利用染色體片段置換系定位水稻落粒性主效QTL-

1、收稿日期: 2007-11-06; 接受日期: 2008-01-24.實(shí)驗(yàn)簡報(bào).利用染色體片段置換系定位水稻落粒性主效QTL朱文銀, 楊德衛(wèi), 林靜, 趙凌, 張亞東, 朱鎮(zhèn), 陳濤, 王才林*江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心, 南京 210014關(guān)鍵詞 染色體片段置換系, 置換片段, 水稻, 落粒性, 代換作圖朱文銀, 楊德衛(wèi), 林靜, 趙凌, 張亞東, 朱鎮(zhèn), 陳濤, 王才林 (2008. 利用染色體片段置換系定位水稻落粒性主效QTL. 植物學(xué)通報(bào) 25,443448.落粒性是與水稻生產(chǎn)密切相關(guān)的重要性狀之一, 易落?；螂y落粒的水稻品種都不宜在生產(chǎn)上使用。一般來說,

2、野生稻極易落粒, 秈稻的落粒性又強(qiáng)于粳稻?，F(xiàn)代作物品種大多是通過人類的活動(dòng), 從野生植物中選擇出適口性好、出苗整齊和落粒性差的類型進(jìn)行栽培種植, 逐漸馴化而來。水稻也是通過不斷減少落粒率而得以馴化(Li et al., 2006。因此, 研究水稻落粒性遺傳基因, 并定位和克隆水稻落粒性基因?qū)ε嘤淞Ｐ赃m中的水稻品種, 闡明水稻的遺傳進(jìn)化具有重要意義。多數(shù)遺傳研究結(jié)果表明, 控制水稻落粒性的基因主要有2類: 主基因和QTL 。在主基因方面, 落粒性的遺傳主要是由單基因或寡基因控制的質(zhì)量性狀。在野生稻和栽培稻雜交試驗(yàn)中, 易落粒表現(xiàn)為顯性遺傳; 在栽培稻中, 易落粒與難落粒品種間進(jìn)行雜交時(shí), 二者

3、均可能表現(xiàn)為顯性。通過對(duì)野生稻與栽培稻及栽培稻之間雜交后代的遺傳研究, 迄今已定位5個(gè)落粒性基因, 即sh-1、sh-2、sh-3、sh-4和sh-h , 分別被定位在水稻第11、1、4、3和7染色體上(Kinoshita, 1995; Ji et al., 2006。其中, sh-2被認(rèn)為是秈稻和粳稻亞種中主要的落粒性基因, sh-3則來源于普通野生稻。李平等(1996利用秈粳交產(chǎn)生的加倍單倍體群體, 將sh-2定位在第1染色體RFLP 標(biāo)記RGI72b 與RG152b 之間。隨后, Ko ni sh i 等(2006克隆了該基因。S ob ri z al 等(1999利用BC 4F 2群體

4、和RFLP 標(biāo)記對(duì)sh-3進(jìn)行了定位, sh-3位于第4染色體R1427和C107之間, 與標(biāo)記的遺傳距離均為2.3 cM 。隨后, 該基因被克隆(Li et al.,2006; Lin et al., 2007。在QTL 方面, Fukuta 等(1996利用秈粳交后代F 2分離群體, 對(duì)落粒性進(jìn)行了QTL 分析, 在第1、2、5、11和12染色體上檢測(cè)到5個(gè)QTL,其中第1染色體上的QTL 為主效基因, 推測(cè)它可能位于sh-2附近。X iong 等(1999利用Aijiaonante/P16的F 2分離群體, 共檢測(cè)出5個(gè)落粒性QTL, 分別位于水稻第1、3、4、6和8染色體上。Cai 和

5、Morishima(2000利用重組自交系群體在水稻第1、4、8和11染色體上444植物學(xué)通報(bào) 25(4 2008檢測(cè)到4個(gè)落粒性QTL。沈圣泉等(2004利用珍汕97B/密陽46所構(gòu)建的R IL群體,分別在第1、2、3、6、7和11染色體上檢測(cè)到7個(gè)落粒性QTL, 并分析了每個(gè)QTL的效應(yīng)大小。許旭明等(2005利用重組自交系群體, 檢測(cè)到與秈稻落粒性相關(guān)的7個(gè)QTL, 分別位于第1、2、4、6和7染色體上。染色體片段置換系與其受體親本之間只存在染色體置換片段的差異, 通過染色體片段置換系與其受體親本之間以及染色體片段置換系之間的性狀比較, 就可以鑒定出置換片段上的Q TL, 并可對(duì)其遺傳效

6、應(yīng)進(jìn)行分析(Howell et al., 1996; Ramsay et al., 1996。由于染色體片段置換系消除了遺傳背景的干擾, 能將復(fù)雜性狀分解成簡單性狀,因此受到國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注(Zhang et al., 2004; W an et al., 2005。本研究以93-11、日本晴以及7個(gè)染色體片段置換系為材料, 采用代換作圖法, 利用SSR標(biāo)記對(duì)2個(gè)水稻落粒性QTL進(jìn)行了鑒定和初步定位。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料以秈稻品種93-11為輪回親本, 粳稻品種日本晴為供體,二者雜交獲得F1, F1再與93-11連續(xù)回交至BC4F1。用覆蓋水稻全基因組的親本間有多態(tài)性的SSR標(biāo)記檢

7、測(cè)BC4F1單株的基因型, 選擇基因組內(nèi)含有少量雜合片段的單株的種子種植得到BC4F2群體。通過對(duì)BC4F2群體分子標(biāo)記基因型檢測(cè)獲得染色體片段置換系, 從中選出7個(gè)染色體片段置換系進(jìn)行水稻落粒性QTL分析。所有實(shí)驗(yàn)均在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)完成。1.2水稻落粒性鑒定落粒性鑒定按照應(yīng)存山(1993介紹的方法進(jìn)行(略加修改。在親本及各置換系群體植株成熟時(shí),用手握住成熟的稻穗, 以手指與掌心用力搓揉, 連續(xù)測(cè)定3次, 以93-11為易脫粒對(duì)照。將水稻的落粒性分為3個(gè)等級(jí):難(用力搓揉稻穗不落粒或少落粒, 落粒率<5.5%、中(5.5% 落粒率<25.5%和易(落粒率 25.5%。1.

8、3 DNA 的提取及PCR擴(kuò)增DNA的提取按照SDS提取法進(jìn)行。PCR擴(kuò)增采用每管20 µL反應(yīng)體系, 包括: 0.15 µmol.L-1SSR引物、200 µmol.L-1dNTP、1×PCR反應(yīng)緩沖液、50-100 ng模板DNA、1 U Taq酶。反應(yīng)程序?yàn)? 94°C變性5分鐘; 94°C 1分鐘, 55°C 1分鐘, 72°C 1分鐘, 循環(huán)35次; 72°C延伸5分鐘。1.4分子標(biāo)記及遺傳圖譜參照已發(fā)表的分子標(biāo)記遺傳圖譜(M cC ou ch et a l., 2002, 選用均勻分布于水稻全

9、基因組的親本間有多態(tài)性的SS R標(biāo)記對(duì)染色體片段置換系置換片段進(jìn)行分析。1.5置換片段長度的計(jì)算按照Young和Tanksley(1989的方法計(jì)算置換片段的長度。首先, 不考慮2個(gè)相鄰標(biāo)記間發(fā)生的雙交換事件,當(dāng)相鄰標(biāo)記基因型均為供體親本基因型時(shí), 認(rèn)為這2個(gè)標(biāo)記之間的區(qū)段為供體的置換片段; 然后, 在每個(gè)置換片段兩端增加分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè), 直至親本間有多態(tài)性的標(biāo)記表現(xiàn)為受體親本的純合基因型為止; 最后, 以置換片段末端標(biāo)記基因型與相鄰的受體純合基因型標(biāo)記之間的中點(diǎn)為該末端邊界點(diǎn), 兩末端邊界點(diǎn)之間的距離就是該置換片段的長度。1.6水稻落粒性QTL的定位采用重疊群代換作圖法對(duì)水稻落粒性Q TL

10、進(jìn)行定位。如果在含有重疊置換片段的不同置換系中都鑒定出落粒性QTL, 則認(rèn)為該QTL位于置換片段的重疊區(qū)段上; 如果在某個(gè)置換系的置換片段上檢測(cè)出了落粒性QTL, 而在與其有部分重疊的另一個(gè)置換系中未檢測(cè)出, 則認(rèn)為該QTL位于這2個(gè)置換系非重疊的區(qū)段上。2結(jié)果與分析2.1親本及7個(gè)染色體片段置換系的落粒性表現(xiàn)兩親本的落粒性存在明顯差別: 秈稻93-11易脫粒, 粳稻日本晴較難脫粒。在7個(gè)染色體片段置換系中, 置換系445朱文銀等: 利用染色體片段置換系定位水稻落粒性主效QTL1、2、3和5的落粒率均小于5.5%, 與日本晴的落粒性相似, 表現(xiàn)難脫粒; 置換系4、6和7的落粒率與受體親本93-

11、11基本相同, 表現(xiàn)為易脫粒。2.2染色體片段置換系置換片段的分布選用153對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)93-11與日本晴之間多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè), 有104個(gè)標(biāo)記在親本間具有多態(tài)性, 多態(tài)率為68.0%。以輪回親本93-11為對(duì)照, 利用多態(tài)性標(biāo)記對(duì)7個(gè)染色體片段置換系中來自日本晴的置換片段進(jìn)行分析(圖1。經(jīng)過連續(xù)4代回交后, 各染色體片段置換系的置換片段數(shù)顯著減少, 其中染色體片段置換系1中有3個(gè)置換片段來自供體親本日本晴, 染色體片段置換系4中有2個(gè)置換片段, 其它5個(gè)染色體片段置換系的置換片段均為1個(gè), 平均每個(gè)染色體片段置換系有1.4個(gè)置換片段(圖2。2.3染色體片段置換系中置換片段的長度3討論有關(guān)水稻

12、落粒性基因定位方面, 早期的研究主要通過落 粒性與性狀標(biāo)記的連鎖分析將其定位在染色體的不同區(qū)圖1 SSR標(biāo)記RM1068和RM3430在染色體片段置換系中的擴(kuò)增帶型P1: 93-11; 1-7: 染色體片段置換系; M: DNA分子標(biāo)記Figure 1 The band patterns of RM1068 and RM3430 in CSSLs P1: 93-11; 1-7: Chromosome s egment subs titution lines; M: DNA marker圖2 7個(gè)染色體片段置換系中置換片段在水稻12條染色體上的分布圖中涂黑部分表示置換片段, 空白部分表示輪回親本

13、93-11的基因組Figur e 2 Distr ibution of introgressed s egments in s even CSSLs on rice chr omosomesBlack parts refer to introgressed s egments, and blank parts refer to recur rent parent (93-11 genome446植物學(xué)通報(bào) 25(4 2008 段上。其中sh-1、sh-2和sh-3就是利用與其緊密連鎖的性狀標(biāo)記得以定位的(Fukuta et al., 1996。隨著分子標(biāo)記的產(chǎn)生和遺傳圖譜的發(fā)展, 利用分子標(biāo)記

14、定位水稻落粒性基因已有較多報(bào)道(李平等, 1996; Sobrizal et al., 1999; Ji et al., 2006。上述研究多采用性狀連鎖或RFLP 標(biāo)記, 利用SSR 標(biāo)記定位水稻落粒性基因的報(bào)道較少。本研究利用SSR 標(biāo)記將來自日本晴的難落?；騫SH-1-1定位在第1染色體RM472-RM1387之間遺傳距離為6.6 cM 的區(qū)段上, 將qSH-6-1定位在第6染色體RM6782-RM3430之間遺傳距離為4.2 cM 的區(qū)段上, 這2個(gè)落粒性QTL 的鑒定及定位為其下一步的精細(xì)定位、圖位克隆及分子標(biāo)記輔助選擇奠定了基礎(chǔ)。水稻落粒性的鑒定有多種方法(應(yīng)存山, 1993;

15、Li et al., 2006; Ji et al., 2006, 各有特色。下落法和揉搓法操作簡單且快捷, 但有時(shí)會(huì)受到用力不均等人為因素的干擾。借助儀器或其它工具對(duì)水稻落粒率進(jìn)行測(cè)量的方法, 雖然在一定程度上消除了人為主觀因素引起的誤差, 但操作相對(duì)繁瑣。本研究認(rèn)為, 對(duì)于由數(shù)量性狀基因座引起的效應(yīng)較小的落粒性QTL, 可以采用輔以儀器的較為客觀的方法。但對(duì)于由基因或主效QTL 引起的水稻落粒性, 由于其遺傳效應(yīng)明顯, 在后代分離群體中易落粒和難落粒的植株極易區(qū)分, 因此在應(yīng)存山(1993所用方法的基礎(chǔ)上略加修改, 采用用力揉搓的方法可以非?？焖俚貐^(qū)分難易2個(gè)不同的質(zhì)量性狀, 該法在利用大

16、群體精細(xì)定位落粒性基因時(shí)尤為適用。代換作圖法是QTL 定位的重要方法(W issuwa et al., 2002。以代換系為實(shí)驗(yàn)材料, 應(yīng)用圖位克隆法對(duì)Hd1、Hd 6和Hd3a 等抽穗期QTL 已進(jìn)行了分子克隆表1 染色體片段置換系中置換片段的分子標(biāo)記基因型Table 1 Genotypes of molecular markers of substitution segment in CSSLs CSSLs Chromo-Genotypes of molecular mar ker s in CSSLs populationssome RM265RM5389RM472RM1068RM138

17、7RM8048RM6782RM528RM3430RM340RM412RM49411I J J J J I I I I I I I 21I I I J J I I I I I I I 31I I I J I I I I I I I I 41I I I I J I I I I I I I 56I I I I I I I J J I I I 66I I I I I I I I J J J J 76I I I I I I I I I J I I CSSLs: 染色體片段置換系; I: 93-11的基因型; J: 日本晴的基因型CSSLs: Chr omosome segment substitutio

18、n lines ; I :Genotype of 93-11; J: Genotype of Nipponbare圖3 水稻落粒性基因qSH-1-1(A和qSH-6-1(B的代換作圖Figur e 3 Substitution mapping of qSH-1-1 (A and qSH-6-1 (B f or seed s hatter ing on rice chromosomes447朱文銀等: 利用染色體片段置換系定位水稻落粒性主效QTL(Yano et al., 2000; Takahashi et al., 2001; Kojima et al., 2002。由于染色體片段置換系只在

19、個(gè)別區(qū)段與受體親本有差異, 所有與受體親本不同的性狀都可能和這些區(qū)段有關(guān)。因此, 染色體片段置換系是代換作圖定位QTL的優(yōu)良材料。本研究通過鑒定7個(gè)染色體片段置換系的落粒性, 利用SSR標(biāo)記置換片段進(jìn)行基因型和長度分析并采用代換作圖的方法, 將落粒性基因qSH-1-1定位在水稻第1染色體, 將落粒性基因qSH-6-1定位在水稻第6染色體。綜合前人研究結(jié)果, 至今在水稻第6染色體與本研究相近的區(qū)域還沒有發(fā)現(xiàn)水稻落粒性主效QTL。因此本研究定位的qSH-6-1是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的落粒性基因。Konishi等(2006將水稻落粒性基因qSH1精細(xì)定位在第1染色體RFLP標(biāo)記C283和R3265之間。通過b

20、last比對(duì), 將這2個(gè)RFLP標(biāo)記及本研究用到的S S R標(biāo)記R M1068整合到水稻物理圖譜上,發(fā)現(xiàn)RM1068與C283和R3265的物理距離很近, 推測(cè)本研究定位的qSH-1-1與qSH1可能為來自日本晴的同一個(gè)落粒性基因。有關(guān)qSH-1-1和qSH-6-1的作用方式、精細(xì)定位及圖位克隆等還有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)李平, 陸朝福, 周開達(dá), 陳英, 李仁端, 朱立煌 (1996. 利用RFLP 標(biāo)記定位水稻重要農(nóng)藝性狀的主效基因與微效基因. 中國科學(xué)(C 輯 26, 257-263.沈圣泉, 莊杰云, 王淑珍, 包勁松, 鄭康樂, 蘇慶堯, 夏英武 (2004.秈稻落粒性QTL定位與環(huán)

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