乙型肝炎核酸疫苗NV-HBs肌注小鼠后HBsAg的表達(dá)和抗-

1、乙型肝炎核酸疫苗NV-HB/s肌注小鼠后HBsAg的表達(dá)和抗-HBs的誘生及局部病理觀察【摘要】目的研究乙型肝炎核酸疫苗肌注小鼠后在體內(nèi)的表達(dá)及小鼠體液免疫應(yīng)答的規(guī)律，同時(shí)觀察接種局部組織的病理變化。方法以乙型肝炎核酸疫苗NV-HB/s肌注小鼠，然后定期分批處死，采集肌注局部組織檢測(cè)HBsAg(ABC免疫組化法)，采集外周血標(biāo)本檢測(cè)HBsAg和抗-HBs(ELISA法),并常規(guī)病理檢查。結(jié)果接種乙型肝炎核酸疫苗后1周，HBsAg的表達(dá)即可在部分受檢小鼠的肌注局部組織內(nèi)檢出；接種后2周，全部受檢小鼠的肌注局部組織HBsAg檢測(cè)均呈陽(yáng)性，部分受檢小鼠的外周血抗-HBs亦陽(yáng)轉(zhuǎn)，此后檢出率進(jìn)一步增高。

2、接種后1個(gè)月，受檢小鼠抗-HBs即全部陽(yáng)轉(zhuǎn)并持續(xù)到接種后半年以上；同期間內(nèi)，至少75%的受檢小鼠其肌注部位組織仍保持HBsAg檢出陽(yáng)性，而其外周血標(biāo)本內(nèi)的HBsAg檢測(cè)則始終呈陰性。病理檢查提示：核酸疫苗接種后，僅在肌注局部出現(xiàn)一過(guò)性非特異性炎癥反應(yīng)。結(jié)論乙型肝炎核酸疫苗NV-HB/s肌注接種小鼠后，可通過(guò)在注射部位組織中表達(dá)HBsAg，在其體內(nèi)誘生特異性抗-HBs?！局黝}詞】DNA疫苗肝炎，乙型乙型肝炎病毒表面抗原抗體HBsAg expression, anti-HBs induction and pathological observation in the mice inoculated

3、 with DNA vaccine against Hepatitis BZHAO Liansan, QIN Shan, TANG Hong, et al. Sichuan Provincial Key Laloratory of Mdecular Biology of Infectious Diseases, First Affiliatod Hospital of Xuasi Medical University, Chengdu 610041【Abstract】ObjectiveTo study if special humoral immunological response can

4、be induced by DNA vaccine against Hepatitis B (NV-HB/s) and its mechanism.MedthodsThe Balb/C mice inoculated with NV-HB/s by intramuscular injection were detected for HBsAg(the expressed product of NV-HB/s)by ABC immunohistochemistry or ELISA, and for anti-HBs by ELISA and also performed the routine

5、 pathological examination. ResultsAfter inoculated with NV-HB/s, HBsAg could be detected from mice muscle tissue samples of injected sites one week later and almost kept positive(75% and even more) up to 6th month, but was undetectable from all the serum samples during this period; anti-HBs could be

6、 detected from serum samples of some mice two weeks later and of all the mice detected one month later, it still kept positive at 6th month while the mice were sacrificed. Under microscope, only non-specific inflammation was found in the muscle tissues of injected sites and could completely recover

7、within 4 weeks, no matter whether the mice were inoculated with NV-HBs, or with traditional HB vaccine derived from blood, or even with PBS as control.ConclusionDNA vaccine against Hepatitis B (NV-HB/s) can successfully express HBsAg in the muscle tissue of mice by intramuscular inoculation and subs

8、eguently induce anti-HBs in viro.【key words】DNA vaccineHepatitis BHBsAgAntibody乙型肝炎病毒(HBV)感染可導(dǎo)致肝硬化、甚至肝癌，危害十分嚴(yán)重。目前尚無(wú)滿意的抗病毒治療手段。作者等曾報(bào)告用乙型肝炎核酸疫苗NV-HBs免疫小鼠，誘導(dǎo)出了特異性體液免疫應(yīng)答，使小鼠外周血抗HBs陽(yáng)轉(zhuǎn)1。為了探討核酸疫苗的作用機(jī)理，我們進(jìn)一步研究了肌注乙型肝炎核酸疫苗NV-HB/s在小鼠體內(nèi)表達(dá)HBsAg的規(guī)律及NV-HB/s肌注部位的病理變化特點(diǎn)。1材料和方法2結(jié)果2.1肌注NV-HBs后HBsAg的表達(dá)及抗-HBs的誘生在接種NV-HB

9、s后第3天時(shí)，尚未能在受檢小鼠中檢出HBsAg；接種后1周，則已能在受檢小鼠肌注局部組織中檢出HBsAg的表達(dá)，檢出率為33.3%；接種后2周，檢出率達(dá)100%，此時(shí)，外周血內(nèi)抗-HBs已出現(xiàn)陽(yáng)轉(zhuǎn)，陽(yáng)轉(zhuǎn)率為66.7%；此后肌注局部組織中的HBsAg檢出率和外周血抗-HBs檢出率均進(jìn)一步增高(表1)。累計(jì)接種后1月起到第6月本實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)全部受檢的22只實(shí)驗(yàn)鼠中，外周血抗-HBs檢測(cè)結(jié)果均全部呈陽(yáng)性；并至少在75%的受檢鼠中，其肌組織內(nèi)HBsAg保持檢出陽(yáng)性。此外，陽(yáng)性對(duì)照鼠外周血抗-HBs檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性；而陰性及空白對(duì)照鼠的HBsAg及抗HBs檢出結(jié)果則均呈陰性，符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)預(yù)期結(jié)果。 表1小鼠

10、肌注NV-HBs后局部組織中HBsAg的表達(dá)及外周血中抗-HBs的檢出Tab.1HBsAg expression and anti-HBs induction in the mice inoculated withDNA vaccine against hepatitis B(NV-HB/s) by intramuscular injection接種后的陽(yáng)性率Positive rate after inoculation3d1wk2wks1mo2mos4mos6mosHBsAg033.3100757583.375(0/4)(1/3)(3/3)(3/4)(3/4)(5/6)(6/8)Anti-H

11、Bs0066.7100100100100(0/4)(0/3)(2/3)(4/4)(4/4)(6/6)(8/8) 注：HBsAg的檢測(cè)用免疫組化法(ABC染色)，抗-HBs的檢測(cè)用ELISA法；括號(hào)中的數(shù)表示陽(yáng)轉(zhuǎn)小鼠數(shù)/受檢小鼠數(shù)Notes:HBsAg was detected from mouse muscle tissue samples of injected sites by ABC immunohistochemistry. Anti-HBs was detected from serum samples by ELISA.The numerals in parenthesis ind

12、icating The number of mice with positive detection resulats/the total number of mice detected另一方面，無(wú)論是接種乙型肝炎核酸疫苗NV-HB/s的實(shí)驗(yàn)鼠、或是接種血源乙型肝炎疫苗的陽(yáng)性對(duì)照鼠，雖然其外周血抗-HBs均陽(yáng)轉(zhuǎn)，但其血清標(biāo)本內(nèi)均始終未能檢出HBsAg。2.2肌注NV-HB/s后局部組織的病理改變肌注后第3天處死的小鼠未見(jiàn)內(nèi)臟器官明顯改變。鏡下觀察接種局部肌組織，實(shí)驗(yàn)鼠及對(duì)照鼠均可見(jiàn)玻璃樣變性，表現(xiàn)為肌細(xì)胞腫脹，橫紋消失，胞漿紅染。肌注NV-HB/s或空載質(zhì)粒pRc/CMV/ATG的小鼠肌細(xì)胞的

13、局部變性灶范圍較肌注PBS者大，且伴有輕、中度的淋巴細(xì)胞聚集，其中1例肌注NV-HB/s的小鼠在肌注部位可見(jiàn)有中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。肌注PBS小鼠的上述病理改變?cè)诩∽⒑?周逐漸減輕，至注射后2周，已自行恢復(fù)正常；肌注NV-HB/s及空載質(zhì)粒的小鼠則在接種后4周完全恢復(fù)正常。3討論核酸疫苗系插入有目的基因的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒DNA，接種后可在體內(nèi)表達(dá)目的基因所編碼的蛋白；該蛋白即可作為抗原，誘生機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答，達(dá)到免疫保護(hù)的目的，甚至可望用于治療慢性病毒感染乃至腫瘤3，4。本文接種小鼠用的核酸疫苗含有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)主蛋白S的編碼基因，肌注小鼠后1周內(nèi)，在局部肌組織已可檢出HBsA

14、g主蛋白S的編碼基因，肌注小鼠后1周內(nèi)在局部組織已可檢出HBsAg的表達(dá)；隨后檢出率進(jìn)一步增高，持續(xù)表達(dá)至接種后半年以上，同時(shí)伴有外周血抗-HBs的陽(yáng)轉(zhuǎn)；接種血源乙型肝炎疫苗(HBsAg)的陽(yáng)性對(duì)照鼠的血清抗-HBs亦同時(shí)能陽(yáng)轉(zhuǎn)，而僅肌注空栽質(zhì)粒pRc/CMV/ATG或PBS的對(duì)照組小鼠HBsAg及抗HBs檢測(cè)則均系陰性。以上結(jié)果表明，核酸疫苗NV-HB/s的接種在小鼠體內(nèi)表達(dá)了HBsAg，并誘生出抗-HBs應(yīng)答。本組資料觀察到，在HBsAg檢出后1周，即小鼠肌注接種NV-HB/s后2周，即可在66.7%的受檢小鼠外周血內(nèi)檢出抗-HBs；在接種后16月分4批處死受檢的22只小鼠中，外周血抗-H

15、Bs均已全部陽(yáng)轉(zhuǎn)，提示誘生出的外周血抗-HBs可持續(xù)至陽(yáng)轉(zhuǎn)后5月以上，表明核酸疫苗NV-HB/s的接種實(shí)現(xiàn)了高效率的體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。在上述的22只小鼠中，有5只盡管于處死當(dāng)時(shí)在肌注局部表達(dá)的HBsAg尚未達(dá)到可檢出水平，但其外周血抗-HBs均已陽(yáng)轉(zhuǎn)。這種外周血抗-HBs檢出率(ELISA法)高于肌注部位組織HBsAg檢出率(免疫組化法)的現(xiàn)象，系因機(jī)體對(duì)抗原免疫應(yīng)答誘生抗體的過(guò)程中存在著放大效應(yīng)，以及兩種方法的檢測(cè)靈敏度存在著差異所致。Geissler等5進(jìn)行了類(lèi)似的研究，所報(bào)告的乙型肝炎核酸疫苗接種后的抗-HBs應(yīng)答規(guī)律與本文一致；惟該作者通過(guò)放射免疫技術(shù)，可在44%的受檢小鼠外周血內(nèi)檢測(cè)出低水平的HBsAg。而在本組資料中，盡管乙型肝炎核酸疫苗能在小鼠接種局部肌組織內(nèi)表達(dá)HBsAg，在其體內(nèi)誘生抗-HBs；但外周血內(nèi)的HBsAg則均未能達(dá)到ELISA技術(shù)的可檢出水平。且接種血源乙型肝炎疫苗的陽(yáng)性對(duì)照鼠情況亦是