體外診斷試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術指導原則-酶聯(lián)免疫

1、體外診斷試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術指導原則酶聯(lián)免疫法試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術指導原則（報批稿）2009-05-15 09:00    酶聯(lián)免疫診斷試劑是指在酶標板上包被特定的抗原（和/或抗體）后，利用直接或間接的方法與待測樣品中的相關抗體（和/或抗原）反應，形成的抗原抗體復合物再與相應的酶標記的抗體和/或抗原進一步反應，經(jīng)過酶催化底物發(fā)生顯色反應，由形成的顏色的強弱來判斷樣本中相應的抗體和/或抗原的存在。    為了規(guī)范酶聯(lián)免疫診斷試劑的生產(chǎn)和質(zhì)量控制，制定本技術指導原則。    本指導原則適用于有關病原微生物

2、檢測的第三類體外診斷試劑的生產(chǎn)和質(zhì)量控制，其它酶聯(lián)免疫法檢測試劑（如第二類等）參考本指導原則執(zhí)行。國家藥品監(jiān)督管理部門將依據(jù)科學技術發(fā)展的需要，適時組織修訂。    一、基本原則    （一）研制、生產(chǎn)用的各種原料、輔料等應制定其相應的質(zhì)量標準，并應符合有關法規(guī)的要求。    （二）試劑生產(chǎn)企業(yè)應具備相應的專業(yè)技術人員、儀器設備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境，獲得醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證；同時，應按照體外診斷試劑生產(chǎn)實施細則（試行）的要求建立相應的質(zhì)量管理體系，形成文件和記錄，加以實施并保持有效運行；還應通過體外診斷試劑生

3、產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評定標準（試行）的考核。企業(yè)應對試劑的使用范圍做出明確規(guī)定，并經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理部門批準。    （三）診斷試劑的研制應當按照科學、規(guī)范的原則，各反應條件的選擇和確定應符合基本的科學原理。    （四）試劑在研制、生產(chǎn)過程中所用的各種材料及工藝，應充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。    （五）生產(chǎn)和質(zhì)量控制的總體目標：保證試劑使用安全、質(zhì)量穩(wěn)定、工藝可控、檢測有效。    二、原材料質(zhì)量控制    （一）主要生物原料&#

4、160;   與產(chǎn)品質(zhì)量最密切相關的生物原料主要包括各種天然抗原、重組抗原、單克隆抗體、多克隆抗體以及多肽類、激素類等生物原科。這類原料可用于包被酶標反應板、標記相關酶（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應用抗原或抗體、制備校準品（標準品）等。使用前應按照工藝要求對這類生物原料進行質(zhì)量檢驗，以保證其達到規(guī)定的質(zhì)量標準。主要生物原料若為企業(yè)自己生產(chǎn)，其工藝必須相對穩(wěn)定；若購買，其供應商要求相對固定，不能隨意變更供應商，如果主要原料（包括工藝）或其供應商有變更，應依據(jù)國家相關法規(guī)的要求進行變更申請。    主要生物原料的常規(guī)檢驗項目一般包括：

5、    1外觀    肉眼觀察，大部分生物原料為澄清均一的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒；或者為白色粉末，不含其他顏色的雜質(zhì)；特殊生物原料應具備相應外觀標準。    2純度和分子量    主要經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進行分析，也可用其他適宜的方法，如高效液相法等。根據(jù)所檢測生物原料的分子量選擇適宜聚丙烯酰胺凝膠濃度進行電泳，一般每個電泳道加樣量為5g，電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍染色或銀染法染色。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量，純度應

6、達到相應的質(zhì)量標準，分子量大小應在正確的條帶位置。    3蛋白濃度    蛋白濃度可通過Lowry法、280nm 光吸收法、雙縮脲法或其他適宜的方法進行檢測。    4效價    效價的測定一般根據(jù)蛋白含量測定結(jié)果，通過倍比稀釋法進行。效價應達到規(guī)定的要求。    5功能性實驗    功能性實驗是指生物原料用于試劑盒實際生產(chǎn)中的情況，一般考查使用該原料的試劑盒的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性等，并比較其與上批次原料的相關性

7、。    （二）生物輔料    生物輔料一般指在生產(chǎn)過程中作為蛋白保護劑用途的一類生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。這些生物原料的質(zhì)量標準應符合2000年版的中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標準規(guī)定的標準要求，并且要適合于本企業(yè)的生產(chǎn)。建議作以下檢驗：    1. 牛血清或羊血清    外    觀：為淺黃色澄清稍粘稠的液體，無溶血或異物    無菌試驗：將血清直接37放置7天，明亮處觀察，不

8、得出現(xiàn)混濁或沉淀。    總蛋白含量：用雙縮脲法測定，蛋白含量32mg/ml。    球蛋白含量：取待測血清1ml，采用飽和硫酸銨法進行沉淀，沉淀溶于0.85%NaCl溶液，至1ml，用Lowry方法測定，蛋白含量應2mg/ml。    2. 牛血清白蛋白：    外  觀：應為淺黃色、黃色或乳白色的凍干粉末，無吸潮，無結(jié)塊，無肉眼可見的其它雜質(zhì)顆粒。    溶解性：將牛血清白蛋白配成10%溶液，在18?26時，溶解時間應15分鐘，pH

9、值應為6.5?7.1。    總蛋白含量：用雙縮脲法，其標準為95。    總蛋白中的BSA含量：采用硝酸纖維素膜電泳法，其標準為95%。    BSA的凈含量：總蛋白含量乘總蛋白中的BSA含量，其標準為90%。    3. 酪蛋白：    應符合生產(chǎn)所需的質(zhì)量標準。    4標記用酶    應在產(chǎn)品的質(zhì)量標準中明示所使用的標記用酶的名稱（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時應根據(jù)不同

10、生產(chǎn)廠家的檢驗方法和質(zhì)量標準進行檢驗，酶的純度RZ值（OD403nm/OD280nm）應大于3.0。    對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應進行功能性實驗，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品，進行酶聯(lián)免疫測定，均不能出現(xiàn)非特異性反應。    生物輔料的供應商同樣要求相對固定，不得隨意變更供應商。    （三）化學原材料    化學原材料的質(zhì)量標準，包括外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值、溶解情況、干燥失重、熾灼殘渣等，均應符合中國生物制品主要原輔材料質(zhì)

11、控標準（2000年版）分析純級別的要求，并且要適合于本企業(yè)的生產(chǎn)。    主要化學原材料的供應商要求相對固定，不得隨意發(fā)生變更。化學原材料在購入時，原材料的生產(chǎn)商必須提供該批次化學原材料的質(zhì)量保證材料和質(zhì)量檢驗報告。    （四）其他物料    1酶標板    外觀    明亮處用肉眼觀察板條的外觀質(zhì)量，如有欠注、飛邊、骯臟、表面光潔度差，底部有波紋及劃傷等應剔除。    吸附能力和精密性  &#

12、160; 采用合適的方法進行檢驗。    一般用一定濃度的正常人IgG包被板條，再用一定濃度的抗人IgG酶結(jié)合物吸附，通過顯色反應，使用酶標儀讀數(shù)，計算CV值。CV值結(jié)果應符合相關產(chǎn)品的功能性質(zhì)量標準，一般批內(nèi)CV5，批間CV10。    2液體試劑裝量瓶    包括陰陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等液體組分，均應有相應的裝量瓶，并建立相應的質(zhì)量控制標準，如不同的液體試劑所用的裝量瓶規(guī)格、裝量瓶的顏色、瓶蓋的顏色等。    3其他材料

13、60;   包括試劑瓶標簽、粘膠紙、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說明書、干燥劑和包裝外盒等，應參照國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的體外診斷試劑說明書編寫指導原則和醫(yī)療器械說明書、標簽和包裝標識管理規(guī)定建立相應質(zhì)量控制標準。    （五）企業(yè)質(zhì)控品    企業(yè)質(zhì)控品一般包括陰陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性、hook效應等質(zhì)控樣品，對于定量檢測試劑，還包括線性質(zhì)控品樣品。如該產(chǎn)品具有國家標準品或參考品，應使用國家標準品（參考品）進行標化；若該診斷試劑沒有國家標準品（參考品），則企業(yè)參考品的制備應有規(guī)范的質(zhì)

14、量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。    企業(yè)質(zhì)控品的基質(zhì)應與診斷試劑的待測樣品的基質(zhì)基本一致，如待測樣品為血清/血漿，質(zhì)控品基質(zhì)也應為血清/血漿。    三、試劑盒各組分的生產(chǎn)    酶聯(lián)免疫診斷試劑盒主要組分的生產(chǎn)包括酶標記物的制備及滴配過程（酶工作液濃度確定）、各種工作溶液的配制、包被酶標反應板、分裝及包裝等步驟；并通過產(chǎn)品的半成品檢驗和成品檢驗兩個質(zhì)控過程來保證其質(zhì)量符合規(guī)定。    （一）

15、各種工作液的配制    酶聯(lián)免疫診斷試劑研制生產(chǎn)過程中所用的工作液一般包括：包被液、封閉液、陰性陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液、終止液等，對定量檢測試劑，還包括標準品（或校準品）溶液。若陰性、陽性對照或其他液體組分涉及生物安全性問題，制備時應在相應的生物安全實驗室完成。    各種工作液在配制過程中應嚴格按質(zhì)量標準中的配方進行配制，充分混勻確保液體中的各種成分均勻，同時進行相應的質(zhì)量檢驗并達到質(zhì)量標準后，方可使用或分裝。對于定量檢測試劑，其標準品（或校準品）溶液應具有量值溯源性。 

16、0;  應對配制過程及配制的液體進行的質(zhì)量控制，主要包括酶結(jié)合物的功能性實驗及穩(wěn)定性；各種溶液的外觀、pH值等；酶作用底物應測定在無相應酶的情況下自身顯色的情況，并制定合理的限定指標；終止液應對其終止酶促反應的能力進行測定。    （二）包被酶標反應板    包被前應對酶標反應板進行質(zhì)量檢驗，如尺寸、外觀、包裝、吸附性能、精密性等，并記錄酶標反應板的批號、數(shù)量、標識。酶標反應板經(jīng)檢驗合格后方能用于包被。不同批號的板條不能混用。    選擇經(jīng)檢驗合格的包被原料（如抗原、抗體等），經(jīng)一定的方法確定最

17、佳包被濃度和酶結(jié)合物工作濃度，按照診斷試劑的生產(chǎn)規(guī)程，配制包被緩沖液、封閉液，經(jīng)檢驗合格后，包被酶標反應板，經(jīng)干燥后，已包被的酶標反應板用鋁箔紙封閉（內(nèi)置干燥劑），保存于2?8。    應對包被過程進行相應的質(zhì)量控制，如包被用原料（抗原或者抗體等生物活性原料）的質(zhì)量檢驗、包被液和封閉液的質(zhì)控（如配方、外觀、pH值）、包被過程的監(jiān)控（包括包被和封閉的體積、溫度、時間等）、包被均一性檢驗、干燥過程的監(jiān)控等。    （三）分裝和包裝    樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等溶液應嚴格按照

18、質(zhì)量標準中的量進行過濾后再分裝，分裝量的誤差應小于5%。    分裝及包裝均應按照相應的SOP要求進行。包裝前，應嚴格檢查試劑盒的品名、批號等，核對各試劑盒各組分的數(shù)量，并在關盒前進行復核。    四、質(zhì)量控制    （一）半成品質(zhì)量控制    1半成品抽樣    檢驗人員按試劑的批號，根據(jù)抽樣申請單抽取規(guī)定數(shù)量的半成品各組分，作號標記、待檢。    2半成品檢驗    根據(jù)試劑盒的企業(yè)標準或者制檢規(guī)程進行半成品的檢驗。    半成品檢驗，一般使用國家標準品（參考品）或經(jīng)國家標準品（參考品）標化后的企業(yè)參考品。若某類試劑沒有國家標準品（參考品），則使用企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。    檢驗指標一般包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性等，均應達到相應的質(zhì)量標準要求。對于精密性，一般情況