聚乳酸膜表面靜電自組裝單抗與殼聚糖復合膜層的研究

1、聚乳酸膜表面靜電自組裝單抗與殼聚糖復合膜層的研究摘 要: 本文以聚乳酸（PLA）膜為基底，利用氨解反應及靜電層層自組裝技術，使抗血小板膜糖蛋白單克隆抗體SZ-21 和殼聚糖交替吸附于膜表面， 形成復合層狀結構，并利用掃描電鏡、紅外光譜檢測、接觸角檢測考察和跟蹤組裝過程，最后采用血小板黏附實驗、溶血率實驗以及內皮細胞黏附實驗進一步考察復合層的血液相容性和細胞相容性。相關實驗結果表明經過氨解反應可以成功將自由氨基接枝于PLA 表面，單克隆抗體藥物和殼聚糖能夠通過靜電層層自組裝技術在聚乳酸膜表面構建復合涂層，經過改性后的涂層結構具有良好的血液相容性和細胞相容性。本研究材料可能為新型藥物血管支架提供選

2、擇。關鍵詞：靜電自組裝；單抗SZ-21；殼聚糖；聚乳酸1 引言目前針對栓塞性心血管疾病，介入治療已經成為最主要的治療手段，藥物洗脫支架（DrugEluting Stents,DES）更以其疏通栓塞部分血管，有效防止血管的再狹窄的功能得到廣泛應用。但是隨著臨床數(shù)據(jù)的積累，藥物支架植入后出現(xiàn)支架血栓癥，特別是晚期血栓的問題也漸漸顯露出來1-6。支架血栓癥的發(fā)生機理涉及很多影響因素7，在支架植入過程中，高壓球囊對血管內皮造成機械性損傷，支架周圍血流形成湍流從而改變剪切力，支架作為異物植入，都會造成血小板的粘附，聚集和激活8。血小板的粘附和聚集是形成血管內再狹窄的重要因素之一9。另外，早期支架的藥物選

3、擇也使得支架在抑制平滑肌細胞增殖和遷移的同時，對內皮細胞的遷移和增殖也起到了抑制作用，延遲了損傷修復的時間10。因此，持續(xù)的抗血小板治療和促進再內皮化是未來藥物支架的研究重點。藥物支架主要由金屬支架基底，聚合物涂層，以及結合的藥物三部分組成。在涂層多聚物的選擇中，聚乳酸（PLA）以其柔韌性和可降解性從而應用廣泛。但聚乳酸也并非完美，其具有疏水性，且表面缺乏生物活性物質，不利于細胞的結合與生長11。在對聚乳酸改性的方法中，靜電層層自組裝技術以其條件溫和，工藝簡單，成膜物質豐富越來越得到人們的重視，并且這種方法可以用于任何形狀的基底12，這對于具有復雜三維結構的血管支架，有不可代替的意義。血小板糖

4、蛋白ba 受體與纖維蛋白原或者vWF 因子結合是血小板聚集過程中最后的共同途徑，抗血小板膜糖蛋白單克隆抗體SZ-21 是一種血小板GPb/a 拮抗劑，它能阻斷血小板GPb/a 與纖維蛋白原的結合，從而防止血小板的聚集13。殼聚糖是一種具有良好生物相容性、可降解性及生物學活性的高分子材料，具有選擇性組織再生、促進創(chuàng)面愈合、預防組織粘連的作用14、15。另外，已有研究表明，一定濃度的殼聚糖能夠抑制平滑肌細胞的增殖，同時促進內皮細胞的生長16，這為殼聚糖在臨床用于防治術后再狹窄提供了依據(jù)。本文基于以上理論基礎，用PLA 薄膜為基底，模擬支架表面噴涂的聚乳酸涂層，首先利用氨解反應使PLA 表面接枝自由

5、氨基，并以其攜帶正電荷為動力，將單克隆抗體SZ-21和殼聚糖用靜電層層自組裝的方式交替吸附在膜層表面，形成復合層狀結構。并對其進行血液及細胞相容性的檢測。2 方法2.1 材料與儀器聚乳酸膜（濟南岱罡生物科技有限公司，厚度0.05mm，分子量100 萬），殼聚糖（sigma公司,脫乙酰度85%），單抗SZ-21（國產，由江蘇血液研究所提供），改良型1640 培養(yǎng)基（HyClone 公司），BSA（solabio 公司，Albumin Bovine V），DAPI 染色液（beyotime 公司），其他試劑均為國產分析純。紫外分光光度計（Beckman DU800），高速離心機（eppendorf

6、 5804R），離心機（eppendorf 5417R），傅立葉變換紅外光譜儀（美國PE Lambda900），掃描電子顯微鏡（TESCAN VEGA2），接觸角測試儀(翰光高科技有限責任公司 臺灣)，熒光顯微鏡（OlympusIX81）。2.2 氨基化膜的制備將聚乳酸膜剪成10mm10mm 的方塊，浸入體積比為1:1 的乙醇：水中浸泡2h，以去除表面油脂，用蒸餾水沖洗干凈后自然晾干。再將膜置于濃度為6mg/ml 的1，6-己二胺/正丙醇溶液中，于40下反應30 分鐘，用大量去離子水充分漂洗，去除殘留的己二胺，于30真空干燥箱中干燥至恒重。2.3 氨基化膜的測試與表征分別對未經處理的PLA 膜

7、和氨解反應后的PLA 膜測定傅立葉變換紅外吸收光譜（FTIR），了解氨解反應過程對PLA 膜的影響。2.4 生物活性物質的組裝血小板膜糖蛋白IIb/IIIa 單克隆抗體SZ-21 的等電點（PI）為8.0 到8.1 左右（中國科學院上海生命科學研究院，蛋白質組學研究分析中心測定）。將氨基化膜于室溫下在0.012mol/L 鹽酸溶液中酸化15min，以穩(wěn)定其表面正電荷，用大量三蒸水沖洗以去除表面吸附的鹽酸，然后將酸化后的膜在濃度為1mg/ml 的血小板膜糖蛋白IIb/IIIa 單克隆抗體SZ-21 的碳酸鹽緩沖溶液(CBS，pH=9)中浸泡1h，先用pH=9 的CBS沖洗，再用三蒸水漂洗，然后浸

8、入到殼聚糖/乙酸溶液中(0.1%(g/ mL) ，0.1 mol/L Hac)浸泡30 分鐘，先用0.6%(體積分數(shù))的乙酸溶液漂洗，再用三蒸水漂洗，重復以上步驟數(shù)次，制備出組裝膜。2.5 組裝膜表面的測試與表征將 PLA 膜，氨基化膜，以及組裝膜干燥，噴金，用掃描電子顯微鏡(Scanning ElectronMicroscope，SEM)觀察，評價氨解，組裝過程對聚乳酸表面形貌的影響。對PLA 膜，氨基化膜，以及組裝過程中每個循環(huán)的吸附，清洗，干燥后，用淌滴法對膜表面進行靜態(tài)水接觸角分析。儀器所配置的相機將三蒸水滴在材料表面的形狀記錄，并通過軟件進行處理。測試液滴的體積為5L，靜置15s 后

9、測定。每個表面取3 個樣本，每個樣本上選取3 個不同的點測試，取平均值。2.6 血小板粘附實驗從家兔耳緣靜脈采血并按9:1 的比例加入3.8%的枸櫞酸鈉，在22下以轉速1200r/min離心10min，取上清液，得到富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）。將PRP 分別覆蓋在組裝前后的膜材料表面，于細胞培養(yǎng)箱中37孵育1 小時。然后用PBS（pH=7.4）清洗樣品3 次，在4下用2.5%戊二醛固定12 小時，用50%、75%、85%、95%、100%梯度的乙醇相繼脫水15min，冷凍干燥，噴金，用SEM 觀察。2.7 溶血率實驗將新鮮兔血按9:1 的比例加入3.8%枸

10、櫞酸鈉配成抗凝血，將試樣放入具塞玻璃試管，加生理鹽水10ml，在37水浴中預熱30min，然后加入0.2ml 抗凝血，輕輕混勻，37水浴保溫60min，將管中液體轉入15ml 離心管，用高速離心機以轉速3000r/min 離心5min。在相同實驗條件下，分別用10ml 生理鹽水和10ml 蒸餾水加抗凝血0.2ml，作為陰性和陽性對照。吸取離心后的上層清液，測定在545nm 波長處的吸光度值，每種處理設置2 個平行樣品，每個樣品測3 次，取平均值。計算溶血率，公式如下：%=（Dt-Dnc）100/( Dpc-Dnc) 為溶血率，Dt 為樣品吸光度值，Dnc 為陰性對照吸光度值，Dpc 為陽性對照

11、吸光度值。2.8 內皮細胞粘附實驗將試樣鋪平放入滅菌24 孔板，紫外照射過夜，取生長狀態(tài)良好的人臍靜脈內皮細胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC），以6104/ml 的密度接種在放有試樣的孔中，于37，5%CO2，1640 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）中培養(yǎng)。將試樣分別于培養(yǎng)24h和48h 后，先用PBS 漂洗三次，然后用4%多聚甲醛于4下固定10min，再用PBS 洗三次，每次5min，用1%BSA 常溫封閉30min，PBS 清洗，用DAPI 染色液室溫染色5min，最后用PBS 清洗2 次，樣品用熒光顯微鏡檢測。3 結果與分析3.1

12、紅外光譜分析（FTIR）由于 PLA分子中存在酯基-COO-，氨解反應時這些酯基可以與己二胺中的一個-NH2反應而斷裂形成酰胺鍵，同時產生一頭帶-OH 的副產物。清洗掉副產物和游離的己二胺后，得到表面接枝有自由氨基的，即氨基化的PLA 膜。由圖1 可看到，以未氨解的PLA 譜圖（圖中虛線部分）作為參照，氨解后的PLA 膜（圖中實線部分）在4000cm-12500cm-1 的特征官能團區(qū)的吸收譜帶明顯增寬，原因是氨解反應產生的酰胺鍵大多形成氫鍵，而氫鍵會在該區(qū)域形成較寬的譜帶。在1680cm-1 左右，氨解后PLA 膜的譜圖上，出現(xiàn)一個弱的吸收峰（圖中箭頭所指處），這是由-NH-形成的變形振動峰

13、。說明通過氨解反應，氨基被共價鍵合在PLA 表面。3.2 氨解反應及靜電層層組裝對PLA 膜表面形貌的影響由圖 2 可見，與氨解前的PLA 膜光滑的表面形貌相比，氨解后的PLA 膜發(fā)生明顯的褶皺現(xiàn)象，粗糙度增大，而在組裝10 層單抗SZ-21 和殼聚糖之后，膜表面的細微褶皺基本被覆蓋，粗糙度在很大程度上降低。分析原因是在氨解反應過程中，PLA 分子鏈大量斷裂，有一部分形成的較短的一端帶氨基的分子重新排列，另一部分則被分解下來，于是材料表面形成空缺和縫隙，以褶皺的形式表現(xiàn)。通過10 層靜電組裝后，殼聚糖和單抗SZ-21 分子幾乎可以完全覆蓋基底表面，填補氨解反應在膜層表面形成的空隙和皺褶，使得粗

14、糙的表面變得較為平整（smooth out）。3.3 氨解及組裝對PLA 親疏水性的影響材料表面的靜態(tài)水接觸角是由其親疏水性和成膜狀態(tài)決定的。由圖3 可見，PLA 的接觸角將近90，疏水性較強，這將不利于細胞的粘附和生長。經過氨解反應后，材料表面的接觸角顯著減小，達到75左右，是因為PLA 表面接枝的自由氨基使材料表面的親水性增強，且粗糙度的增加也會影響接觸角。從第3 層以后是單抗SZ-21 和殼聚糖的交替組裝，可以看到接觸角的數(shù)值呈上下曲折波動的現(xiàn)象，且組裝單抗SZ-21 的膜層親水性要強于組裝殼聚糖的膜層。這種接觸角交替變化的現(xiàn)象可以說明單抗SZ-21 和殼聚糖已經被層層組裝于PLA表面。

15、而且從對數(shù)趨勢線可以看出，接觸角的整體變化呈減小趨勢，說明氨解反應及層組裝可以有效改善PLA 本身的疏水性，這對于提高PLA 的生物相容性，尤其是促進其表面的內皮化有著積極的意義。3.4 血小板數(shù)量及形態(tài)分析未改性的PLA 表面粘附有大量血小板，并且?guī)缀跛醒“宥加袀巫闵斐?，有不同程度的激活現(xiàn)象，如果這種材料進入人體血液循環(huán)系統(tǒng)中，會有發(fā)生血栓的危險，組裝有單抗SZ-21 和殼聚糖的PLA 表面，血小板數(shù)量明顯減少，且激活的比例降低，大部分血小板形態(tài)圓整，看不到偽足的伸出。這說明組裝的單抗SZ-21 和殼聚糖可以有效減少血小板的數(shù)量，并且抑制血小板的激活，降低血栓的危險。3.5 不同膜層表面

16、的溶血率測試結果由表 1 可知，未經處理的PLA 的溶血率為3.323%，組裝有單抗/殼聚糖復合涂層PLA的溶血率為2.412%，兩者均小于5%，滿足醫(yī)學標準所規(guī)定的植入物溶血率的要求。但組裝有單抗/殼聚糖復合涂層PLA 的溶血率低于未經處理的PLA 的溶血率，且經過SPSS17.0 單因素方差分析ANOVA，兩者之間的顯著性差異達到0.013（p0.05），說明單抗和殼聚糖的層組裝對于PLA 溶血率的改善具有顯著的效果。3.6 不同膜層表面的內皮細胞黏附及生長情況圖5 HUVEC 細胞在不同膜表面的生長情況(bar=50m，a:聚乳酸，24h；b: 聚乳酸，48h；c: 單抗/殼聚糖復合涂層

17、聚乳酸，24h；d：單抗/殼聚糖復合涂層聚乳酸，48h)材料表面的物理性質及含有的功能基團可以影響細胞在其表面的吸附和生長，由圖5可以看出，接種24h 后，未經處理的PLA 膜上的內皮細胞粘附數(shù)量較少，而具有單抗/殼聚糖復合涂層的PLA 表面含有生物大分子，細胞粘附數(shù)量較大，經過48h 培養(yǎng)后，組裝有單抗和殼聚糖的PLA 膜比未處理的PLA 表面的細胞數(shù)量多。說明單抗和殼聚糖的組裝不僅可以促進內皮細胞的粘附，也有利于內皮細胞的增殖。4 結論本文采用氨解及靜電自組裝技術，在PLA 表面接枝自由氨基，并以其正電荷為推動力，利用靜電層層自組裝技術使抗血小板膜糖蛋白單克隆抗體SZ-21 和殼聚糖交替吸

18、附于膜層表面。傅立葉變換紅外光譜實驗顯示氨解反應能夠將氨基以共價鍵合的方式接枝于PLA 表面，SEM 結果顯示，氨解后PLA 膜表面呈粗糙化現(xiàn)象，在組裝SZ-21 和殼聚糖后，膜表面的粗糙結構被覆蓋，重新變得平整。經過氨解及組裝過程，PLA 的親水性顯著增強，血小板吸附數(shù)量減少，溶血率降低，內皮細胞粘附數(shù)量增多，這些表征都有利于支架植入后降低再狹窄率及促進內皮新生的過程，本研究可能為今后研制新型藥物血管支架提供選擇。參考文獻1 Zhang F, Qian J, Ge J. Very late stent thrombosis in late stent malapposition after

19、sirolimus-eluting stentimplantationJ. Int Heart J. 2007,48(5): 591-596.2 Windecker S., Meier B. Late coronary stent thrombosisJ. Circulation, 2007, 116(17): 1952-1965.3 Daemen J., Kukreja N., van Twisk P.H., et al . Four-year clinical follow-up of the rapamycin-eluting stentevaluated at rotterdam ca

20、rdiology hospital registry J. Am J Cardiol , 2008 ,101 (8) : 1105-1111.4 Jaffe R, Strauss B.H. Late and very late thrombosis of drug-eluting stents: evolving concepts andperspectivesJ. J Am Coll Cardiol , 2007. 50(2): 119-127.5 Maisel W.H. Unanswered questions-drug-eluting stents and the risk of late thrombosisJ. N Engl J Med.,2007, 356(10): 981-984.6 Serruys P.W., Daemen J. Are drug-eluting stents associated with a higher rate of late thrombosis than baremetal stents? Late stent thrombosis: a nui