注射用重組人促卵泡激素制造及檢定暫行規(guī)程

1、注射用重組人促卵泡激素制造及檢定暫行規(guī)程本品系由含有高效表達人促卵泡激素基因的中國倉鼠卵巢（CHO）細胞，經(jīng)過細胞培養(yǎng)，分離和高度純化后凍干制成。含有維持其穩(wěn)定性作用的保護劑， 不含防腐劑和抗生素。適應(yīng)癥為不排卵（包括多囊卵巢綜合癥PCOD）且對枸 櫞酸克羅米酚治療無反應(yīng)的婦女。對于進行超排卵期或輔助生育技術(shù)，如體外 受精胚胎移植（IVF）、配子輸卵管內(nèi)移植（GIFT）和合子輸卵管內(nèi)移植（ZIFT） D的患者，本品可刺激多卵泡發(fā)育。1. 基本要求1.1設(shè)施與生產(chǎn)質(zhì)量管理按中國藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范要求實施。1.2原料及輔料應(yīng)符合現(xiàn)行中華人民共和國藥典2005版二部或中國生物制品主要原 輔材料質(zhì)控

2、標準的要求。未納入上述標準的化學(xué)試劑，應(yīng)不低于化學(xué)純。1.3生產(chǎn)用水生產(chǎn)用水源水應(yīng)符合飲用水標準，純化水及注射用水應(yīng)符合現(xiàn)行 中華人民 共和國藥典2005版二部標準。1.4生產(chǎn)用器具直接用于生產(chǎn)的金屬或玻璃等器具，應(yīng)經(jīng)過嚴格清洗及去熱原質(zhì)處理或滅菌 處理。2. 制造2.1工程細胞名稱及來源重組人促卵泡激素工程細胞系由帶有人促卵泡激素a和B鏈基因的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的CHO-K1細胞系。種子庫建立、傳代及保存從原始細胞庫的細胞傳代，擴增后凍存于液氮中，作為主細胞庫；從主細胞 庫傳代，擴增后凍存于液氮中，建立工作細胞庫。每次傳代不超過批準的代次。 細胞系凍存于液氮中，檢定合格后方可用于生產(chǎn)。主細胞庫及

3、工作細胞庫細胞的檢定應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)用動物細胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”規(guī)定。2.131外源因子檢查細菌和真菌（附錄XII A）、支原體（附錄XII B）、病毒檢查（附錄XII C）。細胞鑒別實驗應(yīng)用同工酶分析、生物化學(xué)、免疫學(xué)、細胞學(xué)和遺傳學(xué)標記物等任一方法進 行鑒別，應(yīng)為典型CH&田胞。2.133重組人促卵泡激素表達量應(yīng)不低于原始細胞庫細胞表達量。2.2原液細胞的復(fù)蘇與擴增從工作細胞庫來源的細胞復(fù)蘇后，于無血清、無蛋白培養(yǎng)基中進行傳代和擴 增，供轉(zhuǎn)瓶或細胞培養(yǎng)罐接種用。細胞培養(yǎng)液生產(chǎn)用培養(yǎng)液應(yīng)不含血清、蛋白質(zhì)。細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)全過程應(yīng)嚴格按照無菌操作，細胞培養(yǎng)時間根據(jù)細胞生長情況而定

4、。分離純化收集的培養(yǎng)液經(jīng)過超慮法進行濃縮，經(jīng)多步色譜純化后得到高純度的重組人 促卵泡激素，即為重組人促卵泡激素原液。除菌過濾后保存于適宜溫度，并規(guī)定 其有效期。原液檢定按照3.1項進行。2.3半成品配置與除菌原液加入適宜的穩(wěn)定劑，并用緩沖液稀釋。除菌過濾后即成半成品。半成品檢定按照3.2項進行。2.4成品分批應(yīng)符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。242分裝及凍干應(yīng)符合“生物制品分裝和凍干規(guī)程”規(guī)定。半成品應(yīng)及時分裝、冷凍，凍干 的全過程中，制品的溫度應(yīng)不高于 30 C。243規(guī)格75IU/ 瓶。244包裝應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。3檢定3.1原液檢定性狀應(yīng)為無色澄明液體鑒別在氧化亞基項下記錄的

5、色譜圖中，供試品主峰保留時間應(yīng)與對照品 一致。在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品主峰的保留時間應(yīng)與對照 品一致。肽圖（至少每半年測定一次）取本品，照附錄1測定，肽圖譜應(yīng)與對照品一致。N末端氨基酸序列（至少每一年測定一次）：將本品烷基化處理， 再經(jīng)HPLC分離純化得到、鏈后，通過Edman降解法測序，兩條鏈N末端15 個氨基酸序列分別為： 鏈：A-P-D-V-Q-D-C-P-E-C-T-L-Q-E-N ， 鏈： N-S-C-E-L-T-X-I-T-I-A-I-E-K-E，其中X代表未測出氨基酸，可能有修飾？。檢查3.1.3.1 等電點取本品，照附錄2測定，等電點主區(qū)帶應(yīng)在3.5-5.5之間，供

6、試品主區(qū)帶應(yīng) 與對照品一致？。解離亞基取本品（1.0 mg/ml） 50ul，力卩2非還原上樣緩沖液50ul,混勻即得供試品 溶液；取上述供試品溶液10ul，加入190ul 1非還原上樣緩沖液，混勻后100C 加熱5分鐘，放冷即得對照溶液（供試品溶液 5%）。依法（藥典2005版三部， 附錄IV C,考馬斯亮藍法），用非還原SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測，分離 膠濃度為12.5%，供試品溶液和對照溶液各取 20ul ;考馬斯亮藍染色，凝膠成像 儀掃描記錄結(jié)果。供試品中解離亞基條帶顯色應(yīng)不深于對照溶液中的解離亞基條 帶（5%）。3.133氧化亞基照高效液相色譜法（中國藥典2005年版三部，附錄

7、III B ）測定。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：用 Vydac Protein and Peptide C4柱 （25cmX4.6mm，5um,或同等產(chǎn)品），以0.1mol/L TEAP緩沖液（取 85%磷酸 6.75ml,加水 950ml，用三乙胺調(diào) pH 值至 6.00 ±.05,加水至 1000ml，0.45um 濾膜濾過，放置24小時后使用）為流動相 A，乙腈為流動相B, 0.1%三氟乙酸 的80%乙腈溶液為流動相 C （洗柱液）；流速為1.0ml/min;柱溫為40C；檢測波長為214nm。梯度程序為：時間（min）A %B%C%08614056722805700100720

8、01007386140取本品（0.5mg/ml） 200，加入1%雙氧水溶液4訕，反應(yīng)30分鐘即為系統(tǒng) 適用性試驗用樣品溶液，取 20訕注入液相色譜儀，記錄色譜圖。 相對a亞基保 留時間約為0.86的雜質(zhì)峰即為氧化亞基峰。測定法：取本品（0.5mg/ml）? 20山注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按峰面 積歸一化法計算，氧化亞基含量不得高于總蛋白量的10%。聚合體取本品原液濃度不定？（0.1mg/ml） ? 80山，加入5X非還原樣品緩沖液20門混勻作為供試品溶液；取供試品溶液適量，用1X非還原樣品緩沖液稀釋為供試 品溶液的2%,作為對照品溶液。取供試品溶液與對照溶液各25門依法檢查（藥 典200

9、5版三部，附錄IV C銀染法）,分離膠濃度為12.5%。對照品條帶應(yīng)顯色， 供試品中聚合物帶的顯色應(yīng)不深于對照品的主帶（2%）03.135唾液酸含量精密配制濃度分別為 Oug/ml、40ug/ml、80ug/ml、120ug/ml、160ug/ml、 200ug/ml的唾液酸對照品作標準曲線；取本品，依法測定（藥典 2005版三部， 附錄VI E ）,唾液酸含量應(yīng)為1.41-12.84%?范圍太大？。紫外光譜掃描取本品適量，用原液空白溶劑（10mM PB 0.1M NaCl）稀釋為200ug/ml,以 空白溶劑為參比，在波長230330nm范圍，依法（藥典2005版三部，附錄II A） 檢查。

10、最大吸收波長應(yīng)在276±3nm處。宿主DNA殘留量取本品，依法測定（藥典2005版三部，附錄IX B ），每劑量重組人促卵泡 激素應(yīng)不高于100pg。CHO細胞蛋白殘留取本品，照CHO宿主細胞蛋白ELISA檢測試劑盒（Cygnus）方法測定，分 別用樣品稀釋液稀釋至1mg/ml作為供試品溶液；取200ng/ml CHO宿主蛋白標 準品溶液50ul，并加入200ul供試品溶液，作為回收率實驗溶液。按照試劑盒說 明書進行操作。每1mg重組人促卵泡激素中CHO宿主蛋白殘留不得過25ng。鼠IgG殘留量測定取本品，依法測定（藥典2005版三部，附錄IX L ），每劑量重組人促卵泡 激素中鼠I

11、gG殘留應(yīng)不高于10ng。細菌內(nèi)毒素依法測定（藥典2005版三部，附錄XII E凝膠限量試驗），每1mg重組人促 卵泡激素應(yīng)不高于10EU。含量測定取重組人促卵泡激素對照品適量，用水制成每1ml含有0.1mg的溶液作為對 照品溶液。照高效液相色譜法（中國藥典2005版三部，附錄III B ）測定。用TSK gel G-2000SWXL （30cmX7.8mm I.D.）或其它相應(yīng)的色譜柱；以磷酸鹽緩沖液（取85% H3PO4 6.74ml,加水 800ml,再加 Na2SO4 14.2g,用 50% NaOH 調(diào) pH 至6.70 ±05,用水定溶為1000ml后抽濾）為流動相；流速

12、為1.0ml/min ;檢測波長 為214nm。取對照品20卩,注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以人促卵泡激素峰計， 理論塔板數(shù)應(yīng)不小于1000;另取供試品適量注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外 標法計算，即得。生物活性測定取本品依法檢定（中國藥典2005版二部，附錄XII M卵泡刺激素生物測定 法檢定），每1mg重組人促卵泡激素生物活性應(yīng)不低于 9000IU。3.2半成品檢定細菌內(nèi)毒素檢查依法（藥典2005版三部，附錄XII E凝膠限量試驗）檢查，每6舊？重組 人促卵泡激素不得過2EU ?含量測定按照成品含量測定項下方法進行，根據(jù)結(jié)果對半成品分裝體積進行微調(diào)， 保證成品蛋白含量。3.3成品檢定性狀

13、本品為白色疏松體。復(fù)溶后為無色澄明液體。鑒別試驗在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品主峰的保留時間應(yīng)與對照品峰的保留時間一致。供試品、抗體如何配制？依法檢定（藥典2005版三部，附錄VHI B， 免疫斑點法），應(yīng)符合規(guī)定？。3.3.3. 檢查復(fù)溶時間取本品，每支加注射用水0.5ml溶解，溶解時間不得過2分鐘。不溶性微粒取本品，用注射用水溶解后，依法（中國藥典 2005年版二部附錄IX C） 檢查，每瓶中10 m以上的微粒不得過6000粒；25 m以上的微粒不得過600粒。3.333水分取本品，依法（藥典2005版三部，附錄VII D第一法B庫侖滴定法）檢 查，含水分不得過3.0%。酸堿度取本品

14、，每支加附帶注射用水？ 0.5mI溶解，依法（藥典2005版三部，附 錄V A）檢查，pH應(yīng)為6.5- 7.5。聚合體取本品，每瓶加入80 pl注射用水溶解，加入5X非還原樣品緩沖液20卩， 混勻作為供試品溶液；取供試品溶液10P，加1冷E還原樣品緩沖液490訕作為對照溶液。取供試品溶液與對照溶液各25 依法檢查（藥典2005版三部，附錄IV C銀染法）對照溶液條帶應(yīng)顯色，供試品中聚合物帶的顯色應(yīng)不深于對照 溶液的主帶顏色（2%）。氧化亞基色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗照高效液相色譜法（中國藥典2005年版三部，附錄III B ）測定。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：用 Vydac Protein and

15、 Peptide C4柱 （25cmiX4.6mm, 5um,或同等產(chǎn)品），以0.1mol/L TEAP緩沖液（取 85%磷酸 6.75ml,加水 950ml，用三乙胺調(diào) pH 值至 6.00 ±.05,加水至 1000ml，0.45um 濾膜濾過，放置24小時后使用）為流動相 A，乙腈為流動相B，0.1%三氟乙酸 的80%乙腈溶液為流動相C （洗柱液）；流速為1ml/min ;柱溫為40C ；檢測波 長為214nm。梯度程序為：時間（min）A %B%C%0861405672280570010072001007386140取本品（0.5mg/ml）?200pl，加入1 %雙氧水溶液

16、4訕，反應(yīng)30分鐘即為系統(tǒng)適用性試驗用樣品溶液,取20 p注入液相色譜儀，記錄色譜圖。相對a亞基保留時間約為0.86的雜質(zhì)峰即為氧化亞基峰。需確認！測定法 取本品適量，每瓶加水100J溶解，合并，混勻作為供試品溶液， 取供試品溶液200山注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按峰面積歸一化法計算，氧化 亞基不得過10%。336含量測定取重組人促卵泡激素對照品適量，用水制成每1ml含有0.03mg的溶液作為對照溶液。取本品，每瓶加水250 pl溶解作為供試品溶液，照高效液相色譜法（中 國藥典 2005 版三部，附錄 III B ）測定。用 TSK gel G-2000SWXL （30cmiX7.8mm I

17、.D.）或其它相應(yīng)的色譜柱；以磷酸鹽緩沖液（取85% H3PO4 6.74ml,加水800ml， 再加Na2SO4 14.2g，用50%NaOH調(diào)pH至6.70 ±.05,用水定溶為1000ml后抽 濾）為流動相；流速為1.0ml/min ;檢測波長為214nm。分別取對照品和供試品 100注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以人促卵泡激素峰計，理論塔板數(shù)應(yīng)不小于1000;按外標法計算，即得。重組人促卵泡激素含量應(yīng)為標示量的 90%110%。生物活性測定取本品，供試品、標準品如何配制？依法（藥典2005版二部，附錄XII M卵 泡刺激素生物測定法檢定），重組人促卵泡激素的生物活性應(yīng)為標示量的

18、 80% 150%。無菌檢查取本品，用注射用水溶解，依法（藥典2005版三部，附錄XII A膜過濾法） 檢查，應(yīng)符合規(guī)定。細菌內(nèi)毒素取本品，用注射用水溶解后，依法（藥典 2005版三部，附錄XII E凝膠限 量試驗）檢查，每支成品含細菌內(nèi)毒素不得過 5EU。異常毒性取本品，用注射用水溶解，依法（藥典 2005版三部，附錄VII F小鼠實驗 法）檢查，應(yīng)符合規(guī)定。4 保存、運輸及有效期低于室溫下保存及運輸，有效期暫定 2年。5使用說明應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。6.附錄6.1肽圖檢測方法儀器及耗材恒溫水浴、磁力攪拌器、小型凍干機、氮氣瓶、臺式離心機、透析袋（3-10kd ）、 超濾離心管（5

19、kd孔徑，4ml）、通風(fēng)櫥。試劑和溶液6.121 鹽酸胍溶液（6mol/L）稱取鹽酸胍14.3g至25.0ml容量瓶，加水溶解并定容，即得。6.1.2.2 TE 緩沖液（Tris，0.2mol/L ； EDTA 1mmol/L，pH8.3）稱取Tris 1.2g，EDTA 18.6mg加 40ml水溶解，用2mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.3，移入50ml容量瓶，用水定容。還原及?；噭}酸胍緩沖液：取鹽酸胍溶液1.2ml，TE緩沖液0.4ml，混勻即得（用前配 制）。DTT溶液（9.0mg/ml）:稱取DTT約9mg加入1.0ml鹽酸胍緩沖液，28C 保存。碘乙酸溶液（130mg/ml）:稱取碘

20、乙酸65mg加入0.5ml鹽酸胍緩沖液溶解， 用鋁箔避光保存，氮氣充封后存于-20 C。6.1.2.4 0.1% TFA 溶液取100ul TFA，加入100ml水中，室溫1月。6.1.2.5 含0.1% TFA的45匯腈溶液，28°C保存1月。6.1.2.6 V8 蛋白酶緩沖液（Tris-HCl 50mM，pH7.8）稱取 Tris 0.6g，溶于 80ml 水，2mol/L HCl 調(diào)節(jié) pH 至 7.8，定容至 100ml， 28C保存1月。6.1.2.7 流動相A: 5%乙青，0.1%TFA的水溶液。6.1.2.8 流動相B: 90%L腈，0.1%TFA的水溶液。樣品溶液制備

21、：6.131 對照品溶液制備：取果那芬對照品適量，用水透析后離心濃縮至濃 度約為3mg/m。6.132 供試品溶液制備：取原液，同法制備。去糖基化6.141 取對照品和供試品各150ul，加入20ul 10 PNGaseF緩沖液，按照 說明書要求分別加入6ul SDS/ -巰基乙醇溶液和6ul NP-40溶液，混勻后加入 5ulPNGaseF酶，30C保溫 24 小時。6.1.4.2 100 C處理10分鐘滅活糖苷酶。6.1.4.3 加水稀釋至4ml,用4ml超濾離心管離心除鹽，并縮小體積至200ul 并干燥樣品。還原烷基化6.1.5.1 還原：將干燥樣品回溶于200ul鹽酸胍緩沖液中，加入1

22、00ul DTT 溶液，氮氣流處理，封口后37C反應(yīng)1小時。6.1.5.2 烷基化：在上述樣品管中加入 20ul碘乙酸溶液，氮氣流處理，封 口后37T反應(yīng)1小時，加入300ul 0.1%TFA容液終止反應(yīng)。再加入 30ul -巰基 乙醇，通風(fēng)櫥內(nèi)操作，室溫反應(yīng)15min。用水透析脫鹽后凍干樣品。6.1.6 V8蛋白酶切6.1.6.1 蛋白酶溶液制備：取酶適量，用水溶解制備為1mg/ml。6.1.6.2 取凍干樣品，每管加入300ul蛋白酶緩沖液(Tris-HCl 50mMpH7.8) 回溶，加入15ul蛋白酶溶液，37T反應(yīng)16小時。6.1.7 RP-HPLC 分析色譜柱：C18, 300?、

23、5 m 4.6 250mm色譜條件：波長：214nm 流速：1.0ml/min ;柱溫：30C，進樣量：180ul/針。洗脫條件：T (min)流動相A (%流動相B(%)0100 01001580204565356040606101007001007110006.1.8觀察結(jié)果。6.2等電點測定6.2.1 主要儀器：Pharmacia平板電泳儀（或者同等產(chǎn)品）、電泳冷卻板、制膠模具。622主要試劑：丙烯酰胺、N 甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（SDS）、 過硫酸氨（AP）、TEMED、pl等電點標準蛋白marker、載體兩性電解質(zhì)pH®10、 甲基紅。溶液配制丙烯酰胺貯液稱取丙烯酰

24、胺5.0g，甲叉雙丙烯酰胺0.15g，加水溶解，定容至50ml,濾 紙過濾。623.2電極液陽極液:1mol/L磷酸溶液（取濃磷酸3.2ml，加水至50ml）;陰極液:1mol/L NaOH溶液。6.2.3.3 50% 甘油稱取甘油50g加水混合均勻后定容至100ml。6.2.3.4 甲基紅指示劑稱取甲基紅0.1g，加入7.4ml NaOH（0.05mol/L）使之溶解，加水定容至200ml。6.2.3.5 固定液（10%TC）稱取三氯乙酸10g，加水溶解，用水定容至100ml。6.2.3.6 脫色液取甲醇25ml，乙酸5ml，加水至100ml。6.2.3.7 染色液稱取考馬氏亮藍R-250

25、0.1g，用脫色液定容至100ml6.238 0.025mol/L磷酸緩沖液 pH7.0溶液A: NaHPO 12HO18.81g，加水溶解并定溶于100ml。溶液B:檸檬酸 鈉2HO 2.39g，加水溶解并定溶于100ml。取溶液A 82.4ml，溶液B 17.6ml， 混勻，取25ml加水至1000ml即得。操作步驟凝膠制備：按照下表進行配制10%丙烯酰胺貯液2.5ml載體兩性電解質(zhì)0.35ml50%甘油0.5ml水1.25ml10%APS25 lTEMED6 l6.2.4.2樣品制備處理依具體情況而定，如果供試品和對照品溶液鹽濃度過高， 應(yīng)先透析或過濾除 鹽。樣品濃度制成0.52.0mg

26、/ml。分別取供試品及對照品溶液各10 l，加入兩性 電解質(zhì)2 l，加入甲基紅試液0.5 l。6.2.4.3 電泳6.243. 1 點樣：將濾紙片剪成0.5cmX).5cm大小，排放在凝膠上，分別將樣品、對照品及等 電點標準液各10 l點在濾紙上。6.2.4.3. 2 預(yù)電泳：開機預(yù)冷電泳槽冷卻板，在冷卻板中央滴加石蠟油，將載膠的支持膜鋪在油 上, 6C預(yù)冷30min;將電極條分別用陰、陽極電極液充分濕潤，吸去多余電極 液后平行置于凝膠兩端。將電極壓在電極條上，200V預(yù)電泳20min。6.2.4.3. 3 電泳：200V恒壓20min，然后根據(jù)情況調(diào)整電壓，直至電流不再降低為止。6.2.4.

27、4 顯色膠片于固定液中固定 3060mi n；于脫色液中平衡20mi n；于染色液中染色2060mi n。最后于脫色液中脫色至本底無色625觀察結(jié)果根據(jù)等電點標準蛋白判斷樣品等電點注射用重組人促卵泡激素制造及檢定規(guī)程起草說明我公司研制生產(chǎn)的注射用重組人促卵泡激素（rhFSH）,是利用中國倉鼠卵 巢（CHO）細胞分泌型表達技術(shù)，使目的蛋白直接分泌于培養(yǎng)基中，經(jīng)過一系 列的下游純化及凍干等工藝步驟和嚴格的質(zhì)量檢驗而獲得的真核基因工程產(chǎn)品。 為了獲得高質(zhì)量的基因工程重組人 FSH產(chǎn)品，在制備和檢定過程中，我們按中 華人民共和國藥典（2005版）和中國生物制品規(guī)程（2000版）對生物制品 質(zhì)量控制要點

28、的要求，結(jié)合連續(xù)中試生產(chǎn)的三批樣品（批號：2005070120050702、 20050703）的質(zhì)量研究結(jié)果，參照同類進口產(chǎn)品果納芬質(zhì)量標準，起草了重組人促卵泡激素原液和成品的檢定規(guī)程，現(xiàn)說明如下：1 .重組人促卵泡激素原液1.1性狀根據(jù)中試產(chǎn)品質(zhì)量研究結(jié)果，三批注射用重組人促卵泡激素原液均為無色澄 清液體，無肉眼可見不溶物。由于本品為注射劑，依據(jù)中華人民共和國藥典 2005版二部對注射劑標準的要求，規(guī)定本品為無色澄清液體，不得含有肉眼可 見不溶物。1.2鑒別本產(chǎn)品含量和氧化亞基項目的檢查都采用了 HPLC的方法，在此基礎(chǔ)上，我 們通過將待測樣品與對照品保留時間的對比，清晰的反應(yīng)出了蛋白質(zhì)的

29、性質(zhì)，對 產(chǎn)品進行了可靠的鑒別，三批注射用重組人促卵泡激素原液的主峰保留時間與對 照品主峰保留時間均一致1.3肽圖為了確證產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的正確性，我們規(guī)定至少每半年進行一次產(chǎn)品的肽圖譜分 析。由于重組人促卵泡激素是一種真核細胞為宿主表達的經(jīng)糖基化修飾的蛋白， 我們通過糖酶和TPCK處理的胰蛋白酶先后作用待測樣品和對照品，將其蛋白鏈 分解成若干肽段，然后利用 RP- HPLC進行了有效地分離，結(jié)果表明三批注射用 重組人促卵泡激素原液肽圖譜與 果納芬？對照品完全一致。1.4等電點根據(jù)文獻報道 ，重組人促卵泡激素的等電點主區(qū)帶應(yīng)在4.0-5.2之間。而在我們建立的等電聚焦電泳系統(tǒng)結(jié)果分析表明，三批注射用重

30、組人促卵泡激素原液與果納芬對照品的主區(qū)帶分布一致，均在3.5-5.5之間1.5 N 末端氨基酸序列為了確證產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的正確性，我們規(guī)定至少每年測定一次產(chǎn)品的N 末端15個氨基酸序列。將本品烷基化處理，再經(jīng)HPLC分離純化得到、鏈后，通過Edman降解法測序，兩條鏈N末端15個氨基酸序列分別為：鏈：A-P-D-V-Q-D-C-P-E-C-T-L-Q-E-N，鏈：N-S-C-E-L-T-X-I-T-I-A-I-E-K-E ，其中 X 代表未測出氨基酸，可能有修飾。這與文獻報道的理論序列是相同的1.6解離亞基依法（藥典2005版三部，附錄IV C,考馬斯亮藍法），用非還原SDS-聚丙 烯酰胺凝膠電泳法

31、檢測，考馬斯亮藍染色，凝膠成像儀掃描記錄結(jié)果，同法參考 果納芬的檢定標準，將解離亞基的含量定為小于 5%。1.7氧化亞基重組人促卵泡激素的氨基酸結(jié)構(gòu)中含有六個甲硫氨酸殘基，容易受到氧化， 產(chǎn)生無活性的氧化產(chǎn)物。實測三批原液氧化亞基的含量都在1 5%之間，我們參考果納芬對此項的要求為不得高于總蛋白量的10%,所以起草標準同果納芬進口注冊標準。1.8聚合體重組人促卵泡激素由兩條鏈以非共價連接的形式構(gòu)成，很容易形成高分子聚合物。我們參考果納芬對此項的檢定方法，結(jié)合三批原液高分子含量檢定結(jié)果， 將聚合體含量的標準規(guī)定為不得高于總蛋白量的2%01.9唾液酸含量根據(jù)文獻報道，重組人促卵泡激素唾液酸含量能夠

32、直接的反應(yīng)其糖基化修飾 的程度，而糖基化修飾又與蛋白的活性密切相關(guān)。我們建立了C18RP-HPLC分析唾液酸含量的方法，對三批原液進行的檢定，結(jié)果分別為：7.717%、7.824%、7.679%，所以將重組人促卵泡激素原液唾液酸含量規(guī)定為5 15%1.10紫外光譜掃描依法（藥典2005版三部，附錄II A ）檢查，重組人促卵泡激素三批原液與果納芬對照品的吸收譜圖一致，最大吸收波長應(yīng)在276±3nm處1.11宿主DNA殘留量依法（藥典2005版三部，附錄IX B ）測定，三批重組人促卵泡激素每劑量 重組人促卵泡激素應(yīng)不高于100pg。1.12 CHO細胞蛋白殘留照CHO宿主細胞蛋白EL

33、ISA檢測試劑盒（Cygnus）方法測定，三批重組人 促卵泡激素原液的殘留量值分別為：1.650ng/mg、1.114ng/mg> 1.194ng/mg。所 以規(guī)定每mg重組人促卵泡激素中CHO宿主蛋白殘留不得過25ng。1.13鼠IgG殘留量測定本產(chǎn)品的生產(chǎn)純化工藝中，有針對重組人促卵泡激素的單克隆抗體親和層 析，所以產(chǎn)品中不可避免會有一些鼠源IgG殘留。依法（藥典2005版三部，附 錄IX L）測定，三批重組人促卵泡激素原液的鼠源IgG殘留量分別為0.602 ng/劑量、0.750 ng/劑量、0.869ng/劑量，所以規(guī)定每劑量重組人促卵泡激素應(yīng)不高 于 10ng。1.14細菌內(nèi)毒

34、素依法（藥典2005版三部，附錄XII E凝膠限量試驗）測定，三批重組人促 卵泡激素原液的細菌內(nèi)毒素都小于 5EU/mg，所以規(guī)定每1mg重組人促卵泡激素 應(yīng)不高于10EU。1.15比活測定參考果納芬的含量檢測方法進行定量，按照藥典2005版二部，附錄XII M卵 泡刺激素生物測定法檢定生物活性，三批重組人促卵泡激素原液的比活性都在 12000- 13000IU/mg之間，所以規(guī)定每1mg重組人促卵泡激素生物活性應(yīng)不低 于 9000IU10000IU/mg ?2.注射用重組人促卵泡激素2.1鑒別試驗結(jié)合含量檢定項下保留時間與免疫學(xué)性質(zhì)分析，提供了穩(wěn)定可靠的鑒別實驗 方法，三批重組人促卵泡激素成品與果納芬的 SEC-HPL（保留時間一致，而且免 疫斑點法結(jié)果都呈陽性。2.2檢查外觀隨機抽取三批重組人促卵泡激素成品觀察，外觀都為白色凍疏松體，且復(fù)溶后都為無色澄明液體。222復(fù)溶時間隨機抽取三批重組人促卵泡