骨炎寧顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

1、    骨炎寧顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究【摘要】 目的建立骨炎寧顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 方法 采用薄層色譜(TLC)法對處方中的大血藤、天花粉、皂角刺、地榆等4種藥材進(jìn)行定性鑒別;采用高效液相色譜(HPLC)法測定骨炎寧顆粒中綠原酸的含量。結(jié)果在TLC色譜中均能檢出大血藤、天花粉、皂角刺、地榆，骨炎寧顆粒中綠原酸與其它組分良好分離，綠原酸濃度線性范圍在0.00250.04g（ r=0.999 9），樣品加樣回收率為99.60%， RSD=1.07%（n=6）。結(jié)論所建立的方法簡便可靠，重復(fù)性好，為骨炎寧顆粒的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。 【關(guān)鍵詞】 骨炎寧顆粒 綠原酸 薄層色譜

2、 高效液相色譜Study on the Quality Standard for Guyanning GranulesL Yi , CHEN Huating,LU Jinqing1.Department of Pharmacy, Union Hospital Affiliated with Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022 China;2.Hubei College of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430061 Ch

3、inaAbstract：ObjectiveTo establish a standard for the quality control of Guyanning Granules. MethodsCaulis sargentodoxae, Radix trichosanthis, spina gleditsiae and Radix sanguisorbae were identified by TLC. While HPLC was applied for the determination of chlorogenic acid in flos lonicerae in Guyannin

4、g Granules. Results The  chromatograms of caulis sargentodoxae, Radix trichosanthis, spina gleditsiae and Radix sanguisorbae were obtained through TLC presented the spots of the same colors with those in the corresponding places in the chromatograms of the control articles. There was a goo

5、d linear relationship within a range of 0.00250.04g of Paeoniflorin ,correlation coefficient r=0.9999,the average recovery was99.60%（n=6）, RSD=1.07%, (n=6). ConclusionThis method is simple ,feasible and reproducible and provides a method for quality control of Guyanning Granules.Key words：Guyanning

6、Granules； Chlorogenic acid； TLC； HPLC骨炎寧顆粒是華中 科技 大學(xué)協(xié)和 醫(yī)院 經(jīng)多年研制的純中藥復(fù)方制劑，由金銀花、赤芍、天花粉、大血藤等多味中藥加工制成，具有解熱止痛、活血消腫的功效，用于 治療 急慢性化膿性骨髓炎、關(guān)節(jié)炎、膿腫疔痛，療效顯著。本 研究 建立了TLC對制劑中的大血藤、天花粉、皂角刺、地榆等進(jìn)行定性鑒別，并采用高效液相色譜法測定處方中金銀花的活性成分綠原酸含量的方法，對控制骨炎寧顆粒質(zhì)量有重要意義。1 儀器與試藥1.1 儀器DIONEX-P680高效液相色譜儀， AT-201 電子  分析 天平（d=0.01mg，瑞士），

7、UP5200H超聲波清洗機(jī)（熊貓集團(tuán)南京電子計量有限公司）。1.2 試藥骨炎寧顆粒（華中科技大學(xué)協(xié)和醫(yī)院制劑室提供）；薄層層析硅膠板G型 (青島海洋化工廠)；綠原酸對照品（批號110753-200413）、大血藤對照藥材（批號121353200401）、瓜氨酸對照品（批號08759802）、皂角刺對照藥材（批號121210200501）、沒食子酸對照品（批號11083200302）均由 中國 藥品生物制品檢定所提供；乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純。實(shí)驗所用中藥飲片均購自武漢國藥集團(tuán)中藥飲片廠。2 方法與結(jié)果2.1 薄層色譜鑒別12.1.1 大血藤取本品研細(xì)，取粉末1 g，精密稱定，加甲醇50

8、 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加2氫氧化鈉溶液10 ml使溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2，用乙醚振搖提取3次，10 ml/次，合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇2 ml使溶解，作為供試品溶液。取陰性樣品研細(xì)，取粉末1 g，精密稱定，加甲醇50 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加2氫氧化鈉溶液10 ml使溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2，用乙醚振搖提取3次，10 ml/次，合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇2 ml使溶解，作為陰性樣品溶液。取本品粗粉1 g加甲醇50 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加2氫氧化鈉溶液10 ml使溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2，用乙醚振搖提

9、取3次，10 ml/次,合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇2 ml使溶解，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法2實(shí)驗，吸取上述3種溶液各5 l，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷丙酮甲酸（810.8）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2三氯化鐵乙醇溶液，供試品色譜中，在與對照藥材色譜在相應(yīng)的位置上，顯相同的顏色的斑點(diǎn)，陰性對照樣品則無此斑點(diǎn)。見圖1。2.1.2 天花粉取本品研細(xì)，取粉末1 g，精密稱定，加稀乙醇20 ml,超聲處理30 min，濾過，濾液作為供試品溶液。取陰性樣品研細(xì)，取粉末1 g，精密稱定，加稀乙醇20 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液作為陰性樣品溶液。取本品粉末1 g，精密稱定

10、，加稀乙醇20 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。取瓜氨酸對照品加稀乙醇使溶解，制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（附錄B）實(shí)驗，吸取前3種溶液各2 l及對照品溶液1 l，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇無水乙醇冰醋酸水（7224）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照樣品則無此斑點(diǎn)。見圖2。2.1.3 皂角刺取本品研細(xì)，取粉末1.2 g，精密稱定，加正丁醇15 ml，水浴加熱回流2 h，濾過，濾液于水浴上濃縮至5 ml，作為供試品溶液。取陰性樣

11、品研細(xì)，取粉末1.2 g，精密稱定，加正丁醇15 ml，水浴加熱回流2 h，濾過，濾液于水浴上濃縮至5 ml，作為陰性樣品溶液。取皂角刺對照藥材2.5 g，加入正丁醇50 ml，置水浴上加熱回流2 h，濾過，濾液于水浴上濃縮至5 ml，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法（附錄B）實(shí)驗，分別吸取3種溶液10 l，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷醋酸乙酯甲酸（1010.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1硫酸乙醇溶液，在紫外燈（365 nm）下檢視供試品色譜中，在與對照藥材色譜在相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照樣品則無此斑點(diǎn)。見圖3。2.1.4 地榆取本品研細(xì)，取粉末1 g，精

12、密稱定，加水20 ml，超聲處理20 min，放冷，離心，取上清液，用鹽酸飽和的乙醚振搖提取2次，20 ml/次，合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。取陰性樣品研細(xì)，取粉末1 g，精密稱定，加水20 ml，超聲處理20 min，放冷，離心，取上清液，用鹽酸飽和的乙醚振搖提取2次，20 ml/次，合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為陰性樣品溶液。取本品粉末2 g，加水20 ml,煮沸30 min，放冷，離心10 min，取上清液，用鹽酸飽和的乙醚振搖提取2次，15 ml/次,合并乙醚溶液，揮干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為對照藥材溶液。取沒食子酸對照品加甲醇制

13、成每毫升含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（附錄B）實(shí)驗，吸取前3種溶液各3 l，對照品溶液4 l，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯（用水飽和）醋酸乙酯甲酸（631）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品則無此斑點(diǎn)。見圖4。2.2 綠原酸的含量測定2.2.1 色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈0.4%磷酸水溶液（991）為流動相；檢測波長為327 nm；進(jìn)樣量10 l。 理論 塔板數(shù)按綠原酸 計算 應(yīng)不低于5 000。2.2.2 溶液的制備對照品溶液的制備：

14、精密稱取綠原酸對照品（60減壓干燥至恒重）適量，加甲醇制成每毫升含2.5 g的溶液，即得。供試樣品的制備：取本品研細(xì)，取約1.5 g，精密稱定, 置具塞錐形瓶中，精密加入50甲醇50 ml，密塞，放置15 min，搖勻，取續(xù)濾液，即得。陰性樣品溶液制備：按處方比例和工藝,制成不含綠原酸藥材的陰性樣品，按以上“供試樣品的制備”項下同樣的 方法 制備陰性對照溶液。2.2.3 線性關(guān)系考察精密稱取經(jīng)60減壓干燥至恒重的綠原酸對照品12.5 mg，置50 ml量瓶中，用50甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1，2，4，8和16 ml，分別置5個100 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（相當(dāng)于

15、2.5，5，10，20，40 g/ml）。 照高效液相色譜法2，精密量取10 l注入液相色譜儀，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣的對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：y= 5 386.137 7x + 3.291 2,r=0.999 9。結(jié)果表明綠原酸進(jìn)樣量在0.00250.04 g范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。見圖57。2.2.4 干擾實(shí)驗按照上述色譜條件，吸取對照品溶液，供試品溶液、陰性樣品溶液各10 l測定。在供試品色譜圖中，與對照品色譜峰相應(yīng)的位置上有一相同保留時間的色譜峰，而陰性樣品溶液在此保留時間無干擾。2.2.5 精密度實(shí)驗精密吸取對照品溶液10 l，重復(fù)進(jìn)樣5次，

16、測定對照品溶液峰面積，計算RSD=0.51%（n=5），提示精密度良好。2.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗取同一批樣品，按上述方法配制供試品溶液，分別于0，3，9，12，24 h注入液相色譜儀中測定，其峰面積基本保持不變，RSD=2.30%，穩(wěn)定性良好。2.2.7 重現(xiàn)性實(shí)驗取同一樣品5份，每份1.5 g，精密稱定，照文前“供試樣品的制備”項下的方法制備，按上述色譜條件，測定樣品中綠原酸峰面積值并計算含量，RSD=1.29 %（n=5）。表明本方法重現(xiàn)性良好。2.2.8 加樣回收率實(shí)驗 取已知含量的本品粉末6份，每份0.75 g，精密稱定，加入一定量的綠原酸對照品，按文前“供試樣品的制備”項下的方法制備，

17、按上述色譜條件進(jìn)行測定，計算回收率為99.60%，RSD=1.07%。結(jié)果見表1。表1 綠原酸加樣回收率計算結(jié)果（略）2.2.9 含量測定取5個批號的樣品，稱取約1.5 g,每個批次取兩份，按含量測定方法分別制備對照品溶液和供試品溶液,精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 l，按上述色譜條件測定。結(jié)果見表2。表2 樣品測定結(jié)果（略）3 討論曾經(jīng)試用過 文獻(xiàn) 3報道的甲醇-0.4%磷酸溶液(2080), 甲醇11%冰醋酸溶液(1090)，乙腈-0.4%磷酸溶液(1387) 等流動相,均不能使樣品中綠原酸和其他干擾組分峰完全分離。經(jīng)多次實(shí)驗,以乙腈、水組合成流動相,水中含0.4%的冰醋酸對樣品的分離較好。當(dāng)兩者比例為991時樣品中綠原酸不僅與其他干擾峰完全分離,而且保留時間適中(tR=11.40),峰形對稱且尖銳,故選擇為含量測定的流