先天性巨結(jié)腸神經(jīng)生長因子mRNA表達(dá)水平的RT-PCR研究

1、先天性巨結(jié)腸神經(jīng)生長因子mRNA表達(dá)水平的RT-PCR研究摘要目的： 探討神經(jīng)生長因子(NGF)的生物作用與先天性巨結(jié)腸癥發(fā)病機(jī)制間的關(guān)系。方法： 采用加入一定量化因素的RT-PCR技術(shù)檢測了8例先天性巨結(jié)腸癥、 1例神經(jīng)節(jié)細(xì)胞過少癥以及1例腸神經(jīng)元發(fā)育不良癥不同節(jié)段腸組織NGF mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果： 無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的巨結(jié)腸狹窄段和節(jié)細(xì)胞過少的腸組織與擴(kuò)張段近端正常腸組織相比， 其NGF mRNA表達(dá)水平降低， 陽性率分別是2/9和8/9， 腸神經(jīng)元發(fā)育不良的病變腸組織NGF mRNA表達(dá)水平亦有下調(diào)趨勢。結(jié)論： NGF與腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系密切， NGF mRNA表達(dá)的異常可能參與先天性巨

2、結(jié)腸的發(fā)病機(jī)制； 但無節(jié)細(xì)胞癥是多因素綜合作用的結(jié)果， NGF也許僅影響節(jié)細(xì)胞功能的成熟。關(guān)鍵詞巨結(jié)腸， 先天性神經(jīng)生長因子逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) RT-PCR Study of Expression of NGF in Hirschsprungs DiseaseLi Jie, Zhang Xiansheng, Gao Ya, et al.Department of Pediatric Surgery, Second Affiliated Hospital, Xian Medical University, Xian 710004AbstractObjective: The aim of the

3、study is to investigate the relationship between the nerve growth factor(NGF)and pathogenesis of Hirschsprungs disease. Methods: The expression of NGF mRNA was studied with RT-PCR technique in 8 specimens of Hirschsprungs disease, 1 specimen of hypoganglionosis and 1 specimen of intestinal neuronal

4、dysplasia(IND). Results: The expression of NGF mRNA in aganglionic and hypoganglionic colon(2/9) was less than that in the proximal normal colon(8/9) and normal control. The IND specimen also showed decreased expression. Conclusions: The study suggests that NGF may be involved in development of ente

5、ric nerve system. Abnormality in NGF expression may be related to the pathogenesis of Hirschsprungs disease, and affect the maturation of ganglion cells.Key wordsHirschsprungs diseaseNerve growth factorReverse transcription polymerase chain reaction先天性巨結(jié)腸癥(Hirschsprungs disease, HD)痙攣段腸管神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如的原因尚不

6、清楚。有關(guān)移行停滯假說、 缺血假說和微環(huán)境假說都未能確切地解釋該病的發(fā)病機(jī)制。有證據(jù)表明， 神經(jīng)生長因子(NGF)是一種最早發(fā)現(xiàn)的靶源性神經(jīng)營養(yǎng)因子， 其在腸組織內(nèi)蛋白和mRNA水平均有表達(dá)， 并且巨結(jié)腸模型鼠的病變腸組織NGF免疫染色不同于正常腸組織1。本文通過RT-PCR技術(shù)對人狹窄段和擴(kuò)張段近端正常腸組織標(biāo)本NGF mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測和比較， 以探討NGF與HD腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如的發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。資料與方法一、 臨床資料：收集1996年8月至1997年2月西安地區(qū)收治的臨床診斷為HD的患兒共10例(男9例， 女1例)， 年齡9個(gè)月5歲。術(shù)中無菌留取切除的狹窄段、 擴(kuò)張段近端的腸組織，

7、 液氮中速凍后-70保存待用。術(shù)后病理診斷： 符合HD者8例， 神經(jīng)節(jié)細(xì)胞過少癥(hypoganglionosis)和腸神經(jīng)元發(fā)育不良癥(intestinal neuronal dysplasia, IND)各1例。此外， 同法收集正常直腸標(biāo)本1份為正常對照； NGF有較高表達(dá)的腦組織標(biāo)本1份作陽性對照。二、 mRNA分析：1. 腸組織總RNA的提?。?腸組織(-70)約1.0 cm1.0 cm大小于預(yù)冷的乳缽中， 加入1.0 ml變性液， 迅速研磨成勻漿， 用皮試針頭抽吸1520次使成乳糜狀。采用AGPC快速一步法(異硫氰酸胍， Gibco公司， 德國)提取組織總RNA。紫外光柵分光光度儀(

8、上海第三儀器廠， 752型)測定260.0 nm、 280.0 nm的OD值， 計(jì)算濃度C=OD26040 (mg/ml)以及OD260/OD280值， 采用瓊脂糖凝膠電泳法觀察RNA的完整性?？俁NA經(jīng)乙醇沉淀、 回收、 定量后用DEPC水稀釋成1 mg/ml的溶液。2. RT-PCR： 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)： 總體積20.0 ml， 含樣品總RNA1.0 ml(1.0 mg)， AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司， 美國)5U， RNasin(華美生物工程工司)20 U， 隨機(jī)引物Randerm 9 mer(TaKaRa公司， 日本)2.5 mmol/L， dNTPs(TaKaRa公司， 日

9、本)1.0 mol/L， 5RT Buffer 4.0 ml。42溫浴1小時(shí)， 95滅活逆轉(zhuǎn)錄酶10分鐘。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)： RT產(chǎn)物分兩個(gè)反應(yīng)體系分別對NGF和-actin進(jìn)行擴(kuò)增。NGF特異性寡核苷酸引物序列為： Primer 15CCA TAT GTC ATC ATC CCA TCC CAT C 3， Primer 25CGG ATC CTT AGG CTC TTC TCA CAG CCT 3， 擴(kuò)增片段為380 bps; -actin特異寡核苷酸引物序列為： Primer 15CGC GAG AAG ATG ACC CAG AGC ATG3, Primer 25AGG ATC T

10、TC ATG AGG TAG TCA GT 3, 擴(kuò)增片為233 bps。各反應(yīng)體系總體積均為50.0 ml， 組分如下： cDNA 5.0 ml, 引物P1、 P20.4 mmol/L， dNTPs0.2 mmol/L， 10Buffer 5 ml， MgCl22.5 mmol/L。熱循環(huán)(西安順達(dá)電子有限公司熱循環(huán)儀， SX-240C)采用高溫啟動(dòng)， 即首次變性后加入Taq DNA聚合酶(華美)2.5 U。熱循環(huán)參數(shù)： 97預(yù)變性7分鐘， 95變性1分鐘， 55復(fù)性1分鐘， 72延伸2分鐘， 40個(gè)循環(huán)后72延伸8分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳溴化乙錠染色法觀察并拍照。對照： 以狹窄段病

11、變腸組織為觀察組， HD擴(kuò)張段近端正常結(jié)腸組織為自身對照， 正常直腸組織為正常對照， 腦組織總RNA為陽性對照， 去離子無菌水為陰性對照， 對-actin擴(kuò)增作為質(zhì)控。結(jié)果紫外分光光度儀測定提取的總RNA的OD260/OD280的值達(dá)到1.71.9之間， RNA電泳清晰顯示rRNA的28 s， 18 s， 5 s三亞基的3條帶及其間的拖帶， 說明總RNA的純度和完整性良好。在8例HD、 1例神經(jīng)節(jié)細(xì)胞過少癥的腸組織NGF mRNA的檢測中， 狹窄段陽性檢出率為2/9， 而擴(kuò)張段近端正常腸組織陽性檢出率為8/9， 在兩段腸管均顯陽性時(shí)， 前者陽性帶亮度亦弱于后者。IND切除之狹窄段和擴(kuò)張段均表現(xiàn)

12、出一致的病理改變， NGF mRNA的檢測均為陰性； 正常直腸NGF mRNA擴(kuò)增呈強(qiáng)陽性， 且重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到相同的結(jié)果。-actin在各反應(yīng)體系里擴(kuò)增的結(jié)果基本一致， 說明PCR反應(yīng)基本真實(shí)地反映了NGF在組織內(nèi)的表達(dá)水平。討論腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞共同構(gòu)成的腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric neural system, ENS)， 是胚胎期由神經(jīng)嵴細(xì)胞從原腸口端向尾端遷移、 定位， 而后分化而來。對HD的模型鼠的研究表明， 病變腸管局部微環(huán)境不利于神經(jīng)嵴細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育和正常存活2。近年來許多研究致力于發(fā)現(xiàn)和闡明微環(huán)境中異常的局部因子及其作用。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR方法對腸組織NGF mRNA表達(dá)

13、情況進(jìn)行檢測， 是因?yàn)镹GF mRNA在組織內(nèi)表達(dá)的豐度一般很低， 而RT-PCR比Northern雜交更具敏感性。我們在定性檢測的基礎(chǔ)上加入了一些定量的因素， 包括固定了模板RNA的質(zhì)量， 反應(yīng)體系和熱循環(huán)參數(shù)， 使PCR反應(yīng)更具穩(wěn)定性和可比性。關(guān)于NGF mRNA在腸組織的表達(dá)Kuroda等3曾最先作過研究， 但其結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)所得不盡相同， 估計(jì)可能與所用引物不同， 擴(kuò)增的NGF mRNA的目的片段不同有關(guān)。在8份HD的正常結(jié)腸和1份正常兒童直腸組織內(nèi)檢測到NGF mRNA較高的表達(dá)水平， 提示NGF可能參與ENS的正常發(fā)育。而在節(jié)細(xì)胞缺如和過少的腸組織， NGF mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)下調(diào)

14、的趨勢。由于組織細(xì)胞對蛋白質(zhì)表達(dá)主要在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)， NGF mRNA表達(dá)的下調(diào)將直接影響NGF的生成。結(jié)果提示HD神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如可能與節(jié)段性腸管NGF mRNA表達(dá)下調(diào)有關(guān)。有研究4表明， 在人胚的第12周， 遠(yuǎn)端直腸已能檢測出克隆化的神經(jīng)節(jié)前體細(xì)胞。NGF高親和力受體TrkA則在胚胎第19周才檢測到， 而生后正常腸管ENS細(xì)胞上均可檢測出NGF和TrkA5， 提示NGF可能是通過影響遷移后神經(jīng)節(jié)前體細(xì)胞的增生、 存活、 功能維持而發(fā)揮作用的。根據(jù)神經(jīng)營養(yǎng)理論6及其與細(xì)胞程序性死亡7的關(guān)系， 推測節(jié)段性NGF mRNA表達(dá)的下調(diào)可能使處于增生狀態(tài)的神經(jīng)節(jié)前體細(xì)胞得不到足夠的神經(jīng)營養(yǎng)信號(hào)， 使

15、發(fā)生程序性細(xì)胞死亡的規(guī)模擴(kuò)大， 最終導(dǎo)致節(jié)細(xì)胞減少或完全缺如。但這一解釋尚不能說明NGF表達(dá)下調(diào)亦出現(xiàn)在以節(jié)細(xì)胞增生為特點(diǎn)的IND的病變腸管。最近的研究又發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)素-3(NT-3)5和NGF低親和力受體8在HD無節(jié)細(xì)胞腸管表達(dá)也存在異常。可見， HD神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如的發(fā)生可能是多因素作用的結(jié)果。綜上所述， 本研究結(jié)果提示， NGF與ENS正常發(fā)育關(guān)系密切， 可能參與HD的發(fā)病機(jī)制， 但在多因素共同作用的機(jī)制中， NGF可能僅影響到節(jié)細(xì)胞功能的成熟。本研究僅從神經(jīng)營養(yǎng)角度對HD發(fā)病機(jī)理進(jìn)行了初步探討， 并且可能給包括IND、 慢性特發(fā)性假性腸梗阻及兒童慢性便秘等臨床上稱類巨結(jié)腸癥(pseudo

16、 HD)9的一類疾病的病因研究提供了一定的啟示。作者單位： 710004西安醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院小兒外科(第一作者現(xiàn)在北京腫瘤醫(yī)院放射科， 100036)參考文獻(xiàn)1Kuroda T, Hirabayashi T， Fuchimotu Y. The localization of nerve growth factor in intestines of normal rats and megacolonic mice. J Smooth Muscle Res, 1991, 27:401-402.2Jacobs CRJ, Patette RF, Gershon MD, et al. Inabili

17、ty of neural crest cell to colonize the presumptive aganglionic bowel of IS/Is mutant mice. J Comp Neurol, 1987, 255:425-438.3Kuroda T, Veda M, Nakano M, et al. Altered production of nerve growth factor in aganglionic intestines. J Pediatr Surg, 1994, 29:288-293.4Fujimoto T, Hata J, Yokoyama S, et a

18、l. A study of the extracellular martrix protein as the migration pathway of neural crest cell in the gut:analysis in human embryos with a special reference to the pathogenesis of Hirschsprungs disease. J Padiatr Surg, 1989, 24:550-556.5Hoehner JC, Wester T, Pahlman S, et al. Localization of neurotrophins and their high-affinity receptor during human enteric nervous system