大鼠尾加壓素II收縮大鼠肺動脈干與蛋白激酶C通路相關(guān)性研究

1、大鼠尾加壓素II收縮大鼠肺動脈干與蛋白激酶C通路相關(guān)性研究                作者：薛必成 陳少賢 龔永生 徐正 王良興 范小芳  【摘要】  目的 研究大鼠尾加壓素-II（RUII）收縮大鼠離體肺動脈干環(huán)與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白激酶C通道的關(guān)系。方法 從雄性Sprague-Dauley大鼠中分離出肺動脈干，切成34mm的血管環(huán)，用RUII（10nmol/L）預(yù)收縮血管達(dá)坪臺期后，加入蛋白激酶C通道阻斷劑H-7，制備H-7(0

2、.1100mol/L) 濃度效應(yīng)舒張曲線，最后分別計算EC50和Emax。 結(jié)果 H-7呈濃度依賴性舒張大鼠RUII預(yù)收縮的肺動脈干 -logEC50=5.26±0.36, Emax =(97.21±17.86)%。 結(jié)論 細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白激酶C通道的激活參與大鼠尾加壓素-II收縮大鼠肺動脈干效應(yīng)。 【關(guān)鍵詞】  尾加壓素-II 蛋白激酶C 肺動脈干【Abtract】  Objective  The aim of our study was to investigate the influence of protein kianse C i

3、nhibition on rat urotensin II induced vasoconstriction. Methods  The main truncus pulmonalis was dissected from the male Sprague-Dawley rat， artery ring width was 34mm.Inhibitor of protein kinase C channel,H-7(0.1100mol/L) were added into medium after rat urotensin II（10nmol/L）induced vasoconst

4、riction had reached plateau to construct the relaxant concentration-response curves and their EC50 and Emax. Results  H-7 caused concentration-dependent relaxations of rat urotensin II precontracted arteries  -logEC50=5.26±0.36, Emax =(97.21±17.86)% of the response to 10 nmol/L r

5、at urotensin II. Conclusion  Rat UII induced rat main pulmonary artery contraction is related to the activation of protein kinase C signal transduciton pathway.【Key words】  urotensin II  protein kinase C  truncus pulmonalis  尾加壓素-II(RU II)是最早從硬骨魚尾部神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)中提取出來的多肽，隨后，兩棲類

6、及哺乳類動物大腦中也發(fā)現(xiàn)RUII，起生物學(xué)效應(yīng)的羧基末端是環(huán)形六肽結(jié)構(gòu)，它在從魚到人的物種中呈高度的保守性。RUII受體為G蛋白藕聯(lián)受體GPR-14，它是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最強效血管收縮活性肽。RUII收縮血管效應(yīng)與多條細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，例如已有的研究結(jié)果，表明RUII收縮血管作用與激活Ca離子通道、Rho激酶、蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）、酪氨酸激酶及磷酯酶C通路等有關(guān)5。另外，研究表明RUII還通過c-Src/PKC/MAPK細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的增生6，還可以通過激活PKC與MAPK增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度7。RUII是大鼠離體肺動脈干的有效收縮劑，

7、并且其收縮作用可被MAPK阻斷劑PD98059所阻斷7，8，形成肺動脈高壓后，肺動脈干對RUII的收縮反應(yīng)增強9。因此，研究RUII收縮肺動脈效應(yīng)與PKC通路的關(guān)系，對于闡明RUII對肺動脈的作用機制以及在肺動脈高壓形成與發(fā)展等病理過程中所起的作用有著重要意義。1  材料與方法1.1  材料 雄性Sprague-Dawley 大鼠(350450g)用戊巴比妥鈉麻醉后，分離出肺動脈干，剔除周圍結(jié)締組織后切成3-4mm動脈環(huán),垂直懸掛在含15ml Krebs 液的浴槽中。Krebs液成份（單位為mmol/L）: NaCl 18.4,KCl 4.7, KH2PO4 1.

8、2,MgSO4 1.2,CaCl2 2.5,NaHCO3 25,glucose 11 ，EDTA 23mol/L。 Krebs液pH 7.4，溫度(37±1)，并持續(xù)通含95%O25%CO2的氣體。血管環(huán)在最適前負(fù)荷（1.0g）下平衡90min后加入60mmol/L濃度的KCl。浴槽中的液體每隔30min換一次。平衡結(jié)束后，先用60 mmol/L KCl預(yù)收縮血管環(huán)。經(jīng)過反復(fù)沖洗待血管張力回至基線后，向浴槽加入新鮮配制的RUII,使最終濃度為10nmol/L，血管環(huán)的張力變化通過張力換能器用多道生理記錄儀記錄。藥品RUII購自sigma，用1mmo/1L醋酸鹽母液用蒸餾水保存在-20

9、條件下，H-7(購自sigma)溶解在DMSO（二甲基亞砜）中，其余試劑均達(dá)到分析純水準(zhǔn)。所有試劑均在實驗當(dāng)天配制，避光保存在冰箱中。1.2  方法 在RUII（10nmol/L）預(yù)收縮大鼠離體肺動脈干環(huán)達(dá)到坪臺期后，向浴槽內(nèi)加入累積濃度H-7(0.1100mol/L)，每隔5min加一次藥，觀察PKC通道阻斷劑H-7對大鼠RUII預(yù)收縮血管的舒張效應(yīng)。1.3  統(tǒng)計學(xué)分析 根據(jù)不同藥物濃度下的血管舒張值制備劑量-效應(yīng)曲線，在每次實驗中分別計算抑制血管收縮值的百分?jǐn)?shù)，最后的值用（x±s)表示，EC50與Emax值用Scatchar法將濃度-效應(yīng)

10、曲線轉(zhuǎn)化為直線后通過回歸運算求得。計算公式為E=C×EmaxC×EC50，E為舒張效應(yīng)值，C為藥物濃度，EC50為達(dá)最大舒張反應(yīng)一半所需藥物濃度，Emax為最大舒張幅度。2  結(jié)果         3  討論   本研究證實PKC通道阻斷劑H-7呈劑量依賴性舒張RUII (10nmol/L)預(yù)收縮的大鼠肺離體主動脈環(huán)，-log=5.26±0.36、Emax=(97.21±17.86)%，提示RUII收縮肺動脈干部份通過PKC細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

11、通路介導(dǎo)，與文獻(xiàn)相一致，即RUII收縮大鼠胸主動脈可被PKC通道阻斷劑Chelrythrine及NPC-15437部份阻斷5。    自從發(fā)現(xiàn)RUII是迄今為止最強效的血管收縮活性肽后，國內(nèi)外針對RUII收縮分離自各種物種離體血管環(huán)的效應(yīng)做了大量研究，尤其是在其動脈收縮效應(yīng)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機制方面。目前已發(fā)現(xiàn)RUII與多條細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)，從而逐步揭示RUII的生物學(xué)效應(yīng)作用機制，進而揭示其在病理生理學(xué)方面的作用機制，。然而以往對RUII收縮血管效應(yīng)研究多集中在胸主動脈等大血管上，有關(guān)RUII對肺動脈干的效應(yīng)及其細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路少有報道。已知，RUII不但是

12、最強效的血管收縮物質(zhì)，還是強有效的血管舒張劑，有報道RUII可以舒張分離自人體的肺小動脈環(huán)11，因此，研究RUII對肺動脈的效應(yīng)以及其相關(guān)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對于揭示RUII對肺動脈的作用機制方面，特別是在相關(guān)疾病如肺動脈高壓的形成與發(fā)展過程中的病理生理學(xué)作用方面，顯得很有必要。   作者此前的研究8，證實RUII是大鼠離體肺動脈干環(huán)的強效血管收縮劑：-logEC50=7.95±0.40, Emax =(14.28±6.34)%(以60mmol/L KCl的收縮幅度為100%)，并首次證實其收縮效應(yīng)部份通過MAPK介導(dǎo)。本研究結(jié)果表明RUII收縮大鼠肺動脈

13、干環(huán)部份通過PKC通路介導(dǎo)，結(jié)合RUII通過PKC，MAPK細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增生。   相信通過未來進一步的研究，可以逐漸揭示RUII在諸如低氧肺動脈高壓等相關(guān)病理生理過程中的作用機制。資助基金項目：浙江省教育廳  科學(xué)基金20020468號【參考文獻(xiàn)】  1 Pearson D, Shively JE, Clark BR,et al. Urotensin II: a somatostatin-like peptide in the caudal neurosecretory system of fishes.Proc Natl Aca

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