免疫沉淀IP免疫共沉淀coIP染色體免疫沉淀ChIP

1、樓上說(shuō)的準(zhǔn)確的叫。就是免疫沉淀，沒(méi)有“共” ，哈哈。 其實(shí)樓主的 意思是既然有 2 2 的抗體，直接檢測(cè) ,就可以了， 為什么還要用以后 的樣品來(lái)檢測(cè)，這是因?yàn)?2 商業(yè)化的抗體特異性不好， 可能對(duì)或其他 類似的磷酸化蛋白有交叉， 所以我們一般為了準(zhǔn)確性， 看其磷酸化的 變化，就先單獨(dú)把這個(gè)蛋白免疫沉淀出來(lái)，在用 4G10 抗體來(lái)檢測(cè)。而且這個(gè)方法看的是 2 蛋白全部的磷酸化位點(diǎn)的情況，而 2 商業(yè)化 抗體一般都是識(shí)別某一格磷酸化位點(diǎn)的， 所以這兩種試驗(yàn)是有本質(zhì)區(qū) 別的，這種方法還應(yīng)用于很多 磷酸化的檢測(cè)， 因?yàn)檫@些蛋白磷酸化 位點(diǎn)都特別多哈： ）免疫沉淀是指用抗體把抗原（包括單體、復(fù)合物）沉

2、淀下來(lái) ，是一 種抗原純化、濃集的方法；免疫共沉淀 指用抗體把抗原復(fù)合物沉淀 下來(lái)，常用來(lái)研究蛋白質(zhì)的相互作用免疫沉淀（ , ）免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法。 抗體 與細(xì)胞裂解液或表達(dá)上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后，再與蛋白（）或二抗 偶聯(lián)的或珠子孵育，通過(guò)離心得到珠子 -蛋白或二抗 -抗體 -目的蛋白復(fù)合物，沉淀經(jīng)過(guò)洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸 5-10 ，在 高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包 括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。基本實(shí)驗(yàn)步驟1 ）收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑） ，冰上 或者4 C裂解30, 12,000g

3、離心30后取上清;（2）取少量裂解液以備 分析，剩余裂解液將1 gg相應(yīng)的抗體和 10-50 gI 加入到細(xì)胞裂解液， 4°C 緩慢搖晃孵育過(guò)夜;3）免疫沉淀反應(yīng)后，在 4°C 以 3,000 g 速度離心 5 ,將 離心至 管底;將上清小心吸去， 用 1 裂解緩沖液洗 3-4 次;最后加入 15gI的2 X加樣緩沖液，沸水煮10分鐘;4 ）, 或進(jìn)行質(zhì)譜分析。樣品處理：免疫沉淀實(shí)驗(yàn)成功與否， 第一步處理樣品非常關(guān)鍵。 免疫沉淀實(shí)驗(yàn)本 質(zhì)上是處于天然構(gòu)象狀態(tài)的抗原和抗體之間的反應(yīng)， 而樣品處理的質(zhì) 量決定了抗原抗體反應(yīng)中的抗原的質(zhì)量， 濃度以及抗原是否處于天然 構(gòu)象狀態(tài)。所

4、以制備高質(zhì)量的樣品以用于后續(xù)的抗體 孵育對(duì)免疫沉 淀實(shí)驗(yàn)是否成功非常關(guān)鍵。 在這個(gè)環(huán)節(jié)中， 除了要控制所有操作盡量 在冰上或者 4°完成外，最為關(guān)鍵的是裂解液的成份。用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的樣品一般是原代培養(yǎng)細(xì)胞裂解液或者細(xì)胞系裂 解液。我們以常用的裂解液為例（主要含有 7.4 左右的離子緩沖液， 接近生理濃度下的 ,一定比例的去垢劑和甘油以及各類蛋白酶抑制劑等）來(lái)說(shuō)明其各主要成份的用途， 進(jìn)而幫助我們?nèi)绾吾槍?duì)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮筒煌牡鞍踪|(zhì)特性來(lái)選擇最佳的裂解液。a. 緩沖液：離子緩沖液常采用 7.4 的或者。b. 濃度一般習(xí)慣用 150 , 這主要是因?yàn)?150 接近生理濃度，不會(huì)破壞蛋白

5、質(zhì)之間的相互作用。然而細(xì)胞內(nèi)部的濃度并不是均一的， 局部的濃度可以低到 50 ,150 的有可能會(huì)破壞這個(gè)區(qū)域的蛋白質(zhì)相互作 用。因此裂解液配方最佳的濃度要視所分析的蛋白的亞細(xì)胞定位而定。c. 甘油由于其粘性，可以對(duì)蛋白質(zhì)之間的相互作用起到一個(gè)很好的 保護(hù)作用。一般添加 10% 的甘油有助于穩(wěn)定蛋白質(zhì)之間的相互作用。d. 裂解液中的去垢劑可以裂解細(xì)胞質(zhì)膜，也同時(shí)破壞了許多細(xì)胞器 的膜，從而釋放了其中儲(chǔ)存的許多蛋白酶。 而由于用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn) 的去垢劑作用比較溫和， 因此蛋白酶的活性大部分得以保存。 還有一 部分蛋白酶來(lái)自胞質(zhì)中， 主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制環(huán)境受 到改變后從而恢復(fù)了蛋白酶

6、活性。 因此，添加蛋白酶抑制劑對(duì)于防止 目的蛋白的降解從而完成免疫沉淀實(shí)驗(yàn)非常關(guān)鍵。 一般主要通過(guò)添加 抑制金屬蛋白酶，通過(guò) （多種蛋白酶抑制劑混合物）可以抑制蛋白 酶。e. 去垢劑對(duì)于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)尤其是免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)是一個(gè)非常關(guān)鍵 的因素。不同的去垢劑種類和不同的去垢劑濃度主要通過(guò)影響以下三 個(gè)因素來(lái)影響免疫沉淀效果：- 細(xì)胞質(zhì)/ 器膜的通透性：因?yàn)樵S多目的蛋白都定位在細(xì)胞器中，所 以必須先將這些蛋白釋放出來(lái)，抗體才能與之反應(yīng)。- 膜蛋白的釋放：許多膜蛋白的構(gòu)象對(duì)去垢劑種類和濃度非常敏感，因此針對(duì)這類蛋白的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)， 需要謹(jǐn)慎地嘗試多種去垢劑以及 不同濃度。- 蛋白相互作用： 不同去垢劑

7、對(duì)不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)的相互作用影響程 度不一樣，需要根據(jù)具體蛋白的特性進(jìn)行分析選擇去垢劑種類和濃度。而由于何種去垢劑適應(yīng)作用于何種蛋白質(zhì)現(xiàn)在很難精準(zhǔn)預(yù)測(cè)， 所以一 個(gè)更為切實(shí)可行的辦法就是通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)篩選合適的去垢劑種類和 濃度?？贵w 孵育裂解細(xì)胞，離心并去除不可溶的膜組份后，上清可以儲(chǔ)存在 -80 °保 存 3 個(gè)月，但最好能夠使用新鮮制備的細(xì)胞裂解液上清去進(jìn)行抗體 孵育實(shí)驗(yàn)?？贵w可以先加入上清中與樣品孵育數(shù)小時(shí)后再加入 A 或 者 G 孵育過(guò)夜，也可以同時(shí)加入抗體和 A 或者 G 孵育過(guò)夜。一般 選擇 1 總蛋白（ 1 ）對(duì)應(yīng)添加 1 抗體，最高可以添加至 5 抗體，過(guò) 多的抗體會(huì)

8、產(chǎn)生假陽(yáng)性。 這個(gè)步驟中關(guān)鍵因素在于選擇合適的陰性對(duì) 照。一般選用加同樣量的 ,但更為妥當(dāng)?shù)姆椒ㄊ沁x擇針對(duì)胞內(nèi)其它無(wú)關(guān)目的蛋白的一抗做對(duì)照。例如，做膜蛋白 A 的免疫沉淀，選擇膜 蛋白 B 來(lái)做陰性對(duì)照，只要確認(rèn)二者之間沒(méi)有相互作用；而做胞質(zhì) 可溶性蛋白 C 的免疫沉淀，則選擇另外一個(gè)可溶性蛋白 D 來(lái)做陰性 對(duì)照。同時(shí)，為避免 A或者G有（非）特異性吸附從而造成免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性，一般在加入目的蛋白抗體之前，預(yù)先將 A 或 者 G 與細(xì)胞裂解液孵育數(shù)小時(shí)，然后取上清用于后續(xù)的抗體 孵育。同時(shí)， A 或者 G 對(duì)不同類型的抗體親和力不同， 結(jié)合一抗的種屬和 亞型，選擇合適的 A 或者 G

9、 也是決定免疫沉淀實(shí)驗(yàn)成功與否的一個(gè) 重要因素。一般推薦使用 A 和 G 的混合物，這樣可以達(dá)到最佳實(shí) 驗(yàn)效果，而且省去了許多選擇的煩惱?？贵w 復(fù)合物洗滌：除了選擇特異性好的抗體以及選擇合適的陰性對(duì)照外， 去除免疫沉淀 實(shí)驗(yàn)非特異性的一個(gè)辦法是對(duì)抗體 復(fù)合物進(jìn)行多次洗滌。一般洗滌 緩沖液使用和裂解液一樣的配方， 但去除甘油， 以減少由于甘油的粘 性帶來(lái)的非特異性吸附。 針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)要求， 還可以通過(guò)更改的濃 度以及去垢劑的比例，種類來(lái)達(dá)到去除非特異性吸附的效果。例如， 針對(duì)單純的免疫沉淀而非免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)或者雖然是進(jìn)行免疫共沉 淀實(shí)驗(yàn)，但蛋白質(zhì)之間的結(jié)合比較牢靠，可以考慮使用低濃度0.2-0

10、.5% ）的洗滌抗體 復(fù)合物， 這樣可以去除絕大部分非特異性相互作用。四、鑒定免疫沉淀實(shí)驗(yàn)用途非常廣泛（見(jiàn) : ），而且基于最基本的免疫沉淀實(shí) 驗(yàn)衍生出了許多免疫沉淀相關(guān)實(shí)驗(yàn)手段 （比如免疫共沉淀， 染色質(zhì)免 疫沉淀和蛋白免疫沉淀） ，因此，免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的鑒定方法主要視實(shí) 驗(yàn)?zāi)康亩?。我們?cè)诒臼謨?cè)中主要簡(jiǎn)單概述常見(jiàn)的免疫沉淀之后的檢測(cè)需要注意的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)。由于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)使用目的蛋白抗體加 與樣品孵育， 因此在最后離心獲得抗體 復(fù)合物后，管中主要含有抗體， 目的蛋白， 以及一些其它非特異性作用蛋白。 其中，抗體和目的蛋白以及 三者 之間是以非共價(jià)健結(jié)合在一起， 只有 與 是共價(jià)結(jié)合在一起的。 因

11、此， 最后經(jīng)過(guò)添加含巰基乙醇的加樣緩沖液以及煮沸變性并離心出去 后，管只有抗體和目的蛋白以及少量非特異性吸附蛋白。 這樣中就含 有目的蛋白和抗體二種蛋白， 由于加樣緩沖液中含有巰基乙醇從而導(dǎo) 致抗體的重鏈與輕鏈之間的二硫鍵被破壞從而使得抗體分子變成重 鏈分子（ 55 ）和輕鏈分子（ 25 ）。因此，顯色反應(yīng)中除了能檢測(cè)到目 的蛋白外，如果所使用的二抗與用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的抗體分子屬于同 一種屬的話， 還能檢測(cè)到重鏈和輕鏈分子。 通常用于免疫沉淀的抗體 量非常大 （1），所以當(dāng)目的蛋白的大小接近重鏈或者輕鏈分子時(shí)， 重 鏈或者輕鏈分子的信號(hào)常常由于信號(hào)過(guò)強(qiáng)而導(dǎo)致影響對(duì)目的蛋白的 結(jié)果判斷。針對(duì)上述

12、情況，通常有二種解決辦法：a. 選擇不同種屬的抗體分別進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)，這樣再選擇 一個(gè)種屬交叉反應(yīng)比較弱或者無(wú)種屬交叉反應(yīng)的二抗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)， 就可 以大大減弱重鏈和輕鏈分子的信號(hào)。b. 使用交聯(lián)劑將抗體和 交聯(lián)，然后通過(guò)添加不含巰基乙醇的加樣 緩沖液處理目的蛋白 - 抗體 復(fù)合物，最后離心去除抗體 復(fù)合物，上 清中只留下目的蛋白。免疫共沉淀（ , ）是利用抗原和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌的A或G特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的片段的現(xiàn)象開(kāi)發(fā)出來(lái)的方法。 其基本原理是， 在細(xì)胞裂 解液中加入抗興趣蛋白的抗體， 孵育后再加入與抗體特異結(jié)合的結(jié)合 于珠上的A或G,若細(xì)胞中有與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就

13、可以形成這樣一種復(fù)合物： “目的蛋白興趣蛋白抗興趣蛋白抗體A或 G ”，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，復(fù)合物又被分開(kāi)。然后經(jīng)免疫 印跡或質(zhì)譜檢測(cè)目的蛋白。 這種方法得到的目的蛋白是在細(xì)胞內(nèi)與興 趣蛋白天然結(jié)合的，符合體內(nèi)實(shí)際情況，得到的結(jié)果可信度高。這種 方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合； 也可用于確定一種 特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。免疫共沉淀優(yōu)點(diǎn)1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)； 2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物免疫共沉淀缺點(diǎn)1）可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用；2）兩種蛋白質(zhì)的

14、結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；3 ）必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么， 以選擇最后檢測(cè)的抗體，所以，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性。原理：免疫共沉淀（）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ) 的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。 是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件 下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被 保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì) X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。目前多用精制的 A預(yù)先結(jié)合固化在的上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，上的 A 就能吸附抗原

15、達(dá)到精制的目的。 這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié) 合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。其優(yōu)點(diǎn)為：（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的， 可以避免人 為的影響；（3 ）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。 缺點(diǎn) 為：（1 ）可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用；2 ）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間 起橋梁作用； （3）必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后 檢測(cè)的抗體，所以，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具 有冒險(xiǎn)性。二、準(zhǔn)備工作：預(yù)冷， ，細(xì)胞刮子（用保鮮

16、膜包好后，埋冰下） ，離心機(jī)1. 用預(yù)冷的洗滌細(xì)胞兩次，最后一次吸干；2. 加入預(yù)冷的 （1107 個(gè)細(xì)胞、 10 培養(yǎng)皿或 1502 培養(yǎng)瓶， 0.55X 106個(gè)細(xì)胞、6培養(yǎng)皿、752培養(yǎng)瓶）3. 用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下, 把懸液轉(zhuǎn)到1.5管中，4 C,緩慢晃動(dòng)15 （管插冰上，置水平搖床上）4. 4 C, 14000g離心15 ,立即將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中5. 準(zhǔn)備 A ,用 洗兩遍珠子,然后用配制成 50% 濃度,建議減掉 槍尖部分,避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠6.每1總蛋白中加入100 kJ A瓊脂糖珠（50% ）,4 C搖晃10 （管 插冰上,

17、置水平搖床上） ,以去除非特異性雜蛋白,降低背景7. 4 C, 14000g 離心 15 ,將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中,去除A 珠子8. （ 法 ）做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線, 測(cè)定蛋白濃度,測(cè)前將總蛋白至少稀釋 1 ：10 倍以上,以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響（定量,分裝后,可 以在-20 C保存一個(gè)月）9.用將總蛋白稀釋到約1 k h以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細(xì)胞中含量較低，則總蛋白濃度應(yīng)該稍高（如10卩k）10.加入一定體積的兔抗到500 kl總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異11. 4 C緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用

18、 2 h 室溫孵育12.加入100 kl A瓊脂糖珠來(lái)捕捉抗原抗體復(fù)合物，4 C緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫1h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議 加2 kJ"過(guò)渡抗體"（兔抗鼠，兔抗雞）13. 14000 瞬時(shí)離心 5s ,收集瓊脂糖珠 -抗原抗體復(fù)合物,去上清,用預(yù)冷的 洗3遍，800卩遍，有時(shí)候會(huì)破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合 物內(nèi)部的結(jié)合，可以使用14.用60 M 2 X上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60訕足夠上三道）15. 將上樣樣品煮 5 ，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電 泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也

19、可以暫時(shí)凍-20 C,留待以后電泳,電泳前應(yīng)再次煮 5 變性。配制：基礎(chǔ)成分：緩沖液成分，防止蛋白變性）鹽份，防止非特異蛋白聚集）40 （非離子去污劑，提取蛋白；用 H2O 配制成 10% 儲(chǔ)存液）去氧膽酸鈉（離子去污劑， 提取蛋白；用 H2O 配制成 10% 儲(chǔ)存液； 避光保存）注意：準(zhǔn)備激酶（致活酶）實(shí)驗(yàn)時(shí)，不要加去氧膽酸鈉，因?yàn)殡x子 型去污劑能夠使酶變性，導(dǎo)致活性喪失。蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（）（用異丙醇配制成 200 的儲(chǔ)存液，室溫保存）鈣螯合劑；用 H2O 配制成 100 的儲(chǔ)存液， 7.4）亮抑酶肽（）（用H2O配制成1的儲(chǔ)存液，分裝，-20 C保存）抑蛋白酶肽（）（用H2O配制

20、成1的儲(chǔ)存液，分裝，-20 C保存）胃蛋白酶抑制劑（）（用甲醇配制成1的儲(chǔ)存液，分裝,-20 C保存）磷酸（酯）酶抑制劑激活的 34（用 H2O 配制成 200 的儲(chǔ)存液，見(jiàn) ）200 的儲(chǔ)存液，室溫保存）注意：在準(zhǔn)備做磷酸（酯）酶實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，不加磷酸酯酶抑制劑工作液配制：配制 100 的直到1. 稱取 790 的，加到 75 去離子水中，加入 900 的，攪拌， 全部溶解，用調(diào)節(jié)值到 7.42. 加 1010% 的 403. 加 2.510% 的去氧膽酸鈉，攪拌，直到溶液澄清4.加1100的，用量筒定容到100 , 2-8 C保存5. 理論上， 蛋白酶和磷酸酯酶抑制劑應(yīng)該在使用當(dāng)天同時(shí)加入

21、蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制劑各100山,34,各500但是在水溶液中很不穩(wěn)定， 30 分鐘就會(huì)降解一半，所以應(yīng)該在使用前現(xiàn)加，其他抑制劑成分可以在水溶液中穩(wěn)定5 天。各種成分在工作液中的終濃度：* : 50 ,7.4 * 40: 1% * 去氧膽酸鈉： 0.25%* : 150* 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽 , 胃蛋白酶抑制劑 : 各 1 d * 34: 1三、實(shí)驗(yàn)流程為：1) 轉(zhuǎn)染后 24-48 h 可收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液含蛋白酶抑制劑)，冰上裂解 30, 細(xì)胞裂解液于 4 °C， 最大轉(zhuǎn)速 離心 30 后取上清；(2) 取少量裂解液以備 分析，剩余裂解液加1相應(yīng)的抗體

22、加入到細(xì)胞裂解液， 4°C 緩慢搖晃孵育過(guò)夜；(3) 取10 M A瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3次，每次3,000 離心 3 ；(4) 將預(yù)處理過(guò)的10 d A瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過(guò)夜的細(xì)胞裂解液中 4°C 緩慢搖晃孵育 2-4h ，使抗體與 A 瓊脂糖珠偶 連；5)免疫沉淀反應(yīng)后，在 4°C 以 3,000 速度離心 3 ，將瓊脂糖珠離心至管底； 將上清小心吸去， 瓊脂糖珠用 1 裂解緩沖液洗3 4次；最后加入15 d的2 X上樣緩沖液，沸水煮5分鐘;6 ）, 或質(zhì)譜儀分析。通過(guò)免疫共沉淀確定結(jié)合蛋白1 用磷酸鹽緩沖液洗 30 塊 10 培養(yǎng)板上的適宜細(xì)胞

23、。刮去每塊板 上的細(xì)胞到 1 冰冷的裂解緩沖液中。2.將每毫升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中， 在微量離心機(jī)上4 C以最大速度離心15 。3收集上清（約30 ）并加入30的適當(dāng)抗體，4 C搖動(dòng)免疫沉淀物 1 h 。4加入 0.9的蛋白質(zhì) 懸液，4 C搖動(dòng)免疫沉淀物30。5 用含 900的洗蛋白混合物， 再重復(fù)洗 5 次。最后，用洗一次。6 .吸出混合物的液體部分。加入 800 M的1 X膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸 4 。7將樣品加入到大孔的不連續(xù)梯度膠中， 在 10 的恒定電流下電泳 過(guò)夜。8通過(guò)考馬斯藍(lán)染色觀察蛋白質(zhì)泳帶。9 從膠上切下目標(biāo)帶，將其放到微量離心管中，用 1 50% 乙腈洗10 用

24、胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì)，再將肽電洗脫。11 通過(guò)窄孔高效液相色譜分離肽。 將收集的肽在 477A 或 494A機(jī)器上進(jìn)行自動(dòng)降解測(cè)序。四、注意的問(wèn)題：1 ）細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件， 不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑( 40 或 100) 。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的， 通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。 不能用高濃度的變 性劑( 0.2 )，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的2) 使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用3) 使用對(duì)照抗體：?jiǎn)慰寺】贵w：正常小鼠的或另一類單抗 兔多克隆抗體：正常兔 在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中要保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：八、(1) 確保

25、共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生；(2) 要確?？贵w的特異性，即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會(huì)引起共沉淀；(3) 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來(lái)確定。染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（）真核生物的基因組以染色質(zhì)的形式存在。 因此，研究蛋白質(zhì)與在 染色質(zhì)環(huán)境下的相互作用是闡明真核生物基因表達(dá)機(jī)制的基本途徑。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（ , ）是目前唯一研究體內(nèi)與蛋白質(zhì)相互作用 的方法。它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)復(fù)合物， 并將 其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，

26、然后通過(guò)免疫學(xué)方法 沉淀此復(fù)合體， 特異性地富集目的蛋白結(jié)合的片段， 通過(guò)對(duì)目的片斷 的純化與檢測(cè)， 從而獲得蛋白質(zhì)與相互作用的信息。 不僅可以檢測(cè)體 內(nèi)反式因子與的動(dòng)態(tài)作用， 還可以用來(lái)研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與 基因表達(dá)的關(guān)系。而且，與其他方法的結(jié)合，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍：與基因芯片相結(jié)合建立的方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通 量篩選；與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)； 用于研究在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。由此可見(jiàn)，隨著的進(jìn)一步完善， 它必將會(huì)在基因表達(dá)調(diào)控研究中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。染色體免疫共沉淀（ ，）是基于體內(nèi)分析發(fā)展起來(lái)的方法，也稱 結(jié)合位點(diǎn)分析法， 在過(guò)去十年已

27、經(jīng)成為表觀遺傳信息研究的主要方法。這項(xiàng)技術(shù)幫助研究者判斷在細(xì)胞核中基因組的某一特定位置會(huì)出現(xiàn) 何種組蛋白修飾。 不僅可以檢測(cè)體內(nèi)反式因子與的動(dòng)態(tài)作用， 還可以 用來(lái)研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。 近年來(lái)，這種技 術(shù)得到不斷的發(fā)展和完善。 采用結(jié)合微陣列技術(shù)在染色體基因表達(dá)調(diào) 控區(qū)域檢查染色體活性， 是深入分析癌癥、 心血管疾病以及中央神經(jīng) 系統(tǒng)紊亂等疾病的主要代謝通路的一種非常有效的工具。染色質(zhì)免疫共沉淀原理它的原理是在保持組蛋白和聯(lián)合的同時(shí)， 通過(guò)運(yùn)用對(duì)應(yīng)于一個(gè)特A ”特定組蛋白標(biāo)記的生物抗體，染色質(zhì)被切成很小的片斷，并沉淀下來(lái)。是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的

28、“ 異性地結(jié)合到免疫球蛋白的片段的現(xiàn)象活用開(kāi)發(fā)出來(lái)的方法。 目前多 用精制的 A 預(yù)先結(jié)合固化在的上，使之與含有抗原的溶液及抗體反 應(yīng)后，上的 A 就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。實(shí)驗(yàn)最需要注意點(diǎn)就 是抗體的性質(zhì)。 抗體不同和抗原結(jié)合能力也不同， 免染能結(jié)合未必能 用在反應(yīng)。建議仔細(xì)檢查抗體的說(shuō)明書。 特別是多抗的特異性是問(wèn)題。其次，要注意溶解抗原的緩沖液的性質(zhì)。 多數(shù)的抗原是細(xì)胞構(gòu)成的蛋 白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有 強(qiáng)界面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。另一面，如用弱界面活性劑溶解細(xì)胞，就不能充分溶解細(xì)胞蛋白。即 便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)

29、合的結(jié)果， 抗原決定族被封閉， 影響與 抗體的結(jié)合，即使成功，也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結(jié)果。 再次， 為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑， 低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每次實(shí)驗(yàn)之前，首先考慮抗體 / 緩沖液的比例?？?體過(guò)少就不能檢出抗原，過(guò)多則就不能沉降在上，殘存在上清。緩沖 劑太少則不能溶解抗原，過(guò)多則抗原被稀釋。的一般流程的一般流程：甲醛處理細(xì)胞收集細(xì)胞， 超聲破碎加入目的蛋白的抗體， 與靶蛋 白復(fù)合物相互結(jié)合加入，結(jié)合抗體 - 靶蛋白復(fù)合物，并沉淀對(duì)沉淀下 來(lái)的復(fù)合物進(jìn)行清洗， 除去一些非特異性結(jié)合洗脫， 得到富集的靶蛋 白復(fù)合物解交聯(lián)，純化富集的片斷分析。在分析這一塊

30、，比較傳統(tǒng)的做法是半定量。但是現(xiàn)在隨著熒光定 量的普及，大家也越來(lái)越傾向于了。 此外還有一些由衍生出來(lái)的方法。例如（其實(shí)就是用的方法研究細(xì)胞內(nèi)蛋白與的相互結(jié)合， 具體方法和 差不多，只是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要注意防止， 最后分析的時(shí)候需要先將逆轉(zhuǎn)錄成為）；還有（其實(shí)就是富集得到的片段，拿去做芯片分析，做法在的基礎(chǔ)上有所改變， 不同的公司有不同的做法，要根據(jù)公司的要求來(lái)準(zhǔn)備樣品）。具體操作流程：第一天：一）、細(xì)胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎。1、取出 1 平皿細(xì)胞（ 10 平皿），加入 243醛的終濃度為 1% （培養(yǎng)基共有 9）。2、37 攝氏度孵育 10 。3、終止交聯(lián)：加甘氨酸至終濃度為0.125M。 45

31、02.5M 甘氨酸于平皿中?；靹蚝?，在室溫下放置5 即可。4、吸盡培養(yǎng)基，用冰冷的清洗細(xì)胞2 次。5 、細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞于 15 離心管中（依次為 5 ，3 和 3 ）。預(yù) 冷后 2000 5 收集細(xì)胞。6、倒去上清。按照細(xì)胞量,加入 。使得細(xì)胞終濃度為每 200含2 X 106個(gè)細(xì)胞。這樣每100溶液含1 X 106個(gè)細(xì)胞。再加入蛋白酶抑制劑復(fù)合物。假設(shè)7長(zhǎng)滿板為5 X 106個(gè)細(xì)胞。本次細(xì)胞長(zhǎng)得約為 80%。即為 4X106 個(gè)細(xì)胞。因此每管加入 400 。將2管混 在一起，共 800 。7、超聲破碎：750, 25%功率，4.5S沖擊，9S間隙。共14次。二）、除雜及抗體哺育。8、超聲破

32、碎結(jié)束后， 10， 000g 4 離心 10 。去除不溶物質(zhì)。留取 300 做實(shí)驗(yàn)，其余保存于 -80 。300 中， 100 加抗體做為實(shí)驗(yàn)組； 100 不加抗體做為對(duì)照組；100 加入 45 （終濃度為 0.2M ），65 處理 3h 解交聯(lián)，跑電泳，檢測(cè) 超聲破碎的效果。9、在100的超聲破碎產(chǎn)物中，加入 900和20的50 X。再各加入 60 。 4 顛轉(zhuǎn)混勻 1h 。10、 1h 后，在 4靜置 10 沉淀， 700 離心 1。11 、取上清。各留取 20 做為。一管中加入1 抗體，另一管中則不加抗體。 4 顛轉(zhuǎn)過(guò)夜。三）、檢驗(yàn)超聲破碎的效果。取 100 超聲破碎后產(chǎn)物，加入 45電泳檢測(cè)超聲效果。， 65 處理 2h 解交聯(lián)。分出一半用酚 / 氯仿抽提。第二天：一）、免疫復(fù)合物的沉淀及清洗。12 、孵育過(guò)夜后，每管中加入 60。 4 顛轉(zhuǎn)2h。13、 4靜置 10 后， 700 離心 1 。除去上清。1 4 、依次用下列溶液清洗沉淀復(fù)合物。 清洗的步驟： 加入溶液， 在 4 顛轉(zhuǎn) 10 ， 4 靜置 10 沉淀， 700 離心 1 ，除去上清。洗滌溶液