蛋白質的定量測定試驗報告

1、蛋白質的定量測定（Folin -酚試劑法）、實驗預習 1.0實驗目的初步了解各種蛋白質含量測定的常用方法。掌握Folin-酚試劑法測定蛋白質含量的原理及熟悉和掌握實驗操作技術。掌握用excel制作標準曲線和通過標準曲線及標準管方法求樣品溶液中待測定物 質含量。1.1實驗原理1.1.1總體概述Folin-酚試劑法是經過科學家改進的測定蛋白質含量的方法，F(xiàn)olin首創(chuàng)這種方法:利用蛋白質分子中酪氨酸和色氨酸殘基（酚基）還原酚試劑（磷鎢酸-磷鉬酸）起藍色反應。而后，Lowry對此法進行了改進，先于標本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應, 提高了靈敏度，靈敏度的范圍為：20: 250 g，故使得實驗的精確

2、度大大提高，但同時也存在著干擾物質多、費時、操作嚴格計時等問題。2在堿性溶液中，雙縮脲（H2NOC NH CONH2）能和Cu作用，發(fā)生配位反應,形成紫色或紫紅色的絡合物，即為雙縮脲反應。由于蛋白質的肽鍵結構與雙縮脲結構相似，故在堿性溶液中，蛋白質的分子中肽鍵2 2能和堿性銅試劑中的Cu作用，生成紫紅色的蛋白質-Cu復合物。對于蛋白質的測定 來說，這一步是基礎，這也是Folin-酚法的基礎原理。實驗名稱(TitleofEx perimetn)實驗日期實驗地點(DateofEx periment)XXXXXXXX合作者XXXX(P artner)總分(TotalScore)(Signature)

3、教師簽名(LabNo.)指導老師XXXX(Instructor)批改日期(Date)1.1.3Foli n-酚顯色反應Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，其磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽易背酚類化合物還原2而呈現(xiàn)藍色。酪氨酸（Tyr）含有酚羥基，故蛋白質-Cu復合物含有的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍色的化合物。在一定的濃度范圍內，藍色的深淺與蛋白質的濃度呈線性關系。故可以利用上述兩種反應通過分光光度法測定待測樣品的蛋白質含量。本實驗以上述兩個反應原理為基礎，再通過設置空白對照組，標準管中設置蛋白標準液的一系列濃度梯度（ONmL,O/mL，OEmL，O.L）通過分光光度計測定吸

4、光 度，從而獲取標準曲線，樣品管通過測定的吸光度值，在標準曲線中找到較為準確對應 的含量。1.2實驗材料1血清稀釋液（正常人血清稀釋300倍）200 g/ml牛血清白蛋白標準液（BSA）；堿性硫酸銅溶液（組成：堿溶液與硫酸銅溶液按50:1混合而成，使用時該溶液必須新鮮配制，當日有效）；Foli n-酚試劑（配制過程較為復雜）注：此次實驗所用的試劑全部已由老師制備好，所以無配制過程，但需知道配制流程，可查閱實驗書P 105oV-1100可見光分光光度計;2恒溫水浴箱;3試管6支、試管架;4加樣槍、加樣槍架。管， 利用加樣槍按要求量取相應量的溶液,加入Folin-酚試劑水浴10minr(各試管的需

5、加入的試劑和量見卜表)每隔一分鐘，依次往1號試管到6號試管中加入2mL的堿性硫酸銅溶液，搖勻并記錄每支試管的加入硫酸銅時間， 室溫靜置lOmin將靜置時間達到lOmin中的試管中，加入0.20mL的Folin-酚試劑，快速搖勻(一般在2s以內)。(3)Folin-酚反應在400C下水浴加熱lOmin鐘同樣需計時。10min鐘后取出冷卻至室溫。轉動波長旋鈕，調制500.0nm,按“mode鍵切換到T檔,分別將1-6號試管中混合液放入比色杯中利用1號試管為空調至A檔，依次測定2-6試管的吸光度，并讀取數(shù)據(jù)。重復操作，再讀取數(shù)據(jù)2次，并記錄。數(shù)據(jù)表格見表1利用測得的數(shù)據(jù)，繪制以A500值為縱坐標，牛

6、血清清蛋白標(5)繪制標準曲線準液濃度為橫坐標的準備曲線，具體繪制利用excel制作,1.3實驗步驟-溶液混合步驟滴加堿性硫酸銅作I_靜置10min*繪圖取結果(1)反應體系設置123456牛血清蛋白質標準液00.20.40.60.80樣品液000000.5蒸餾水1.00.80.60.40.20.5(2)雙縮脲反應(4)比色測定白，校置100；結果可見圖2根據(jù)樣品管（6管）的吸光度值，在標準曲線中找到對應的蛋白質濃度，再乘以稀釋倍數(shù)（300），得出每毫升未稀釋血血清蛋白濃度（g/ml）=樣品蛋白質濃度X 2 X 300參考：正常人血清蛋白濃度范圍為6080 g/L。1試劑要求：實驗所需的試劑必

7、須是新鮮配制，不然會存在被空氣及其他物質氧化還原的情況，干擾實驗的測定。2控制時間：Lowry反應的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間。嚴格按照實驗步驟的操作，規(guī)定的時間是多少就多少。水浴時間也不宜過長。同時, 在最后從水浴加熱后取出冷卻后，需及時的進行比色測定。防止混合液中物質發(fā)生系列 變化和反應。3加入Folin-酚試劑后，需要馬上混合搖勻，防止磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞。干擾物質的影響：凡干擾雙縮脲反應的基團，均可干擾Folin-酚反應。這些物質在所測樣品中含量較高時，則需做校正曲線。若所測的樣品中含硫酸銨，則需增加 碳酸鈉一氫氧化鈉濃度即可顯色測定。若樣品酸度較高，也需提高

8、碳酸鈉一氫氧化鈉濃 度12倍，這樣即可糾正顯色后色淺的弊病。5繪制曲線要求：作過原點的直線或光滑連續(xù)的曲線，該線表示實驗點的平均變動情況，因此該線不需全部通過各點，但應盡量使未經過線上的實驗點均勻分布在曲線或直線兩側。（電腦Excel繪圖，可以不考慮）、實驗記錄（6）測樣品蛋白清含蛋白質的微克數(shù)，即每毫升血清中蛋白質的微克數(shù)質含量(mg/ml)。操作要按照實驗步驟,步一步來，防止操作問題導致的操作誤差的出現(xiàn)等。2.1實驗條件材料及試劑：本次實驗的試劑和材料均是實驗室配制好的，比例和濃度同實驗預習,故不再贅述。實驗時間表:總表實驗步驟消耗時間混合溶液未計時滴加溶液靜置10mi n加Folin-酚

9、試劑、水浴10mi n室溫冷卻27min等待20min比色測定6mi n附表項目時刻表試管1試管2試管3試管4試管5試管6加硫酸銅842”09843”20844”29845”45846”55847”55水浴852”09853”20854”29855”45856”55857”55冷卻等待902”09903”22904”29905”45906”55908”00操作技巧:1在這一次的實驗中，關鍵的要點在于滴加Folin-酚試劑的搖勻，必須快速搖勻，保證 反應優(yōu)先進行。振蕩試管時，振蕩的正確方法是用手腕的力左右擺動，使試管中液體混 合均勻且不漏出。最后放入到水浴中加熱。2在分光比色的時候，測量一次后重

10、新凋零，不能繼續(xù)測量等。操作失誤:全部實驗過程中，就出現(xiàn)了一次失誤，即在試管4加入Folin-酚試劑，充分搖勻，在放入水浴加熱之間，部分液體由于磕碰而濺出。其余操作嚴格按照要求一步步完成，理論 不存在著失誤。分析：Folin-酚與液體已經混合均勻并反應，在后面的水浴加熱后，只是影響到了整體 的試管4的反應后得到的溶液量，而不影響顏色的變化及最后的比色測定，故該失誤不 會對實驗產生測定的偏差。2.2實驗現(xiàn)象1在滴加硫酸銅溶液后，搖勻，產生較多的黏性氣泡且附著在液體表面。液體顏色變化 不深。2在滴加Folin-酚試劑水浴加熱后，除試管1為淡黃色外，其余試管均成不同的藍色。具體看下圖:圖一水浴后各試

11、管的情況圖分析：標準液的試管中（2-5）藍色不斷加深，同實際的標準液的含量多少正相關，而 試管6的顏色不深，在1-2試管之間，根據(jù)實驗原理初步可以判定的是：該樣品液的蛋 白質含量將不會在60-80g/L之間，而是在0-40g/L。即實驗存在一定的問題，詳見結果 的分析與討論。2.3實驗原始數(shù)據(jù)本次實驗原始數(shù)據(jù)是在500nm的波長下，各試管混合液的吸光度值，結果見下表1表1500nm波長吸光度值記錄各管吸光度值A500測定次數(shù)0.3530.5610.7440.9380.172各管平均值A500、結果與討論3.1數(shù)據(jù)處理A500=(0.353+0.350+0.351)/3=0.3513；A500=

12、(0.561+0.562+0.562)/3=0.5617；依次得到4-6管的吸光度值如下所示:測定次數(shù)-各管吸光度值A50023456各管平均值A5000.35130.56170.74370.93800.17203.1.2Excel繪制蛋白質的標準曲線根據(jù)用Excel繪制標準曲線PPt所示步驟，最終得到如下結果:圖2標準曲線圖2從圖中我們可以看到線性方程：y 0.0062 ?x，R0.9659故得血清蛋白濃度為16.65g/L03.2結果由上數(shù)據(jù)處理可知，最后的待測樣品的蛋白質含量為16.65g/L0而真正的正常人血清0.3500.5620.7440.9380.1720.3510.5620.7

13、430.9380.1723.1.1利用原始數(shù)據(jù),可得到各管的平均值:2管:3管:將樣品溶液的吸光度（即y值）代入方程,可得出樣品濃度（即x值）；由相關指數(shù)值R2可看出誤差大小。y 0.1720 x 0.17200.006227.74 g/mL血清蛋白濃度（g/ml）=樣品蛋白質濃度X2X 300蛋白濃度范圍為6080g/Lo因此，存在一定問題，具體分析見3.3分析與討論。3.3分析與討論首先，我們回顧了整個操作過程，在整個過程中，我們基本都是按照要求操作，并不存 在著明顯的操作問題。通過上面水浴加熱后的圖可以明顯看到， 結果的確應該在0-20g/L之間。同時我們與和我們一樣使用試劑的組討論后發(fā)

14、現(xiàn)，他們的結果也是在10幾左右;同時，很多組測出的結果都偏低，故可以初步判定結果的測量方式上不存在明顯問題。其次，回顧全部過程的原理，我們猜測可能存在的造成結果低的情況為:1在室溫冷卻后，實驗室沒有空余的分光光度計，排隊時間應該是全部小組中最長 的，基本花去30多分鐘。而這也導致了最后的顯色增強（其具體的顯色原因可能為物 質間的復雜反應導致）從而使得最后的標準曲線的斜率增大，導致測定的標準的樣品液蛋白質含量的下降。即AB，如圖所示:3開始實驗的試管清洗的不充分B可能存在部分的雜質，導致顯色反應的增強。4分光光度計的幾個比色杯透明面被碰到， 影響到了液體的吸光度，吸光度的下降, 使得樣品液的測定

15、值偏低。最后，有可能在以后的時間里，可以重新做該實驗，從多方面來驗證自己的分析。多和老師同學交流，得到較好的結果3.4復習思考題參考資料來源:生物化學與分子生物學實驗技術.王曉華，朱文淵主編1、試述Folin-酚試劑法的優(yōu)點?答:根據(jù)所學及所查知識，優(yōu)點總結如下:分光光度計的比色杯清斛析不干凈，存在蒸餾水的色反應增強后的的總體效效果是使樣品液的含量測定下降品液吸光值原本的標準曲測定蛋白質靈敏度高，較為準確，可檢測最低蛋白質量達5 g，通常范圍為:20: 250 g在生物化學領域應用廣泛。2操作雖受時間限定，但是只需加入兩種試劑，即可起作用，總體上說，操作簡單，原 理清晰易懂。3適用性廣，除測定蛋白質的含量，還可特定的適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。2、應用本方法有哪些干擾作用？為什么？應如何注意?答:對雙縮脲反應有干擾的離子，同樣干擾Lowry反應，且影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。原因是：Lowry反應的第一步即