改良混合酶消化法培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞

1、改良混合酶消化法培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞                  作者：李成武，李應(yīng)續(xù)，朱從麗，宋健【摘要】  目的 探討改良酶消化法培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（VSMC）的方法，為動(dòng)脈粥樣硬化等血管硬化性疾病的發(fā)病機(jī)制和防治研究提供幫助。 方法 提取大鼠的胸主動(dòng)脈，采用混合酶消化后，采用含10%FCS RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察細(xì)胞增殖，倒置相差顯微鏡觀察血管平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)性狀，免疫組織化學(xué)進(jìn)行

2、細(xì)胞鑒定。結(jié)果 消化肌平滑肌細(xì)胞24h后貼壁，平均貼壁率為76%，第5 d后細(xì)胞數(shù)迅速增加，至第11 d形成單層時(shí)，光鏡下出現(xiàn)“峰谷”樣生長(zhǎng)；傳代后，細(xì)胞的生長(zhǎng)特性無改變，SMA免疫組化染色檢測(cè)，證實(shí)細(xì)胞是VSMC。結(jié)論 改良后酶消化法能短時(shí)、高效地培養(yǎng)生物學(xué)特征穩(wěn)定的VSMC。 【關(guān)鍵詞】  酶消化法;平滑肌細(xì)胞;胸主動(dòng)脈;SD大鼠   ABSTRACT:Objective  To explore the cultivation of rat vascular smooth muscle cells (VSMC) by enzymatic disper

3、sion which helps to provide ideals for the prevention and treatment of angiosclerotic diseases. Methods  The thoracic artery was immediately removed and cut into fine tissue pieces, then was incubated in a mixed medium.After digestion,the cells were cultured in RPMI1640 with 20% FCS and then pl

4、ated onto plastic tissue culture dishes.The proliferation of cell was assayed by cell counting,the feature of vascular smooth muscle cells was observed with inverted phase contrast microscope,and immunohistochemical method was used to indentify cells.Results  After 24h of incubation,VSMCs began

5、 to stick to the wall of the incubation dishes,and the adherent rate was 76% .After 5th day,the cell number was increased rapidly,and they form  monolayer on 11th day.A "the peak valley" type of growth could be observed by light microscope.After passages, the growth characteristics of

6、 cells did not changed,and the confirmation cell was VSMC by SMA immunohistochemical testing.Conclusion  The improved enzymatic dispersion method for VSMC can increase the cell stability of biological characteristics with shorttime.   KEY WORDS:Enzymatic dispersion;Vascular smooth mus

7、cle cell;Thoracic aortat;SpragueDawley rat   動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（VSMC）的培養(yǎng)是研究平滑肌細(xì)胞分子生物學(xué)的有效手段，尤其可為平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移相關(guān)的心血管疾病的病因、機(jī)理研究提供良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｄ壳?，國?nèi)、外介紹平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)主要是組織貼塊法和酶消化法。具體的操作各不相同,各有優(yōu)、缺點(diǎn)。本文介紹本實(shí)驗(yàn)室通過改良酶消化法，采用膠原酶、彈性酶和脫氧核糖核酸酶消化主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，探討大鼠VSMC原代培養(yǎng)的新方法。   1  材料與方法   1.1  主要試劑與動(dòng)物

8、60;  雌性成年SpragueDawley大鼠（體質(zhì)量160180g  SPF）由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。 膠原酶型（BY60619 Sigma）；彈性蛋白酶（E7885，Sigma）；脫氧核糖核酸酶型（D5025, Sigma）；平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體（BM0002  Boster）; 胎牛血清（16000044，Gibco）；FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG免疫熒光二抗。   1.2  主要溶液   DHanks液（gL）：KCl 0.4g， KH2PO4  0.06g， NaCl  8g， Na

9、HCO3  0.35g， Na2HPO4  0.0318g；RPMI1640培養(yǎng)基（含10%FCS）：培養(yǎng)粉1.04g，雙抗2ml，谷氨酰胺4ml， FCS 10ml ，加雙蒸水至100ml ；0.4%膠原酶；0.1%彈性蛋白酶；0.1%脫氧核糖核酸酶型。   1.3  原代培養(yǎng)   取雌性SD大鼠（體質(zhì)量約180±20g）斷髓處死，活力碘進(jìn)行皮毛消毒，無菌條件下快速分離胸主動(dòng)脈，并置于DHanks平衡鹽液中；冰上操作：DHanks洗滌3次，清除血管表面的脂肪和結(jié)締組織；眼科剪縱向剪開血管，用無菌棉簽擦血管內(nèi)膜23

10、次；鐘表鑷剝離血管中膜內(nèi)2/3的平滑肌組織，并收集于不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中； 棄去組織塊中的培養(yǎng)基，加入3倍組織塊體積的新鮮配制的酶混合液（含0.4膠原酶、0.1%彈性蛋白酶和0.1%、0.1%脫氧核糖核酸酶型），37 恒溫水平搖床中震蕩54rpm，消化30min后，每隔10min用吸管輕柔快速吹打一次，鏡下觀察組織消化，消化約1.5h后，鏡下觀察約90以上組織成細(xì)胞懸液。用含10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化； 將酶混合物收集于離心管中，1000rpm×5min離心，棄去上清液；細(xì)胞接種于含10% FCS，100 IU/ml青霉素和100g/ml鏈霉素的無

11、酚紅RPMI 1640培養(yǎng)基中，調(diào)整密度約5×105/ml，在37，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)。            1.4  VSMC增殖的觀察   按上述條件培養(yǎng)的VSMC以3×105 個(gè)細(xì)胞/孔密度種植于6孔板中；分別于第1、3、5、7、11、13 d (更換培養(yǎng)基后)，按我們以前描述的方法1收集細(xì)胞、計(jì)算平均細(xì)胞數(shù)/孔，并繪制VSMC生長(zhǎng)曲線。   1.5  細(xì)胞鑒定   倒置相差顯微鏡下觀

12、察平滑肌細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)特性。免疫組織化學(xué)鑒定：傳一代時(shí)，取接種有細(xì)胞的無菌蓋玻片，4%多聚甲醛室溫下固定30min，PBS沖洗23遍后，置于30%H2O2純乙醇（30%H2O2純乙醇=150）溶液中室溫下浸泡30min。蒸餾水沖洗3次，PBS沖洗1次后，加平滑肌肌動(dòng)蛋白（SMA 1250）在37孵育2h； PBS沖洗，加FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG免疫熒光二抗（1500）37避光孵育1h后，PBS沖洗，顯微鏡下，任取6個(gè)視野計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)抗SMA染色陽性細(xì)胞數(shù)（VSMC胞胞漿中出現(xiàn)細(xì)絲狀棕褐色免疫反應(yīng)產(chǎn)物為陽性）和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)陽性百分率的平均值為培養(yǎng)SVMC的純度。  

13、60; 2   結(jié)  果   2.1  原代培養(yǎng)VSMC形態(tài)學(xué)觀察   消化下來的細(xì)胞呈圓形或橢圓，培養(yǎng)24h后，細(xì)胞貼壁良好，76%的貼壁形態(tài)呈樹枝狀，48h后細(xì)胞開始伸展，呈梭形，但數(shù)量幾乎沒有改變。第5d后，進(jìn)入對(duì)數(shù)增殖，大量細(xì)胞完全伸展，開始發(fā)生融合（圖1），形成典型的長(zhǎng)梭狀。第11d后形成單層，出現(xiàn)“峰谷”樣生長(zhǎng)（圖2）。   2.2  原代培養(yǎng)VSMC的增殖   新鮮分離的VSMC在原代培養(yǎng)的第1d細(xì)胞計(jì)數(shù)為 2.31±0.27×10

14、5/孔,平均貼壁率為76%。第3到第5d，細(xì)胞計(jì)數(shù)無顯著性變化。第5d后細(xì)胞數(shù)迅速增加，第7d時(shí)增至(4.65±0.29)×105/孔(P0.05), 第9d時(shí)增至(6.01±0.27)×105/孔，至第11 d形成單層時(shí)達(dá)7.84±0.31×105/孔，此后增殖趨于停止。   2.3  原代培養(yǎng)VSMC免疫組織化學(xué)鑒定   傳一代的細(xì)胞經(jīng)特異性的抗SMA染色后，胞質(zhì)著色顯示，95%的細(xì)胞呈陽性反應(yīng)（圖3）。陽性細(xì)胞胞漿中有大量與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的細(xì)絲狀棕褐色免疫反應(yīng)產(chǎn)物（圖4）。

15、0;   3  討  論   VSMC是血管中膜內(nèi)唯一類型的細(xì)胞。SMC的增殖，向內(nèi)皮下層遷移、并在內(nèi)皮下層增生和合成大量細(xì)胞外間質(zhì)以及凋亡，導(dǎo)致動(dòng)脈內(nèi)膜增厚(intima thickening)或新內(nèi)膜 (neointima)形成，是動(dòng)脈粥樣硬化早期以及冠脈氣囊擴(kuò)張術(shù)后再狹窄形成過程中的一個(gè)重要病理特征。因此，穩(wěn)定、良好的細(xì)胞體外培養(yǎng)對(duì)觀察VSMC在各種相關(guān)疾病中生物學(xué)行為的變化，研究其在疾病發(fā)生的病理過程中的影響具有重要的意義。   目前國內(nèi)、外血管平滑肌常用貼塊法和酶消化法這兩種方法2，3。貼塊法具有操作簡(jiǎn)單

16、、經(jīng)濟(jì)，獲取的細(xì)胞純度高的優(yōu)點(diǎn)；然而細(xì)胞培養(yǎng)周期長(zhǎng)，表型專一，主要獲取合成型細(xì)胞，表現(xiàn)為肌絲少，與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的細(xì)胞器多，細(xì)胞的生物學(xué)性狀發(fā)生改變。傳統(tǒng)的酶消化法解離細(xì)胞迅速、充分，保持細(xì)胞生物學(xué)性狀較好；但操作繁瑣，酶對(duì)細(xì)胞損傷大，難以把握操作過程，我們參考Yi. Guan和Campbell的方法4，5,反復(fù)實(shí)踐，作如下改進(jìn)：通過棉簽機(jī)械除內(nèi)膜，聯(lián)合眼科鑷撕中膜的方法，減少了對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷，同時(shí)提高了細(xì)胞純度；降低酶的濃度，減少了實(shí)驗(yàn)成本。0.5膠原酶改為0.4；0.5的彈性酶改為0.1，去掉胰酶抑制劑，增加0.1%脫氧核糖核酸酶型。在消化的過程中，采用在水平搖床低速（54rpm）、恒溫

17、（37），既保證了酶的高活性和濃度的均勻，又避免了震蕩時(shí)對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷。而實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明培養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)間縮短（消化2h后可接種培養(yǎng)）；消化后的細(xì)胞狀態(tài)好，數(shù)量多，24h后平均貼壁率達(dá)76%，沒有降低效果。   本操作方法簡(jiǎn)單，易于掌握，獲取的細(xì)胞數(shù)量多，活性高。但是在具體的操作過程中，應(yīng)注意一些細(xì)節(jié)問題：在取材時(shí)，動(dòng)作輕柔、迅速，盡量在冰上操作，保證取材組織的活性，嚴(yán)格控制消化時(shí)間；消化30min后，隨時(shí)觀察組織的消化狀況和細(xì)胞的狀態(tài)，既避免了酶對(duì)細(xì)胞的過度損傷，同時(shí)又保證了消化細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量；在消化吹打時(shí)，應(yīng)高頻低幅地吹打，力度以組織塊剛好吹散為佳，每次吹打盡量保持一致，保證實(shí)驗(yàn)條件的一致性。通過應(yīng)用改良的酶消化法，分離、提取和培養(yǎng)了高純度的原代大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，為與平滑肌細(xì)胞相關(guān)的增殖性心血管疾病的研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。【參考文獻(xiàn)】  1Song J, Wan Y, Rolfe BE, et al. Effects of estrogen on vascular smoothmuscle cells is dependent upon cellular phenotype J.Atherosclerosis, 19