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1、限制性核酸內(nèi)切酶微生物能夠在獲得的其他來源的中識別自己的。這種體系已經(jīng)發(fā)展到識別自我和非自我，依靠細(xì)胞內(nèi)部的兩種酶：修飾性甲基化酶和限制性核酸內(nèi)切酶。這種甲基化酶在新生的雙鏈鏈上以特定的方式對各種核苷酸殘基增加甲基集團(tuán)。這種識別序列在長度上通常有到個堿基對并且是回文序列，這就是說，這種序列在一條鏈上與它互補(bǔ)鏈?zhǔn)窍嗤摹４蠖鄶?shù)生物體具有許多不同的修飾性甲基化酶。限制性核酸內(nèi)切酶作為修飾性酶識別相同的序列，但是代替甲基化，在序列上切割。然而，核酸內(nèi)切酶不會切割自身序列但是會降解外援。這種識別和切開雙鏈特殊序列的特性已經(jīng)成為從許多類型的微生物中切除片段的基礎(chǔ)。不同種類的限制性內(nèi)切酶被發(fā)現(xiàn)，被稱為，和

2、類型。只有類型對新的DNA技術(shù)是重要的。2類型限制性內(nèi)切酶有特殊的重要性因為他們的特殊序列并且可以在精確的位置使雙鏈DNA斷裂。用這種方式切開長的外源DNA分子成為短的片段也可以在質(zhì)粒載體做一個單一缺口，在這位置上DNA片段可以被插入。在一些酶的作用下，切口產(chǎn)生單一鏈末端并且對于一個給定的限制性核苷酸得到的所有片段的目的序列是相同的。用這種方法，任一片段通過一種特殊的退火增殖可以與其他通過相同核酸內(nèi)切酶切割的片段進(jìn)行配對，因此創(chuàng)造出一個雜交分子。自從來自大量細(xì)菌的限制性核酸內(nèi)切酶發(fā)現(xiàn)以后，命名細(xì)菌的一套專業(yè)術(shù)語就被采用了。宿主微生物的屬名和種名由類型的首字母確定，并且種名的前兩個字母用斜體字形

3、成三個字母的縮寫。例如，E。coli，Eco.菌株和類型用無下滑線記號鑒定并且核酸內(nèi)切酶的號碼用羅馬數(shù)字EcoR.不同的核算內(nèi)切酶可以用于產(chǎn)生不同尺寸的DNA片段使不同的3或5單鏈延長。這種DNA片段可以用電泳純化。通過EcoR1水解PBR322的單一目的位點(diǎn)或者通過限制性核酸內(nèi)切酶因為有一個單一的目標(biāo)位點(diǎn)，改變環(huán)狀制粒成為線狀DNA分子。這個位點(diǎn)可以通過有兩個折疊對稱軸的2型限制性核酸內(nèi)切酶識別：它們可以是4，5，或6核苷酸序列。DNA切割酶可以產(chǎn)生既不是平的也不是粘性末端，粘性末端很少有不成對的核苷酸終點(diǎn)在末端既不是3羥基也不是5磷酸基團(tuán)。許多有用的限制性核酸內(nèi)切酶識別4或6核苷酸再生位點(diǎn)

4、。因此2型Hinc酶切割六個堿基對序列的中間位置將導(dǎo)致鈍邊DNA分子形成，只能通過DNA連接酶以很低的效率被結(jié)合。EcoR1切割遠(yuǎn)離中心的識別位點(diǎn)并且由于酶切割位點(diǎn)的自然再生性導(dǎo)致雙鏈DNA片段和單鏈接頭或者粘性末端的形成。當(dāng)這些片段混合起來時，氫鍵連接發(fā)生在單鏈序列互補(bǔ)的堿基中最后形成聯(lián)合體。平均每4096個堿基對中有一個特殊的6核苷酸序列出現(xiàn)。識別4核苷酸序列的內(nèi)切酶所產(chǎn)生的片段，其平均長度應(yīng)為256個堿基對：指出一個35000分子量的典型蛋白質(zhì)所需要的密碼子的DNA總數(shù)大約是1000個核苷酸的長度。用于克隆的DNA片段比使用限制性內(nèi)切酶也需要被獲得：這些包括機(jī)械剪取，聲波降解法，化學(xué)合成

5、法，或者使用反轉(zhuǎn)錄酶從真核RNA模板上合成復(fù)制DNA。最后的方法克服了高等真核生物大部分基因所具有的典型特征內(nèi)含子或間插序列的問題。真核生物DNA在細(xì)菌中復(fù)制時內(nèi)含子不能被移動，然而在真核生物表達(dá)時他們通過連接初始RNA在基因復(fù)制時被移動。接合載體 插入和鏈接DNA片段進(jìn)入質(zhì)粒載體可以通過好幾種方法完成。 使用大腸桿菌或T4噬菌體DNA處理的DNA混合片段將在克隆質(zhì)粒和DNA分子中產(chǎn)生共價連接。共價磷酸二酯鍵將在通過粘性末端已經(jīng)退火的片段中形成。 一個最低效率的連接方法是平頭末端或完全平齊末端連接。在這種情況下DNA分子沒有單練DNA的投影基因，要求高濃度的DNA末端和酶以提高連接。然而這種方

6、法在當(dāng)前水平下不能用于廣泛的核酸內(nèi)切酶廣泛增長DNA。當(dāng)這種雜交行成時，他不能被用于產(chǎn)生原始DNA片段的核酸內(nèi)切酶切割。 這種可能存在的劣勢可以使用ie接頭被克服，短的合成多核苷酸，包括一個或更多核酸內(nèi)切酶序列。許多接頭現(xiàn)在已經(jīng)存在，它允許DNA目的片段簡單的修飾。接頭序列的使用允許平頭末端連接到DNA片段，通過適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶切割接頭形成特殊的目的需要。用這種方法克隆的片段可以簡單的從重組質(zhì)粒中重復(fù)分離，通過正確的核酸內(nèi)切酶消化。 一個很少使用的方法包括在載體3末端加入一個有幾個脫氧鳥苷的尾巴，并且脫氧胞嘧啶插入到剩余的3末端，因此形成插入互補(bǔ)的伸長單鏈和載體。通過堿基配對結(jié)合，連鎖反應(yīng)發(fā)生

7、了。插入DNA片段的質(zhì)粒新產(chǎn)品叫做一個假想質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化 這種讓DNA產(chǎn)品進(jìn)入細(xì)菌的技術(shù)已經(jīng)很長時間被重視，并且可以包括染色體或質(zhì)粒DNA。當(dāng)噬菌體DNA被包裹的時候轉(zhuǎn)化就發(fā)生了。 一個典型的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實(shí)驗將有一個DNA分子的異構(gòu)混合物，DNA分子只有很少數(shù)量包括一個單一的載體質(zhì)粒連接到單鏈DNA片段。當(dāng)大腸桿菌用于轉(zhuǎn)化DNA分子時，溶解到0.1mol/l氯化鈣溶液中，他將有能力或者具有滲透性與細(xì)菌細(xì)胞混合。這種細(xì)胞然后在37度下加熱5分鐘使DNA收縮。這種細(xì)胞然后轉(zhuǎn)入到肉湯中經(jīng)過短周期培養(yǎng)就能表達(dá)出新的DNA所需要的性狀。這種細(xì)菌攜帶的雜交分子通過特殊的篩選過程被鑒別和純化:他們的雜交質(zhì)粒被篩選并

8、且表達(dá)，或者新產(chǎn)品被篩選和研究。轉(zhuǎn)化效果是每ug克隆基因大約有106個轉(zhuǎn)化。當(dāng)噬菌體質(zhì)粒和黏端質(zhì)粒（包括正常質(zhì)粒和噬菌體粘性末端）也能被利用時，質(zhì)粒載體在其他的細(xì)菌已經(jīng)得到發(fā)展。革蘭氏陰性菌，特別是大腸桿菌，已經(jīng)廣泛的用于重組DNA工作。特殊的質(zhì)粒載體在革蘭氏陽性菌也已經(jīng)得到發(fā)展，特別是枯草芽孢桿菌和鏈霉菌。在真核生物體系中轉(zhuǎn)化新基因工程技術(shù)的大量研究正在進(jìn)程中。酵母是作為真核克隆宿主的強(qiáng)烈候選者，并且具有兩種不同功能的質(zhì)粒使用來自酵母的2uDNA和來自大腸桿菌的pBR322質(zhì)粒已經(jīng)得到發(fā)展并且成功應(yīng)用。使用特殊動物病毒基因在動物細(xì)胞中克隆可以完成，例如，猴病毒SV40。植物細(xì)胞克隆不能這么好

9、的建立；根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒被證明是有用的。在高等植物中重組DNA技術(shù)正被視為自身蛋白質(zhì)在增值中增長的重要性，允許有用植物直接基因修飾以提高他們的生產(chǎn)率。在基因工程植物中這種表達(dá)一個新型基因的功能已經(jīng)被報導(dǎo)。一個重要原因是植物中基因表達(dá)的分子基礎(chǔ)之間相互認(rèn)識的限制。此外，許多重要植物特征的基因還沒有被確認(rèn)。然而，改變細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)的人在微生物基因工程中是有用的，如果它們不能再生進(jìn)入整個植物，改變植物細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)只有很小的價值。不幸的是，相比較而言，只有很少農(nóng)藝象征作物可以在細(xì)胞培養(yǎng)時立即再生。通過基因工程改良作物的可能性毫無疑問是巨大的，但是在他實(shí)現(xiàn)之前在植物分子生物學(xué)所有領(lǐng)域的基本研究是必須

10、的。轉(zhuǎn)化株（已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞）的識別 在大多數(shù)克隆實(shí)驗中方案最主要的部分將是與已經(jīng)轉(zhuǎn)化了的重組克隆體識別有關(guān)。通常的，轉(zhuǎn)化DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的總數(shù)量非常小于宿主染色體DNA，因此來自轉(zhuǎn)化片段的表達(dá)產(chǎn)品的識別將是非常困難的。然而各種各樣的方法已經(jīng)發(fā)展了去識別攜帶期望DNA片段的克隆體。（a） 互補(bǔ) 一些內(nèi)部基因能夠補(bǔ)充在接受者染色體上有復(fù)制缺陷的相同基因：那就是說，他們遺傳密碼是正常的，有效地而受體是有缺陷的。例如，半乳糖苷酶+基因（為-牛乳糖編碼）將補(bǔ)充一個半乳糖苷酶，-牛乳糖缺陷宿主產(chǎn)生半乳糖苷酶+接受者，接受者可以在馬康氏瓊脂培養(yǎng)基作為紅色群落被選擇。（b） 抗生素抵抗基因 這些基因在正

11、常易感染的細(xì)胞中授予抵抗一種抗生素。這可以使用質(zhì)粒pBR322舉例說明，質(zhì)粒pBR322攜帶四環(huán)素和氨芐青霉素抵抗基因并且轉(zhuǎn)化株可以用包含這些抗體中的一種的媒介被選擇：外源DNA通常被克隆進(jìn)入基因編碼以抵抗其他基因，不選擇抗生素。（c） 雜交 分析一個重組DNA分子的集合體或克隆細(xì)胞廣泛使用的方法是通過菌落或空斑雜交。包含重組DNA的細(xì)胞被轉(zhuǎn)移，用消化纖維素過濾和細(xì)胞溶解。純化的，互補(bǔ)的放射性核酸然后在消化纖維連接的細(xì)胞里雜交成為DNA。互補(bǔ)的DNA將會雜交并且可以通過射線自顯技法被發(fā)現(xiàn)。雜交長度將反映出互補(bǔ)的數(shù)量。來自一個mRNA模板用合成法合成的復(fù)制DNA也可以以一種相思的方式篩選消化纖維

12、素過濾的重組DNA。（d） 限制性核酸內(nèi)切酶分析 這種方法可以被用于測定是否克隆的DNA作為一個標(biāo)準(zhǔn)DNA分子產(chǎn)生了相同尺寸的片段。限制性核酸內(nèi)切酶表明（提供）了映射片段通常是序列分析的先決條件。（e） 免疫學(xué)方法 免疫學(xué)方法正被越來越多的使用并且對發(fā)展抗體有很大的依賴性，主要是抵抗蛋白質(zhì)產(chǎn)品。識別重組DNA在工業(yè)克隆方面有很高的秘密，結(jié)果導(dǎo)致大多數(shù)研究都保留秘密信息。這是不可避免的但在新技術(shù)在商業(yè)重要性方面是令人遺憾的?；蚬こ瘫仨毐徽_的看做應(yīng)用遺傳學(xué)的大量框架的頂點(diǎn)，它已經(jīng)如此成功的發(fā)展，超過了過去的30年。盡管如此，他確實(shí)是最令人興奮的和有潛力的，這最有創(chuàng)造性的技術(shù)可以達(dá)到用于工業(yè)的遺

13、傳學(xué)者。重組DNA技術(shù)在學(xué)術(shù)和經(jīng)濟(jì)上的應(yīng)用是無限制的，包括：增加特殊的基因產(chǎn)品的產(chǎn)量。提高合成特殊最終產(chǎn)品的比率可以通過克隆添加一個酶進(jìn)入有機(jī)體，或者通過定點(diǎn)誘變特定修改一個已經(jīng)克隆的酶（例如，克隆固氮路徑是通過大腸桿菌進(jìn)入到噬甲基菌屬食甲基嗜甲基菌單細(xì)胞蛋白的ICI）。通過轉(zhuǎn)移一個特殊的活性進(jìn)入一個更理想的宿主有機(jī)體裁剪一個有機(jī)體。在不久的將來重組DNA技術(shù)將在制藥生產(chǎn)上有很重要的方面。他可能從哺乳動物獲得資源進(jìn)入細(xì)菌生產(chǎn)基因，并且獲得在商業(yè)范圍內(nèi)的產(chǎn)品，這些商品可以通過哺乳動物基因進(jìn)行編碼。這些特殊重要的復(fù)合物包括胰島素，人類生長激素，沒，抗生素，干擾素和疫苗。隨著時間發(fā)展和商業(yè)應(yīng)用充滿希望，在以后的十年將允許這些產(chǎn)品存在。在獸醫(yī)領(lǐng)域，新的動物疫苗將會通過基因工程獲得。盡管外源基因的克隆現(xiàn)在常規(guī)的是使用大腸桿菌，一個很重要的原因是有機(jī)體分泌很少的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)通過信號序列具