基因組序列詮釋

1、cDNA文庫構(gòu)建(CLONTECH)cDNA文庫構(gòu)建5RACE(CLONTECH)3RACE(CLONTECH)4.2 基因超表達基因超表達 通過增加基因的通過增加基因的拷貝數(shù)拷貝數(shù)和采用強啟和采用強啟動子促使基因超表動子促使基因超表達達,致使受體表現(xiàn)出致使受體表現(xiàn)出生長與發(fā)育的異常生長與發(fā)育的異常,來研究基因的功能來研究基因的功能. 4.3反義反義RNA 反義反義RNA是由基因的負鏈編碼是由基因的負鏈編碼,可與可與正義正義RNA (sense RNA)或或DNA 編碼順序編碼順序結(jié)合結(jié)合,干擾干擾mRNA 的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄,加工和轉(zhuǎn)運加工和轉(zhuǎn)運,調(diào)調(diào)控基因的表達控基因的表達.v構(gòu)建反義RNA 表

2、達載體: 將全目的基因或部分目的基因反向插入表達載體 轉(zhuǎn)化目標生物 獲得轉(zhuǎn)基因個體或品系 分析轉(zhuǎn)基因植株在生理、生化、形態(tài)等方面的變異 判別目的基因的功能p3301-HbF(11030bp)300bpHbF35S proNco ISpe I Bst EIIp3301-HbR(11030bp)300bpHbR35S proNco IBst EII正義表達載體反義表達載體v反義RNA 作用機理： A 干擾翻譯的起始與延伸，可與翻譯起始順序及編碼序列結(jié)合形成雙鏈RNA，隨之被細胞降解。 B 與mRNA 的引導(dǎo)順序結(jié)合，阻止核糖體的附著，使翻譯無法啟動。 C 反義RNA與mRNA形成雙鏈分子后，使RN

3、A多聚酶脫離模板,轉(zhuǎn)錄終止。4.4 RNAi干涉 RNAi干涉是通過雙鏈RNA的介導(dǎo),特異性地降解相應(yīng)序列的mRNA,從而阻斷相應(yīng)基因表達的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制.RNAi 作用機理A dsRNA核酸內(nèi)切酶Dicer被激活,它把dsRNA加工成2125 個核苷酸長的RNA鏈;B 這些小片段RNA(siRNA)作為另一個核糖核酸復(fù)合體RISC(RNA-induce silencing complex,RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體)的指引物,結(jié)合到RISC上,使之識別并降解mRNA,從而導(dǎo)致與雙鏈RNA同源的基因沉默;vRNAi設(shè)計方法及應(yīng)用A Fraser 合成與開放讀碼框相對應(yīng)的雙鏈RNA或利用細菌

4、克隆表達這些雙鏈RNA微量注射和喂食干擾同源基因的表達B Chuang 等設(shè)計出嵌合體結(jié)構(gòu) 連接強啟動子大量表達雙鏈mRNA干擾同源基因的表達HbF基因的RNAi載體構(gòu)建RNAi技術(shù)的優(yōu)缺點vRNAi最根本的特點是特異性vRNAi具有特殊的穿越能力,如將雙鏈RNA注射在線蟲性腺里,它也會干擾到體細胞里的基因表達,而且干擾作用會傳給后代;vRNAi對一些低水平表達的基因的RNAi現(xiàn)象并不明顯,而且?guī)讉€有相同或相似序列的基因, RNAi也會同時作用與它們.4.5 酵母雙雜交（酵母雙雜交（yeast two-hybridization）v原理： 其原理涉及轉(zhuǎn)錄因子與啟動子之間的互作。 正常條件下：

5、轉(zhuǎn)錄因子 （包括兩個功能區(qū)域） 結(jié)合功能域同基因上游的區(qū)段結(jié)合 激活功能域激活RNA多聚酶 將基因轉(zhuǎn)錄為mRNA v酵母雜交系統(tǒng)中： 融合表達載體1 融合表達載體2DNA結(jié)合功能域+目的片段激活功能域+ 多種未知cDNA 融合表達載體1同一細胞 融合表達載體2 形成聚合物，啟動報告基因的表達表達載體共轉(zhuǎn)化4.6 其他方法v構(gòu)建轉(zhuǎn)座子突變庫v噬菌體外顯v內(nèi)含子歸槽突變v開放讀框順序標簽第四講 基因組序列詮釋5. 轉(zhuǎn)錄物組6. 蛋白質(zhì)組問題問題v細胞周期的不同時期細胞周期的不同時期v個體發(fā)育不同階段個體發(fā)育不同階段v不同的器官和組織不同的器官和組織v不同的外界環(huán)境下不同的外界環(huán)境下 各種基因的表達

6、與否、量的差異、表達各種基因的表達與否、量的差異、表達部位如何部位如何5. 5. 轉(zhuǎn)錄物組轉(zhuǎn)錄物組5.1 Northern5.1 Northern雜交雜交v雜交主要步驟： 提取總RNA（不同組織、不同器官） 變性電泳 制備目的基因探針 轉(zhuǎn)移尼龍膜 （放射性 或 化學(xué)標記法） 雜 交 掃描或放射自顯影 依據(jù)雜交信號的強弱、有無判斷基因的表達部位、 表達量、表達時期等 5.2 SAGESAGE （serials analysis of gene expression）基因表達系列分析 1995 Velculescu 及其同事年創(chuàng)立SAGE 步驟步驟SAGE實例實例SAGESAGE特點：特點：v進行

7、轉(zhuǎn)錄物組研究，也就是轉(zhuǎn)錄水平的研究；v通過快速和詳細分析成千上萬個EST來尋找出表達豐度不同的SAGE標簽序列，從而接近完整地獲得基因組的表達信息；v SAGE區(qū)別于差異顯示、消減雜交等其它技術(shù)的主要特點是可用于尋找那些較低豐度的轉(zhuǎn)錄物，最大限度地收集基因組的基因表達信息，這使之成為從總體上全面研究基因表達、構(gòu)建基因表達圖譜的首選策略；vSAGE可用于在不同環(huán)境、不同生理狀態(tài)及不同生長階段的細胞和組織表達圖譜構(gòu)建，對不同狀態(tài)下基因表達水平的定量或定性比較，特別是對疾病組織與正常組織的比較發(fā)展迅速； SAGE SAGE 技術(shù)的主要理論依據(jù)：技術(shù)的主要理論依據(jù)：v來自轉(zhuǎn)錄物內(nèi)特定位置的一小段寡核苷

8、酸序列（911bp）含有鑒定一個轉(zhuǎn)錄物特異性的足夠信息，可作為區(qū)別轉(zhuǎn)錄物的標簽（tag）；v通過簡單的方法將這些標簽串聯(lián)在一起，形成大量多聯(lián)體（concatemer），對每個克隆到載體的多聯(lián)體進行測序，并應(yīng)用SAGE軟件分析，可確定表達的基因種類，并可根據(jù)標簽出現(xiàn)的頻率確定基因的表達風(fēng)度（abundance）。 5.3 基因芯片v何為生物芯片? 生物芯片主要指通過平面微細加工技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、核酸以及其他生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。 它是繼大規(guī)模集成電路之后的又一次具有深遠意義 的科學(xué)技術(shù)革命。D N A C h ip s P ro

9、te in C h ip sL a b C h ip sB io c h ip s基因芯片基因芯片基因芯片的主要應(yīng)用基因芯片的主要應(yīng)用基因表達檢測 擬南芥、酵母基因表達研究等突變檢測 BRCA基因外顯子、CFTR基因、-地中海貧血、酵母突變菌株、HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶基因等的突變檢測等基因組多態(tài)性分析 人類基因組單核苷酸多態(tài)性的鑒定及分系析，人線粒體16.6kb基因組多態(tài)性的研究等基因文庫作圖 通過確定重疊克隆的次序從而對酵母基因組進行作圖 Expression ChipsGenomic ChipsSequencing ChipsDNA Chips基因芯片研制的總體藍圖基因芯片研制的總體藍

10、圖 研制方向的確定基因組序列分析與待檢基因探針序列的確定檢測樣品 的制備探針陣列的準備檢測設(shè)備的研制雜交檢測與數(shù)據(jù)分析表達芯片的制備檢測流程表達芯片的制備檢測流程v表達芯片實例PCR法從外周血淋巴細胞cDNA文庫擴增產(chǎn)物擴增產(chǎn)物點樣于包被的玻片上DNA 芯片熱擊T細胞cDNA未處理的細胞cDNA 雜交 雜交激光共聚焦掃描發(fā)現(xiàn)17個差異表達基因,11個被熱誘導(dǎo),6個被熱抑制,發(fā)現(xiàn)其中3個為未發(fā)現(xiàn)的新基因6. 6. 蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)組 DNAmRNAPROTEIN(活活性性)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控(transcriptional control)翻譯水平調(diào)控(Translational control)翻譯后

11、水平調(diào)控(Post-translational control)6.1蛋白質(zhì)組(Proteome)v Proteome來源于 Proteins和 genome 兩個詞的組合,意思是Proteins expressed by a genome,即基因組表達的蛋白質(zhì).v蛋白質(zhì)組定義蛋白質(zhì)組定義 廣義上是指某種細胞或組織中基因組表達的所有蛋白質(zhì)廣義上是指某種細胞或組織中基因組表達的所有蛋白質(zhì); ; 狹義上狹義上, , 可以指不同時期細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變化可以指不同時期細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變化. .v蛋白質(zhì)組學(xué)定義蛋白質(zhì)組學(xué)定義 研究蛋白質(zhì)組結(jié)構(gòu)和功能的領(lǐng)域稱為蛋白質(zhì)組學(xué)研究蛋白質(zhì)組結(jié)構(gòu)和功能的領(lǐng)域稱為蛋白質(zhì)組

12、學(xué). .v蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容: : 分析全部蛋白質(zhì)組所有成分以及它們的數(shù)量分析全部蛋白質(zhì)組所有成分以及它們的數(shù)量; ; 確定各種組分所在的空間位置、修飾方法、互作機制、確定各種組分所在的空間位置、修飾方法、互作機制、生物活性和特定功能等生物活性和特定功能等 6.2 蛋白質(zhì)組分析復(fù)雜性v蛋白質(zhì)有許多加工方式,如磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化等；vmRNA 的可變剪接、程序性移碼和可控突變，1個基因可編碼許多不同的蛋白質(zhì)，常常表現(xiàn)為組織特異性；v蛋白質(zhì)之間存在大量的相互作用，如形成同源或異源二聚體、三聚體或多聚體，不同的結(jié)合狀態(tài)有不同的活性；v1種蛋白質(zhì)可參與多種反應(yīng)，或多種

13、蛋白質(zhì)參與1種反應(yīng)。6.36.3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)蛋白質(zhì)組研究技術(shù) 蛋白質(zhì)組主要研究技術(shù)：蛋白質(zhì)組主要研究技術(shù)： 雙向電泳雙向電泳 生物質(zhì)譜技術(shù)生物質(zhì)譜技術(shù) 蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片 酵母雙雜交酵母雙雜交6.3.1 6.3.1 雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳 樣品制備（包括蛋白質(zhì)的溶解、變性及還原，從而去除非蛋白質(zhì)雜質(zhì)等） 第一向等電聚焦（根據(jù)蛋白質(zhì)電荷差異進行分離） 第二向SDS-PAGE（以蛋白質(zhì)分子量差異為基礎(chǔ)）蛋白質(zhì)的檢測（用考馬斯亮藍、銀染、銅染等方法）圖譜數(shù)字化分析（圖象掃描、確定每個蛋白質(zhì)點的等電點和分子量，尋找差異蛋白）6.3.2 蛋白質(zhì)組分析技術(shù) 主要蛋白質(zhì)組分析技術(shù)： 質(zhì)譜方法 蛋白質(zhì)

14、序列分析 氨基酸組成分析v質(zhì)譜技術(shù)的基本原理： 樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間質(zhì)核比（m/z）的差異來分離并確定分子量。v質(zhì)譜儀組成： 進樣裝置、離子化源、質(zhì)量分析器、離子檢測器和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)組成。v質(zhì)譜技術(shù)在蛋白組研究中的應(yīng)用：質(zhì)譜技術(shù)在蛋白組研究中的應(yīng)用：A 肽質(zhì)譜和肽序列分析 蛋白質(zhì)經(jīng)雙向電泳后，分離到的蛋白質(zhì)被切割下來，進行膠內(nèi)酶解，或轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，進行膜上膜解，然后上樣進行測序。 但目前質(zhì)譜法還不能夠取代Edman降解法測序，可是其測定速度較快。B 鑒定翻譯后修飾的蛋白質(zhì)鑒定翻譯后修飾的蛋白質(zhì) 質(zhì)譜可通過特征離子監(jiān)測的方法很快確定磷酸化肽，通過串聯(lián)質(zhì)譜確定磷酸化位點； 質(zhì)譜可與蛋白酶解和糖苷酶酶解結(jié)合，尋找糖肽，鑒定糖基化位點； 質(zhì)譜還參與糖鏈組成、結(jié)構(gòu)甚至分支情況等的分析。 C 質(zhì)譜技術(shù)的其他作用 質(zhì)譜可對蛋白質(zhì)二硫鍵進行定量和定位，分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用，以及蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)等。6.4蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫的建立和生物信息學(xué) 數(shù)據(jù)庫的建立是蛋白質(zhì)組研究的最重要的一個方面。 蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫包括： 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫 雙向電泳圖譜數(shù)據(jù)庫 有關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)