高效液相色譜法測(cè)定牛奶中的四環(huán)素類抗生素殘留

1、實(shí)驗(yàn)六 高效液相色譜法測(cè)定牛奶中的四環(huán)素類抗生素殘留姓名: 班級(jí):食品科學(xué)學(xué)號(hào):一 目的要求1 通過(guò)實(shí)驗(yàn)強(qiáng)化對(duì)高效液相色譜法分離及定量分析原理的理解;2 直觀了解流動(dòng)相組成在高效液相色譜中對(duì)分析物保留時(shí)間和分離度的影響;3 直觀了解高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu);4 掌握利用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析的方法。二 實(shí)驗(yàn)原理在畜牧生產(chǎn)過(guò)程中,將一些抗菌素作為添加劑以較低濃度加入到飼料中,可使導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)效率下降的支原體病等慢性傳染病得到有效抑制,因而能夠促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。但是,這種做法常導(dǎo)致在動(dòng)物性食品中的抗生素殘留,人類食用后導(dǎo)致耐藥菌群的產(chǎn)生,將會(huì)產(chǎn)生一系列嚴(yán)重后果。四環(huán)素類抗生素就是被經(jīng)常使用的一類抗生素,其中四

2、環(huán)素(Tetracycline, TC 、土霉素(Oxytetracycline, OTC 和金霉素(Chlortetracycline, CTC 就是該類抗生素中的三種,是提取自鏈霉菌屬培養(yǎng)液的廣譜抗生素,結(jié)構(gòu)如下:我國(guó)和歐盟規(guī)定其在牛奶中的最大殘留限量為0.1 mg/kg 。三種抗生素在酸性條件下穩(wěn)定,易與蛋白質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈結(jié)合,且易與金屬離子形成鰲合物。在乙二胺四乙酸二鈉(EDTA 存在條件下,用草酸甲醇提取可獲得較高回收率。三種抗生素的共有結(jié)構(gòu)均可在C 18柱上產(chǎn)生保留,OTC 和CTC 均與TC 僅差一個(gè)取代基,采用適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相,以反相色譜方式可將三者有效分離。三者具有共同的發(fā)色團(tuán),在2

3、25、268和360nm 均有吸收,短波吸收易受干擾,采用360nm 作為吸收檢測(cè)波長(zhǎng)可獲得較好的同時(shí)測(cè)定結(jié)果。采用外標(biāo)法對(duì)樣品中三種抗生素進(jìn)行定量分析。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液系列分別進(jìn)行高效液相色譜分離,測(cè)定三者各自的峰面積,并以此回歸三者的工作曲線,樣品分離后通過(guò)測(cè)定三者各自峰面積,可在各自工作曲線上計(jì)算出濃度。三 儀器與試劑1 儀器LC-20AT 型高效液相色譜儀,配備SPD-20A 型紫外檢測(cè)器(日本Shimadzu 公司;B5500S-MT 型超聲清洗器(上海必能信超聲有限公司;L500臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;BS 124S 電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。2 試劑甲

4、醇、乙腈、草酸、EDTA 均為分析純?cè)噭?TC 、OTC 和CTC 標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)Ehrenstorfer 公司含量98%。OHOHCONH 2N(CH 32H 3COHTetracycline OHOHCONH 2N(CH 32OHH 3COHOxytetracycline OHOHCONH 2N(CH 32ClH 3COHChlortetracycline四實(shí)驗(yàn)步驟1 試劑配制草酸水溶液:稱取1.26 g草酸,用水溶解并定容于1000 mL,濃度為0.01 mol/L。草酸甲醇溶液:稱取1.26 g草酸,用甲醇溶解并定容于1000 mL,濃度為0.01 mol/L。TC、OTC、CTC標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)

5、備液:分別稱取TC、OTC、CTC各1 mg,用甲醇溶解并定容于10 mL,濃度均為100 mg/L,儲(chǔ)存于-18冰箱中。2 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列和樣品制備標(biāo)準(zhǔn)溶液制備:吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋,制成三者濃度均為0.05、0.10、0.25、0.50、1.0、2.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,此標(biāo)準(zhǔn)系列儲(chǔ)存于4 冰箱可保存3 d。樣品制備:準(zhǔn)確稱取牛奶樣品5 g,置于50 mL離心管中,加入5 mL 0.01 mol/L的草酸甲醇溶液、0.1 g EDTA,旋渦混合3 min,超聲振蕩3 min,以10000 r/min離心10 min,取出全部上清液并量出體積(或用流動(dòng)相稀至最近整數(shù)體積,

6、過(guò)0.45 m濾膜后供測(cè)定。3 測(cè)定色譜柱為Nova-Pak C18柱,填料粒徑4 m,柱尺寸300 mm3.9 mm;流動(dòng)相為乙腈+甲醇+0.01 mol/L草酸水溶液(22+8+70;流速為1.0 mL/min;柱溫30 ;檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm,帶寬20 nm,參比波長(zhǎng)430 nm,帶寬50 nm;進(jìn)樣量25 L。升高流動(dòng)相中乙腈比例至35,降低水比例至57,觀察在高效液相色譜中流動(dòng)相組成的改變對(duì)分析物保留時(shí)間和TC、OTC、CTC之間分離度的影響。4實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,按要求關(guān)好儀器。五結(jié)果處理1 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液系列中的每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行3次分離,記錄每次分離中TC、OTC、CTC各自的峰面積并

7、求平均值,對(duì)該系列各自峰面積的平均值和濃度值進(jìn)行線性回歸,獲得各自標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A i=a i+b i C i中的a i和b i,其中i=1、2、3,代表TC、OTC、CTC。該項(xiàng)工作亦可利用儀器的功能在儀器上完成。2 對(duì)測(cè)定的樣品溶液分別進(jìn)行3次分離,記錄每次TC、OTC、CTC各自的峰面積并求平均值,將各值代入各自Ai=ai+biCi中,得到樣品的結(jié)果。該項(xiàng)工作亦可利用儀器的功能在儀器上完成。六注意事項(xiàng)1 分離要在基線穩(wěn)定條件下進(jìn)行,否則峰面積計(jì)算的準(zhǔn)確性會(huì)受到影響。2 色譜柱在測(cè)定結(jié)束后要用純甲醇清洗至少1 h以上七結(jié)果處理 八思考題1 在牛奶中四環(huán)素類抗生素的提取過(guò)程中,加入EDTA的作用是什么?答:三種四環(huán)素都容易和金屬離子螯合,而EDTA是一種良好的金屬離子螯合劑,可以置換出四環(huán)素中的金屬離子,可以排除金屬離子對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。2 在牛奶中四環(huán)素類抗生素的提取過(guò)程中,加入甲醇和草酸的作用是什么?答:草酸甲醇可以洗脫掉四環(huán)素上的蛋白質(zhì),可是四環(huán)素的回收率提高。3 為什么在氣相色譜中溫度對(duì)分析物的保留時(shí)間和分離度有較大影響,而在高效液相色譜中,該因素