帕金森病細(xì)胞損傷模型論文

1、范文最新推薦帕金森病細(xì)胞損傷模型論文【關(guān)鍵詞】肉蓯蓉；1甲基4苯基 吡啶離子；帕金森?。簧媛?帕金森病(Parkinson ' sdisease,PD )是中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性變性疾 病。一旦出現(xiàn)臨床癥狀，其黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺神經(jīng)元已經(jīng)減少了60%-80%盡管神經(jīng)科學(xué)家采取包括左旋多巴制劑在內(nèi)的各種治療方法，但目前所有的研究都提示無法阻止其進(jìn)展。 生長抑制和DNA損傷153(growtharrest androAdamage inducedgenelSS, GADDI53 )是調(diào)控 細(xì)胞凋亡的一種重要蛋白，在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等應(yīng)激狀態(tài)下大量表達(dá)并轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核1。本研究觀察了肉蓯蓉提取物

2、對1甲基4苯基 吡啶離子(1 methyl 4 phenylpyTidiniumicm, MPP+)介導(dǎo)的SH SY5Y多巴胺能細(xì)胞系損傷的保護(hù)作用及對 GADD15表達(dá)的影響，并探討了其對帕金森病的神經(jīng)保護(hù)作用。1材料與方法1.1材料 肉蓯蓉提取物，上海市東方科技公司產(chǎn)品，PBS稀釋成10mg/ml,22a m濾膜過濾滅菌；MPP+ Sigma公司產(chǎn)品，無菌蒸餾水稀釋成4mol/L ;胎牛血清、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco'''' smodifiedeagle ' ''' smediumQMEM 胰蛋 白酶，均為G

3、ibco公司產(chǎn)品；GADD15小鼠抗人單克隆抗體，SantaCruz 公司產(chǎn)品；小鼠抗人P actiri單克隆抗體，Sigma公司產(chǎn)品；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyltetrazolium,MTT ),荷蘭 Duchefa 公反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒(reversetranscri ptase p o i yme r as ec-ha inreact ion, RT PCR ),MBi公司產(chǎn)品；SH SY5Y細(xì)胞，復(fù)旦大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黃芳老師惠贈(zèng)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組SH SY5Y細(xì)胞每23d用10%DME培養(yǎng)液換液1次。待細(xì)胞增長至80%融合時(shí)，用

4、0.25%胰酶消化細(xì)胞，按1X 105分瓶傳代，置于5%CO2勺細(xì)胞培養(yǎng)箱中。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞分為對照組、MPP組和肉蓯蓉提取物不同濃度組。用DME培養(yǎng)液將MPP按1 : 10梯度稀釋成400mmol/L,按1 : 100體積比例加入96孔板或6孔板中，使MPP終濃度分別為0.25、0.5、1、2和4mmol/L。肉蓯蓉提取物用 DMEM培養(yǎng)液按1 : 10梯度稀釋成 1mg/ml與10卩g/ml兩個(gè)工作濃度。按1 : 100加入96孔板或6孔板中，使終濃度分別為1、10和100卩g/ml。6孔板每孔總體積為2ml,96孔板每孔總體積為200卩l(xiāng)。每項(xiàng)相同實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。1.2.2MTT檢測細(xì)胞活性

5、1.2.2.1MPP+對5H SY5Y細(xì)胞存活率的影響1X 104密度5H SY5Y細(xì)胞200卩l(xiāng)接種于96孔板，24h后換含MPP終濃度分別為0.25、0.5、1、2和4mmol/L的培養(yǎng)液，每濃度3復(fù)孔，置于5%CO培養(yǎng)箱37C孵育，分別于6、12、24和48h時(shí)各孔加入MTT2011 , 繼續(xù)孵育 4h取出培養(yǎng)板。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(dimethylsulphoxideQMSO ) 150l 充分震蕩 10min,待藍(lán)色顆粒完全溶解后用全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Biorad產(chǎn)品）570nm處測定吸光度值。1.2.2.2肉蓯蓉提取物對MPP介導(dǎo)的5H SY5Y細(xì)胞損傷的影響終濃度1mmol

6、/LMPP與肉蓯蓉提取物分別為1、10和100卩g/ml同時(shí)加入96孔板置5%CO2培養(yǎng)箱37C孵育48h。其余步驟同 1.2.2.1。范文最新推薦b 2. 3RT卩CR檢測GADD153勺mRNA表達(dá)終濃度1mmol/LMPP與肉蓯蓉提取物分別為1、10和100卩g/ml，同時(shí)加入6孔板置5%CO培養(yǎng) 箱37C孵育48h。取出6孔培養(yǎng)板，PBS沖洗，按Trizol法提取總RNA取1卩gRNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。聚合酶鏈反應(yīng)總體積為25卩1。引物序列為：GADD153上游引物，5GC；-CCTCC：CAGA&CCCTCACTCTCC 3 ' ；下游引物，5GTCTAC

7、TCCAAGCCTTCCCCCTGCG 3' 3 min 上游引物，5'ATCGTGGGCCGCCCTAGGCAC 3 ' ；下游引物TGGCCTTAGGGTTCAGAGGGGC 3'擴(kuò)增目的產(chǎn)物的長度分別為422bp和244bP。94C預(yù)變性5min。循環(huán)參數(shù)為：95C變性0.5min , 60C退火0.5min , 72C延伸1min,共35個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物4卩l(xiāng)，電泳后拍照。124Westemblotting檢測 GADD153蛋白表達(dá)終濃度 1mmol/LMPP與肉蓯蓉提取物分別為1、10和100卩g/ml ,同時(shí)加入6 孔板置5%CO培養(yǎng)箱37C孵

8、育48h。取出6孔培養(yǎng)板，PBS沖洗，加 入60卩l(xiāng)蛋白裂解液裂解，超聲震蕩，100C變性10min。用Lowry 法測定樣品蛋白濃度。電泳：積層膠 60V30min,分離膠120V90min;PVDF膜轉(zhuǎn)膜110V100min加1 : 50小鼠抗人GADD15單克隆抗體，4C過夜。TBST溶液洗滌3次，10min/次，加含HRP的兔抗小鼠二抗室 溫孵育2h,化學(xué)發(fā)光法顯影X膠片。膠片用Alphalmage950自動(dòng)掃 膠系統(tǒng)得到條帶灰度值。每個(gè)樣本的免疫印跡條帶均與同一樣本的3actin比較后作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5軟件3 / 9對SH SY5Y細(xì)胞存活率的影響不同

9、濃度MPP作用SH SY5Y細(xì)胞后,細(xì)胞存活率隨MPP的濃度增加而降低；MPP +1mmo 1/1濃度狀態(tài)下細(xì)胞存活率隨時(shí)間增長而降低。呈現(xiàn)明顯的量效與時(shí)效關(guān)系。見圖1。其中MPP +1mmol/組在48h存活率為（45.30 士 3.21）% 低于50% 故選用1mmol/L MPP作為制作帕金森病細(xì)胞模型的處理劑量。圖1不同濃度 MPP+對 SH SY5Y 存活率的影響（略）FigurelEffectsofdiffere ntc oncen trati on sof MPP+on cellviabilit yofSH SY5Y2. 2：肉蓯蓉提取物對1mmol/LMPP介導(dǎo)的SH SY5Y

10、細(xì)胞存活率的影響肉蓯蓉提取物對 MPP介導(dǎo)的損傷有明顯的保護(hù)作用。保護(hù)作用隨濃度增加而加強(qiáng)。MPP +1mmol/處理的細(xì)胞48h存活率為（45.30 士 3.21 ） %, 1卩g/ml肉蓯蓉提取物處理的細(xì)胞存活率為(85.97 士 3.41 ) % 10 a g/ml 為(129.97 士 4.84 ) % 100 卩 g/ml 為（164.10 士 3.91 ） %三種濃度與 MPP +1mmol/l對照處理比較，細(xì)胞2。2.3存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PV 0.01 ）。提示肉蓯蓉提取物不僅有較好 的神經(jīng)保護(hù)作用，而且還可能有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。見圖 肉蓯蓉提取物對 MPP介導(dǎo)的帕金森病

11、細(xì)胞模型 GADD153mRNA達(dá)的影響MPP +1mmol/處理SH SY5Y細(xì)胞后，在膠上觀察到GADD153mRNA水平明顯較對照組明亮，統(tǒng)計(jì)出的結(jié)果也表明兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義（PV 0.01 ）。肉蓯蓉提取物組與 MPP+1mmol/L處理組相比,GADD153mRN平不僅在膠上顯示出其隨著肉蓯蓉提取物濃度的增加而條帶逐漸變暗，對其掃描統(tǒng)計(jì)分析出的結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)，肉蓯蓉6/S畜旱多出9軸呂興呀® Et弓畜旱多d沒目'姒II前駆軸晉血另皇軸®由1?+ddlAI 軸丁畀冏"？書羊9BC1V9 血華畜旱多 6u!BO|qujeiseMgrM8l7

12、BWl/|oinin l.+ddlAI 踰簷軸興華日 SS BG V9 nSBWffllMWW 軸昔4ddl/l 駆(#迪莆落畀呦 i7 2 dnoj6|O4UOOSA |.0 0d vVdnojB+ddlAISA 1.00cl*uo!SsejdxevNd£S IQQVOBuiSBejoepjoAiiHqBdBOiueiieoxe p9MOLjssQe!X99Ljoue!S!oe|!LjM'+ddl/n/|owwLA qp eieejiBuieqjeyBieAeiiuBOijiuBiSBOi p9SBaiou!£gLCCV9jouo!Ssaidx9VNBU(

13、3;mO)dnoj6|iju/6 ri o(HPUB(乙3O)dno6|iJU/6 訶 oi/UmcOdno6|iJU/6 訶 ispe4xeeqouBiS!O'(|/|)d ncuB+ddlATd no6|O!UOOU!£gLCCV9jouo!Ssedx旳©叫即0口町HWOfU卩90叩叮 +HaRJOg5ia0V9,PUOTSS9Jdx9VNiPi uospBJixeeqouBiS!Ojosuo!iBJiueouooiuejej4!Pjosioej43£ej nBy踰簷軸興華vNywesLGGVQ制礪腸野華昔號ddlAI 駆(#迪莆落畀呦 £

14、dnojBioJiuoosA |.0 0d VV td n oj6+dd|/|SA l00cl*d no6+ddl/|s/m!i!qe!AJ9Lj6!Lj peqxesd noBsiOBJixeeqouBisi op ue'd no6|oquoos/m!i!qe!/9MO|B peqsiieop0護(hù)泊+ddK *iueiJuiBe4+dcllAll/|oiuiJui，emuoe|OjeA!peiojdBpeqUO)siOBJixeeqouBiS!Ojosuo!iBJiueouooeejmemiiv|9 poiujeiniieo(dp 5311 pUT-HHPfUOSHOE 工 J 工d

15、0Lpin3yS!JJOlO0JJ9創(chuàng)ITlOBlOJHgdJHSlH宙助出制軸制 W 腸野華等W軸昔號ddlAI駆(#迪莆落畀呦乙® °£呦舌晉血和劉唯沒目"(10 0 >d )和劉晉血去$9smav9 b致（Pv 0.01 ）,而1、10和100 a g/ml肉蓯蓉提取物卻逐漸降低了GADD15蛋白的表達(dá)，且這種表達(dá)與MPP組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pv 0.01 ）。見圖4。圖4肉蓯蓉提取物對MPP介導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模 型 GADD153蛋 白 表達(dá) 的影 響 （略）Figure4Effectsofdiffere ntconcen trati

16、on sofCista ncheextractsonproteinexpressionofGADDlcSofMPP+ inducedPDceilularniodeiExpress 1 oriofGADDI53pr()t.ei rii ncontrol groiip, HPP+巳上ited:巴 1 丨 s (M),Cistancheextracts1 a g/ml(CE1),10 a g/ml(CE2)and100 a g/ml(CK3) prelr eatedgroups. GADDI53pioteine戔pressionofMPP+ treatedcellsi ncreasedtoasig

17、nifica ntlevel,a ndCista ncheextracts pre treatme ntdecreasedthe protei nexp ressi on byasig nifica ntlevel.*P0.01,vsMPP+group; P0.01,vscontrolgroup.3討論以往的研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在帕金森病的發(fā)病機(jī)制中占有很重要的地位2,3 。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中，肝F 6, IRE1和PERK三條通路都可以直接或間接地激活GADD153進(jìn)而使正常細(xì)胞內(nèi)低水平表達(dá)的 GADD15過量表達(dá)并轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡4,5 。而GADD15敲除小 鼠能減少甚至阻止

18、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和神經(jīng)營養(yǎng)因子剝奪所導(dǎo)致的細(xì)胞凋 亡6,7 。帕金森病的典型病理表現(xiàn)是中腦多巴胺能神經(jīng)元的減少, 而這種減少目前認(rèn)為多與細(xì)胞凋亡有關(guān)8 。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在1mmol/LMPP處理SH SY5Y細(xì)胞48h后，細(xì)胞的存活率已經(jīng)低于50%而此時(shí)GADD153的mRNA和蛋白水平與對照組相比明顯增加（ Pv 0.01 ）,這一結(jié)果也與Conn等9的發(fā)現(xiàn)相一致。因而 GADD153勺9 / 9范文最新推薦升高與細(xì)胞損傷之間有著緊密的聯(lián)系。肉蓯蓉提取物是從管花肉蓯蓉 中分離、純化的一種化合物。中醫(yī)認(rèn)為肉蓯蓉具有補(bǔ)腎陽、益精血、 潤腸通便的功效，主治男子陽痿、女子不孕、血枯便秘等證，有“沙 漠人

19、參”的美譽(yù)。以往的研究表明肉蓯蓉可以提高多種中樞神經(jīng)遞質(zhì) 的含量，具有很強(qiáng)的抗氧化作用，還可延長動(dòng)物壽命和抗衰老。而對 肉蓯蓉提取物的研究也表明肉蓯蓉的提取物具有抗凋亡的作用1012。本實(shí)驗(yàn)的MTT吉果表明1、10和100 a g/ml肉蓯蓉提取物的細(xì)胞存活率均比 MPP組明顯增高（PV0.01 ）,而且細(xì)胞存活率與 肉蓯蓉提取物濃度呈劑量依賴關(guān)系。因此我們的結(jié)果表明肉蓯蓉提取物對MPP介導(dǎo)的損傷具有保護(hù)作用。RT卩CR和Westernblotting的 結(jié)果顯示，GADD15的表達(dá)與對照組相比也明顯降低。其中在肉蓯蓉 提取物最高濃度組（100 a g/ml ） GADD153mRNA平降至U

20、了最低（Pv0.01 ）, Westernblotting的結(jié)果也發(fā)現(xiàn) GADD153勺蛋白表達(dá)同時(shí)降到了最低（Pv 0.01 ）?；谏鲜鼋Y(jié)果，我們認(rèn)為肉蓯蓉提取物對 MPP+介導(dǎo)的SH SY5Y細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用可能是通過調(diào)控GADD153來 實(shí) 現(xiàn) 的?！緟?考 文 獻(xiàn)】10yadomariS,MoriM .R olesofCH OP/GADD153i nendop lasmicreticulumstress. Cel IDeathDiffer, 2004; 11 (4) :381389, SUndholiTil), iVootzH,Korh onen L.ERstressa ndn

21、 eurodege nerativediseases.CellDeathD iffb. 20()6; 13：3&5 392. SIwiY, SodaM,I noueH,etal.A nun fold edp utativetra nsmembra nep oly pep tide,whichca nieadtoe ndop lasmicreticulumstress,isasubstrateofParki n.Cell.2001;105(7):891902. 4YaiiiamLiroA, YoshiokaY, OgitaK, etai. involvemenrofendopiae i

22、nhunianneuTO b 1 as t oniaSHsmicreticLiiLinistressontheceildeathindLicedbyS hydroxydopam inSYSYcells. NeurocheiiiRes. 2(X)6; 31(5):657 664. SHoitzWA, O' ' ' ' MaiieyKL, OgitaK.卩arkinsoDinnminietics in duceas pectsof un folded prote inresponsein deathofd opaminergi cneiiroris. JBi o 1

23、 Chem. 2003; 27S )：1936719377. 6TriJi ri S, OyadomariS,YanoS,etal.ischemi a 1 nducodnouroral ccl 1 dcdthi sinet.iatedbythee ndop lasmicreticulumstress pathwayi nv olvi ngCH OP .CeI 1 DeaiJiDiffer. 2004; 11 (4) :4O：3415. TTajiriS, YarioS, MoriokriM,巳tal.CH OP isi nv olvedi nn euro nala pop tosisi nducedb yn eurotro phicf上1:1)廠血右譏.代 ion. I'KBSLett. 2006; 580 (14) : 3462346 8.8ChenJ,TangXQ