英語(yǔ)翻譯Microsoft Word 文檔

1、限制性核酸內(nèi)切酶微生物能夠在獲得的其他來(lái)源的中識(shí)別自己的。這種體系已經(jīng)發(fā)展到識(shí)別自我和非自我，依靠細(xì)胞內(nèi)部的兩種酶：修飾性甲基化酶和限制性核酸內(nèi)切酶。這種甲基化酶在新生的雙鏈鏈上以特定的方式對(duì)各種核苷酸殘基增加甲基集團(tuán)。這種識(shí)別序列在長(zhǎng)度上通常有到個(gè)堿基對(duì)并且是回文序列，這就是說(shuō)，這種序列在一條鏈上與它互補(bǔ)鏈?zhǔn)窍嗤摹４蠖鄶?shù)生物體具有許多不同的修飾性甲基化酶。限制性核酸內(nèi)切酶作為修飾性酶識(shí)別相同的序列，但是代替甲基化，在序列上切割。然而，核酸內(nèi)切酶不會(huì)切割自身序列但是會(huì)降解外援。這種識(shí)別和切開(kāi)雙鏈特殊序列的特性已經(jīng)成為從許多類型的微生物中切除片段的基礎(chǔ)。不同種類的限制性內(nèi)切酶被發(fā)現(xiàn)，被稱為，和

2、類型。只有類型對(duì)新的DNA技術(shù)是重要的。2類型限制性內(nèi)切酶有特殊的重要性因?yàn)樗麄兊奶厥庑蛄胁⑶铱梢栽诰_的位置使雙鏈DNA斷裂。用這種方式切開(kāi)長(zhǎng)的外源DNA分子成為短的片段也可以在質(zhì)粒載體做一個(gè)單一缺口，在這位置上DNA片段可以被插入。在一些酶的作用下，切口產(chǎn)生單一鏈末端并且對(duì)于一個(gè)給定的限制性核苷酸得到的所有片段的目的序列是相同的。用這種方法，任一片段通過(guò)一種特殊的退火增殖可以與其他通過(guò)相同核酸內(nèi)切酶切割的片段進(jìn)行配對(duì)，因此創(chuàng)造出一個(gè)雜交分子。自從來(lái)自大量細(xì)菌的限制性核酸內(nèi)切酶發(fā)現(xiàn)以后，命名細(xì)菌的一套專業(yè)術(shù)語(yǔ)就被采用了。宿主微生物的屬名和種名由類型的首字母確定，并且種名的前兩個(gè)字母用斜體字形

3、成三個(gè)字母的縮寫(xiě)。例如，E。coli，Eco.菌株和類型用無(wú)下滑線記號(hào)鑒定并且核酸內(nèi)切酶的號(hào)碼用羅馬數(shù)字EcoR.不同的核算內(nèi)切酶可以用于產(chǎn)生不同尺寸的DNA片段使不同的3或5單鏈延長(zhǎng)。這種DNA片段可以用電泳純化。通過(guò)EcoR1水解PBR322的單一目的位點(diǎn)或者通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶因?yàn)橛幸粋€(gè)單一的目標(biāo)位點(diǎn)，改變環(huán)狀制粒成為線狀DNA分子。這個(gè)位點(diǎn)可以通過(guò)有兩個(gè)折疊對(duì)稱軸的2型限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別：它們可以是4，5，或6核苷酸序列。DNA切割酶可以產(chǎn)生既不是平的也不是粘性末端，粘性末端很少有不成對(duì)的核苷酸終點(diǎn)在末端既不是3羥基也不是5磷酸基團(tuán)。許多有用的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別4或6核苷酸再生位點(diǎn)

4、。因此2型Hinc酶切割六個(gè)堿基對(duì)序列的中間位置將導(dǎo)致鈍邊DNA分子形成，只能通過(guò)DNA連接酶以很低的效率被結(jié)合。EcoR1切割遠(yuǎn)離中心的識(shí)別位點(diǎn)并且由于酶切割位點(diǎn)的自然再生性導(dǎo)致雙鏈DNA片段和單鏈接頭或者粘性末端的形成。當(dāng)這些片段混合起來(lái)時(shí)，氫鍵連接發(fā)生在單鏈序列互補(bǔ)的堿基中最后形成聯(lián)合體。平均每4096個(gè)堿基對(duì)中有一個(gè)特殊的6核苷酸序列出現(xiàn)。識(shí)別4核苷酸序列的內(nèi)切酶所產(chǎn)生的片段，其平均長(zhǎng)度應(yīng)為256個(gè)堿基對(duì)：指出一個(gè)35000分子量的典型蛋白質(zhì)所需要的密碼子的DNA總數(shù)大約是1000個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。用于克隆的DNA片段比使用限制性內(nèi)切酶也需要被獲得：這些包括機(jī)械剪取，聲波降解法，化學(xué)合成

5、法，或者使用反轉(zhuǎn)錄酶從真核RNA模板上合成復(fù)制DNA。最后的方法克服了高等真核生物大部分基因所具有的典型特征內(nèi)含子或間插序列的問(wèn)題。真核生物DNA在細(xì)菌中復(fù)制時(shí)內(nèi)含子不能被移動(dòng)，然而在真核生物表達(dá)時(shí)他們通過(guò)連接初始RNA在基因復(fù)制時(shí)被移動(dòng)。接合載體 插入和鏈接DNA片段進(jìn)入質(zhì)粒載體可以通過(guò)好幾種方法完成。 使用大腸桿菌或T4噬菌體DNA處理的DNA混合片段將在克隆質(zhì)粒和DNA分子中產(chǎn)生共價(jià)連接。共價(jià)磷酸二酯鍵將在通過(guò)粘性末端已經(jīng)退火的片段中形成。 一個(gè)最低效率的連接方法是平頭末端或完全平齊末端連接。在這種情況下DNA分子沒(méi)有單練DNA的投影基因，要求高濃度的DNA末端和酶以提高連接。然而這種方

6、法在當(dāng)前水平下不能用于廣泛的核酸內(nèi)切酶廣泛增長(zhǎng)DNA。當(dāng)這種雜交行成時(shí)，他不能被用于產(chǎn)生原始DNA片段的核酸內(nèi)切酶切割。 這種可能存在的劣勢(shì)可以使用ie接頭被克服，短的合成多核苷酸，包括一個(gè)或更多核酸內(nèi)切酶序列。許多接頭現(xiàn)在已經(jīng)存在，它允許DNA目的片段簡(jiǎn)單的修飾。接頭序列的使用允許平頭末端連接到DNA片段，通過(guò)適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶切割接頭形成特殊的目的需要。用這種方法克隆的片段可以簡(jiǎn)單的從重組質(zhì)粒中重復(fù)分離，通過(guò)正確的核酸內(nèi)切酶消化。 一個(gè)很少使用的方法包括在載體3末端加入一個(gè)有幾個(gè)脫氧鳥(niǎo)苷的尾巴，并且脫氧胞嘧啶插入到剩余的3末端，因此形成插入互補(bǔ)的伸長(zhǎng)單鏈和載體。通過(guò)堿基配對(duì)結(jié)合，連鎖反應(yīng)發(fā)生

7、了。插入DNA片段的質(zhì)粒新產(chǎn)品叫做一個(gè)假想質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化 這種讓DNA產(chǎn)品進(jìn)入細(xì)菌的技術(shù)已經(jīng)很長(zhǎng)時(shí)間被重視，并且可以包括染色體或質(zhì)粒DNA。當(dāng)噬菌體DNA被包裹的時(shí)候轉(zhuǎn)化就發(fā)生了。 一個(gè)典型的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)將有一個(gè)DNA分子的異構(gòu)混合物，DNA分子只有很少數(shù)量包括一個(gè)單一的載體質(zhì)粒連接到單鏈DNA片段。當(dāng)大腸桿菌用于轉(zhuǎn)化DNA分子時(shí)，溶解到0.1mol/l氯化鈣溶液中，他將有能力或者具有滲透性與細(xì)菌細(xì)胞混合。這種細(xì)胞然后在37度下加熱5分鐘使DNA收縮。這種細(xì)胞然后轉(zhuǎn)入到肉湯中經(jīng)過(guò)短周期培養(yǎng)就能表達(dá)出新的DNA所需要的性狀。這種細(xì)菌攜帶的雜交分子通過(guò)特殊的篩選過(guò)程被鑒別和純化:他們的雜交質(zhì)粒被篩選并

8、且表達(dá)，或者新產(chǎn)品被篩選和研究。轉(zhuǎn)化效果是每ug克隆基因大約有106個(gè)轉(zhuǎn)化。當(dāng)噬菌體質(zhì)粒和黏端質(zhì)粒（包括正常質(zhì)粒和噬菌體粘性末端）也能被利用時(shí)，質(zhì)粒載體在其他的細(xì)菌已經(jīng)得到發(fā)展。革蘭氏陰性菌，特別是大腸桿菌，已經(jīng)廣泛的用于重組DNA工作。特殊的質(zhì)粒載體在革蘭氏陽(yáng)性菌也已經(jīng)得到發(fā)展，特別是枯草芽孢桿菌和鏈霉菌。在真核生物體系中轉(zhuǎn)化新基因工程技術(shù)的大量研究正在進(jìn)程中。酵母是作為真核克隆宿主的強(qiáng)烈候選者，并且具有兩種不同功能的質(zhì)粒使用來(lái)自酵母的2uDNA和來(lái)自大腸桿菌的pBR322質(zhì)粒已經(jīng)得到發(fā)展并且成功應(yīng)用。使用特殊動(dòng)物病毒基因在動(dòng)物細(xì)胞中克隆可以完成，例如，猴病毒SV40。植物細(xì)胞克隆不能這么好

9、的建立；根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒被證明是有用的。在高等植物中重組DNA技術(shù)正被視為自身蛋白質(zhì)在增值中增長(zhǎng)的重要性，允許有用植物直接基因修飾以提高他們的生產(chǎn)率。在基因工程植物中這種表達(dá)一個(gè)新型基因的功能已經(jīng)被報(bào)導(dǎo)。一個(gè)重要原因是植物中基因表達(dá)的分子基礎(chǔ)之間相互認(rèn)識(shí)的限制。此外，許多重要植物特征的基因還沒(méi)有被確認(rèn)。然而，改變細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)的人在微生物基因工程中是有用的，如果它們不能再生進(jìn)入整個(gè)植物，改變植物細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)只有很小的價(jià)值。不幸的是，相比較而言，只有很少農(nóng)藝象征作物可以在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)立即再生。通過(guò)基因工程改良作物的可能性毫無(wú)疑問(wèn)是巨大的，但是在他實(shí)現(xiàn)之前在植物分子生物學(xué)所有領(lǐng)域的基本研究是必須

10、的。轉(zhuǎn)化株（已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞）的識(shí)別 在大多數(shù)克隆實(shí)驗(yàn)中方案最主要的部分將是與已經(jīng)轉(zhuǎn)化了的重組克隆體識(shí)別有關(guān)。通常的，轉(zhuǎn)化DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的總數(shù)量非常小于宿主染色體DNA，因此來(lái)自轉(zhuǎn)化片段的表達(dá)產(chǎn)品的識(shí)別將是非常困難的。然而各種各樣的方法已經(jīng)發(fā)展了去識(shí)別攜帶期望DNA片段的克隆體。（a） 互補(bǔ) 一些內(nèi)部基因能夠補(bǔ)充在接受者染色體上有復(fù)制缺陷的相同基因：那就是說(shuō)，他們遺傳密碼是正常的，有效地而受體是有缺陷的。例如，半乳糖苷酶+基因（為-牛乳糖編碼）將補(bǔ)充一個(gè)半乳糖苷酶，-牛乳糖缺陷宿主產(chǎn)生半乳糖苷酶+接受者，接受者可以在馬康氏瓊脂培養(yǎng)基作為紅色群落被選擇。（b） 抗生素抵抗基因 這些基因在正

11、常易感染的細(xì)胞中授予抵抗一種抗生素。這可以使用質(zhì)粒pBR322舉例說(shuō)明，質(zhì)粒pBR322攜帶四環(huán)素和氨芐青霉素抵抗基因并且轉(zhuǎn)化株可以用包含這些抗體中的一種的媒介被選擇：外源DNA通常被克隆進(jìn)入基因編碼以抵抗其他基因，不選擇抗生素。（c） 雜交 分析一個(gè)重組DNA分子的集合體或克隆細(xì)胞廣泛使用的方法是通過(guò)菌落或空斑雜交。包含重組DNA的細(xì)胞被轉(zhuǎn)移，用消化纖維素過(guò)濾和細(xì)胞溶解。純化的，互補(bǔ)的放射性核酸然后在消化纖維連接的細(xì)胞里雜交成為DNA?；パa(bǔ)的DNA將會(huì)雜交并且可以通過(guò)射線自顯技法被發(fā)現(xiàn)。雜交長(zhǎng)度將反映出互補(bǔ)的數(shù)量。來(lái)自一個(gè)mRNA模板用合成法合成的復(fù)制DNA也可以以一種相思的方式篩選消化纖維

12、素過(guò)濾的重組DNA。（d） 限制性核酸內(nèi)切酶分析 這種方法可以被用于測(cè)定是否克隆的DNA作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)DNA分子產(chǎn)生了相同尺寸的片段。限制性核酸內(nèi)切酶表明（提供）了映射片段通常是序列分析的先決條件。（e） 免疫學(xué)方法 免疫學(xué)方法正被越來(lái)越多的使用并且對(duì)發(fā)展抗體有很大的依賴性，主要是抵抗蛋白質(zhì)產(chǎn)品。識(shí)別重組DNA在工業(yè)克隆方面有很高的秘密，結(jié)果導(dǎo)致大多數(shù)研究都保留秘密信息。這是不可避免的但在新技術(shù)在商業(yè)重要性方面是令人遺憾的?；蚬こ瘫仨毐徽_的看做應(yīng)用遺傳學(xué)的大量框架的頂點(diǎn)，它已經(jīng)如此成功的發(fā)展，超過(guò)了過(guò)去的30年。盡管如此，他確實(shí)是最令人興奮的和有潛力的，這最有創(chuàng)造性的技術(shù)可以達(dá)到用于工業(yè)的遺

13、傳學(xué)者。重組DNA技術(shù)在學(xué)術(shù)和經(jīng)濟(jì)上的應(yīng)用是無(wú)限制的，包括：增加特殊的基因產(chǎn)品的產(chǎn)量。提高合成特殊最終產(chǎn)品的比率可以通過(guò)克隆添加一個(gè)酶進(jìn)入有機(jī)體，或者通過(guò)定點(diǎn)誘變特定修改一個(gè)已經(jīng)克隆的酶（例如，克隆固氮路徑是通過(guò)大腸桿菌進(jìn)入到噬甲基菌屬食甲基嗜甲基菌單細(xì)胞蛋白的ICI）。通過(guò)轉(zhuǎn)移一個(gè)特殊的活性進(jìn)入一個(gè)更理想的宿主有機(jī)體裁剪一個(gè)有機(jī)體。在不久的將來(lái)重組DNA技術(shù)將在制藥生產(chǎn)上有很重要的方面。他可能從哺乳動(dòng)物獲得資源進(jìn)入細(xì)菌生產(chǎn)基因，并且獲得在商業(yè)范圍內(nèi)的產(chǎn)品，這些商品可以通過(guò)哺乳動(dòng)物基因進(jìn)行編碼。這些特殊重要的復(fù)合物包括胰島素，人類生長(zhǎng)激素，沒(méi)，抗生素，干擾素和疫苗。隨著時(shí)間發(fā)展和商業(yè)應(yīng)用充滿希望，在以后的十年將允許這些產(chǎn)品存在。在獸醫(yī)領(lǐng)域，新的動(dòng)物疫苗將會(huì)通過(guò)基因工程獲得。盡管外源基因的克隆現(xiàn)在常規(guī)的是使用大腸桿菌，一個(gè)很重要的原因是有機(jī)體分泌很少的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)通過(guò)信號(hào)序列具