊脂粉溶于其中制成1%-2%勺瓊脂糖凝膠，在微波爐上加熱溶化，待溫度降至 60C -70 C左右加入熒光染料，溫度降

6、至40C -50 C左右將瓊脂粉溶液倒入插有梳子的凝膠槽中冷卻，待凝膠完全凝固備用。將凝膠置于水平電泳槽中，取少量PCF產(chǎn)物上樣電泳，將電泳好的樣品置于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè)和分析。(6) 將檢測(cè)合格的PCF產(chǎn)物用酶解法進(jìn)行純化。根據(jù)核酸外切酶I (Exo I)，堿性磷酸酶(AIP)的作用濃度，加入到PCR反應(yīng)產(chǎn)物中，37C消化15min, 85C使酶失活 15min。純化體系如下:PCR產(chǎn)物5dExo I0.5 d堿性磷酸酶1d(三) 、純化后的PCR產(chǎn)物的測(cè)序反應(yīng)1、純化后的PCR產(chǎn)物按照1:31:6稀釋(若瓊脂糖凝膠電泳條帶非常亮，可以適當(dāng)增大稀釋倍數(shù))2、測(cè)序反應(yīng)用引物稀釋到1側(cè)(1)

7、 PCR產(chǎn)物測(cè)序反應(yīng)體系(10 d):成分加入量純化并稀釋好的PCR產(chǎn)物1 d (也可參考下表)引物(上游或者下游)1 dM1 dBigDye(2.5x) 10 倍稀釋8d總體積10dPCR產(chǎn)物測(cè)序體系中PCR產(chǎn)物的加入量如下表:DNA 純度：OD26o/OD28o=1.61.8; DNA 含量(ng/ d) =OD260X50PCR產(chǎn)物片段大小加入量100-200b p1-3 ng200-500b p3-10 ng500-1000bp5-2 Ong1000-2000bp10-40 ng2000bp以上20-5 OngBigDye (2.5x)稀釋10倍配方:成分加入量BigDye (2.5x

8、)50ulSeq Buffer225ulddH20725ul(2)測(cè)序PCR循環(huán)條件:般測(cè)序:96 C 1 min(96 C 10 sec T 50 C 5 sec 60循環(huán)旳)n) x 25 4 保溫 大分子測(cè)序:95 C 5 min (96 C 30 sec -T5 50 C 10 sec t 60 C 4 m循環(huán)T0 4 保溫(三) 測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物純化(酒精/ EDTA法)： 1、96孔板純化方法:(1)每管加入2.5卩L 125 mM EDTA(pH=8)，加到管底;(2)加入30卩L 100%酒精，封嚴(yán)，震蕩4次，室溫放置15 min;20C最大轉(zhuǎn)速離心45min，馬上倒置96孔板，倒

9、置最小轉(zhuǎn)速離心10s;(3)加入60卩L 70%酒精，最大轉(zhuǎn)速4 離心15 min,馬上倒置96孔板， 最小 轉(zhuǎn)速離心1 min ;(4) 70%酒精重復(fù)洗滌1次或2次;(5)讓殘余的酒精在室溫?fù)]發(fā)干，加入 10卩L HOi甲酰胺，95 變性4 min,迅速置冰上4 min，上樣電泳。2、單個(gè)0.2 mL離心管離心方法:(1)每孔加入2.5卩L 125mM EDTA到溶液中，再加入30卩L 100%酉精，蓋好，震蕩4 次，室溫 15 min。(2)臺(tái)式離心機(jī)12000 x g離心30 min，馬上用槍吸盡上清液。(3)每孔加入60卩L 70%酒精，12000 x g 4C離心15 min，馬上

10、用槍吸盡上清液。此步可以重復(fù) 1 次。(4)讓酒精在室溫?fù)]發(fā)干凈，加入 10卩L HDi Formamide溶解DNA。(5)在PCR儀上變性：95 4 min, 4 4 min。上機(jī)電泳。一般常見的純化方式有三種：(1) 酒精/EDTA沉淀法：利用EDTA螯合定序反應(yīng)中的Mg2+離子，再加入酒精，經(jīng)離心后使 定序產(chǎn)物小片段沉淀,游離的熒光物質(zhì)則懸浮于上清液中,小心地將上清液除去,再經(jīng)過一次的 酒精清洗沉淀物，則可以完全去除游離的熒光物質(zhì)。此法的優(yōu)點(diǎn)是可以將游離的熒光物質(zhì)去除的 非常干凈，幾乎完全沒有背景值會(huì)影響序列判讀，然而，其缺點(diǎn)是無法保留小分子量的片段，約第 20 個(gè)堿基開始才可以被讀取出來。(2) 酒精/EDTA/醋酸鈉沉淀法：利用EDTA螯合定序反應(yīng)中的Mg2+離子，再依序加入醋酸鈉 (幫助沉淀)、酒精，經(jīng)離心后使定序產(chǎn)物小片段沉淀，游離的熒光物質(zhì)則懸浮于上清液中，小心地將上清液除去，再經(jīng)過一次的酒精清洗沉淀物，則可以去除游離的熒光物質(zhì)。此法的優(yōu)點(diǎn)是 可以保留住極小分子量的片段，使第一個(gè)堿基就可以被讀取出來，然而，其缺點(diǎn)是無法完全去除 游離的熒光物質(zhì)，會(huì)有較高的背景值影響序列判讀。