平滑肌細胞培養(yǎng)-文獻版

1、01年 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志 貼壁法原代培養(yǎng)1.1細胞培養(yǎng)1.1.1 培養(yǎng)液配制 DMEM（美國 Gibco 公司,Hepes（15mmol/L）,霉素（lOOu/ml）,鏈 霉素（lOOmg/mlhft質(zhì)胎牛血清（原代培養(yǎng)濃度20%,傳代培養(yǎng)濃度10%,美國Hyclone）。1.1.2 培養(yǎng)器皿 25cin2塑料培養(yǎng)瓶（Costar）,培養(yǎng)面積25cm2;直徑3.5cm培養(yǎng)皿。1.1.3大鼠血管平滑肌細胞培養(yǎng) 動物來源:健康Wistar大鼠，由第三軍大學(xué)實驗動物中 心提供，雌雄不拘，體重150180g。動脈取材:斷頸法處死Wis-tar大鼠，無菌條件下分離全 段主動脈，立即直于含青霉素lOOu/

2、ml,鏈每素lOOmg/ml的無菌生理鹽水中。每次取材 23貝大鼠。貼壁法原代培養(yǎng):超凈工作臺上,清除結(jié)締組織，剝除動脈外膜?？v向剖開血管, 用眼科彎懾鈍性刮除內(nèi)膜面，以去除內(nèi)皮細胞，剩余血管中膜組織較薄、透明、籾性好。用含 青、鏈霉素的生理鹽水反童沖洗，去除脂滴、血凝塊等奈質(zhì)及可能殘留的內(nèi)皮細胞和外膜成 纖維細胞，然后將一次取材的23條血管的中膜組織混合在一起，直于無菌培養(yǎng)皿中。滴加少 許培養(yǎng)液使組織保持濕潤，用眼科彎剪反負剪切成Immx imm大小的組織塊。并剪切好的 組織小塊均勻擺宣于瓶底，組織塊間距0.5cm。蓋好瓶蓋，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，讓瓶底朝上并向 瓶內(nèi)注入適量培養(yǎng)液，于379孵箱內(nèi)

3、放直24h使組織塊干涸并與瓶壁貼附后，將培養(yǎng)瓶慢 慢翻轉(zhuǎn)平放，使組織塊完全浸入培養(yǎng)液中,繼續(xù)靜直培養(yǎng)35d。待有細胞從組織塊周圍游出 后換液。1.1.4原代培養(yǎng)動脈VSMC的傳代培養(yǎng) 當大部分組織塊長出細胞皐，并與相鄰細胞的細 胞旱接觸時即可傳代。加入配制好的消化液使其恰好覆蓋細胞表面，室溫下大約l2min,倒 直顯微錯下見細胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大時迅速翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶便細胞脫離消化液,吸棄消化液, 加入含胎牛血清培養(yǎng)液34nil終止消化并反復(fù)吹打瓶壁細胞使細胞脫壁，分散為單細胞懸 液。將細胞懸液一分為二接種到新的培養(yǎng)瓶中，補足培養(yǎng)液（每瓶34ml）。未消失的組織塊 矣隨細胞換液、傳代而除去。1.3

4、培養(yǎng)細胞的鑒定1.3.1形態(tài)學(xué) 用相差顯微績常規(guī)觀寮細胞生長形態(tài)及生長規(guī)律，并依常規(guī)制作電熊標本 進行觀寮。1.3.2免疫組織化學(xué)鑒定特異性鼠抗人a-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體（福建邁新生物技 術(shù)公司），采用SP法對細胞爬片進行免疫組織化學(xué)染色。（a-SM-actin免疫組織化學(xué)鑒定）04協(xié)和中國動脈硬化雜志胰酶消化法培養(yǎng)平滑肌細胞1.1試劑和動物胰酶購自Sigma公司;a-actin抗體購自中山生物技術(shù)有限公司;PES液各成分均為市售分 析純;新生小牛血清購自HyClone;DMEM為Gibco產(chǎn)品。雄性Wistar大鼠（2只，體重175 ±25 g）購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。

5、1.2胰酶消化法原代培養(yǎng)Wistar大鼠處死，迅速取出胸主動脈，浸泡在含無菌PBS的表面皿中，轉(zhuǎn)移到無菌超凈臺。在 表面皿中漂洗主動脈去除殘留的血跡，縱向剪開主動脈，把主動脈鋪平并便內(nèi)膜朝上,用懾于 來回刮除內(nèi)膜層，剝離血管中膜。將剝離的血管中膜用眼科剪剪碎，碎片大小在1 mmxl mm左右。裝入含0.25%胰酶的玻璃培養(yǎng)瓶中于37£條件下消化。當在顯微錯下觀寮組織 塊表面出現(xiàn)大量細胞時應(yīng)立即加入血清終止消化，一般消化的時間在3.5 ho終止消化后將 一個培養(yǎng)瓶中，再次靜直、貼壁,重復(fù)上述步驟12次，最后一個培養(yǎng)瓶中可獲較純的平滑肌 細胞。（根據(jù)不同細胞貼壁的時間差純化細胞）1.4細

6、胞鑒定1.4.1形態(tài)學(xué)觀察 應(yīng)用倒宣相差顯微錯觀寮細胞大小、形態(tài)、生長特點及排列方式等。1.4.2免疫細胞化學(xué)染色 將第5代對數(shù)生長期的細胞懸液接種到預(yù)先放直2張7mmX 22mm蓋玻片的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)23d后，取出蓋玻片,PBS漂洗5minX3次,4%多聚甲醛室 溫下固定2030min,PBS再次漂洗5minx3次，然后按照SP免疫組化試劑盒和DAB顯色 試劑盒說明書逐條進行操作（一抗是鼠抗兔平滑肌a肌動蛋白單克隆抗體）。細胞培養(yǎng)的幾點技巧:相同條件下,小齡動物較大齡動物的組織塊有更好的增殖潛能，但動 物體積過小又存在取材困難，組織量少的間題，采用912d新生小鼠取材，既能對血管進行順 利操

7、作，又能保證約90%的組織塊有細胞外長。細胞生長具有接觸抑制和密度依賴性，一般 取23貝小鼠的胸主動脈組織塊均勻接種于25 mL培養(yǎng)瓶中,間隙約2-3 mm。當部分組 織塊周圍細胞密集、直疊，停止增殖時，即使整瓶細胞未達到傳代標準，仍可用酶消化,吹散密 集細胞,1 : 1方式傳代生長。原代培養(yǎng)初期，當部分組織塊漂浮未貼壁，可將其直新擺放至 瓶底，翻轉(zhuǎn)干涸23 h后，再浸沒于培養(yǎng)液中，使其重新貼壁。該法不矣影響同瓶中其他已萌 出細胞的生長。小鼠主動脈極細，操作時動作一定要輕柔，避免對血管的過度損傷。一般受 牽拉少，剪切時邊緣整齊圓滑的組織塊萌出細胞的概率較大。細胞傳代時，酶消化時間不應(yīng) 固定或硬

8、搬他人經(jīng)驗，應(yīng)在錯下觀察，至胞質(zhì)回縮，間隙增大時及時終止消化。細胞原代培養(yǎng)的常用方法有酶消化法和組織塊法，酶消化法培養(yǎng)周期短，但酶作用時間不易 掌握，且消化酶本身對培養(yǎng)細胞有毒性作用，可致培養(yǎng)失敗;組織塊法雖培養(yǎng)周期相對較長，但 操作簡便，污染機矣小，培養(yǎng)效率高3,4。本研究中由于新生小鼠主動脈細小，可供培養(yǎng)的組 織量少，于是采用了組織塊培養(yǎng)法。07濱州醫(yī)學(xué)學(xué)報改進的臍動脈血管平滑肌貼塊培養(yǎng)法用DMEM培養(yǎng)液反宣沖洗，以去掉血管內(nèi)外的血跡，用眼科檯小心分離下動脈外的結(jié)締組織 及血管外膜,然后用眼科剪縱向剪開血管，再用眼科剪將中膜和內(nèi)膜剪成約12 nini2大小的 組織塊，用彎頭吸管將血管小塊移

9、入25 cm2塑料培養(yǎng)瓶，并以47塊/cm2的密度均勻排列 于培養(yǎng)瓶底（培養(yǎng)瓶底提前用培養(yǎng)液濕潤）,翻轉(zhuǎn)后加入含有青霉素和鏈霉素及20%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液約35m,l放入379、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)（濕度100%）,貼壁23h后再輕 輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊浸入到培養(yǎng)液中，開放式培養(yǎng)，一周后取出觀寮并換液。1.2.2胎兒臍動脈血管平滑肌細胞的傳代培養(yǎng):細胞生長融合后，用0. 125%的胰蛋白酶消 化傳代。先將胰蛋白酶放入37OC水浴箱預(yù)熱。用吸管將組織塊從培養(yǎng)瓶底輕輕吹打下來， 可以將組織塊直新移入另一培養(yǎng)瓶繼續(xù)貼塊法培養(yǎng)。用無血清的培養(yǎng)液將培養(yǎng)瓶底沖洗兩遍, 洗掉殘留的血清，然后迅速加入

10、預(yù)熱的胰蛋白酶，放回培養(yǎng)箱，每隔2 min觀寮一次，并輕輕拍 打培養(yǎng)瓶壁，便細胞從瓶底脫落下來，待錯下觀寮多數(shù)細胞收縮變圓后，向培養(yǎng)瓶中加入含血 清的培養(yǎng)液，終止胰蛋白酶的作用,再用吸管輕輕吹打培養(yǎng)瓶底，使細胞脫落，然后將培養(yǎng)瓶中 的液體移入離心管，500 r/min,離心10 min后，棄上清液,然后加入含有10%胎牛血清的培 養(yǎng)液將沉淀制成均勻的細胞懸液，按1 : 2的比例將細胞懸液移入培養(yǎng)瓶，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培 養(yǎng)。1. 2. 3血管平滑肌細胞的鑒定：取常規(guī)傳代的細胞，制成均勻的細胞懸液后，移入放有蓋玻片的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細胞貼壁伸 展住長良好后取出蓋玻片，用PBS沖洗2遍，涼干，放入4%

11、的多聚甲醛中固宦,30% H2O21 份+純甲醇50份混合灰活內(nèi)源性過氧化物酶，然后熱修復(fù)抗原，再分別滴加5%BSA封閉液、 一抗即抗平滑肌a-肌動蛋白g-actin）的單克隆抗體、生物素化山羊抗小鼠IgG、試劑 SAEC,最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀 寮。2結(jié)果2. 1體外培養(yǎng)的胎兒臍動脈血管平滑肌細胞的形態(tài)觀寮 實驗中觀寮到臍動脈組織塊貼 壁后57d可見有細胞以垂直方向從組織塊周圍游走出來（見圖1）,但并不是所有的組織塊周 圍都有細胞游出，離組織塊較遠的區(qū)域也可以看到細胞,此為平滑肌細胞的漂移性生長特性 （見圖2）,細胞形態(tài)多樣，大小不一,

12、多為長梭形、菱形或星形；911 d細胞進入對數(shù)生長期, 細胞生長加速，部分區(qū)域可見“峰-谷”樣生長（見圖3）;約2周左右細胞融合成片，甚至相互交 叉生長形成多層可以進行傳代培養(yǎng)。細胞用胰蛋白酶消化后呈圓形，傳代接種于培養(yǎng)瓶4 h 就有細胞貼壁.2411后細胞伸展,細胞形態(tài)多樣，胞漿豐富,仍然呈“峰-谷”樣生長特性，細胞 生長較快，57 d長滿瓶底，可以進行傳代。本實驗取材于臍動脈，采用貼塊法成功培養(yǎng)出平滑肌細胞。臍動脈是中動脈，中膜中唯一的細 胞是平滑肌細胞，內(nèi)膜中唯一細胞的是內(nèi)皮細胞，實驗中只去除血管外膜，保留中膜和內(nèi)膜，將 中膜和內(nèi)膜一起培養(yǎng)，摒棄了傳統(tǒng)平滑肌細胞培養(yǎng)實驗中單純培養(yǎng)動脈中膜

13、的模式，將平滑 肌細胞和內(nèi)皮細胞聯(lián)合培養(yǎng)，不但節(jié)約了接種時間，而且減輕了對平滑肌細胞的機械損傷，更 有利于原代細胞的游出。本實驗將去掉內(nèi)膜的組織塊與未去掉內(nèi)膜的組織塊同時培養(yǎng)，比較 發(fā)現(xiàn)，未去掉內(nèi)膜的組織塊首先游走出細胞,而去掉內(nèi)膜的組織塊生長周期很長，甚至組織塊 死亡，沒有細胞游出。在原代培養(yǎng)時，可以看到內(nèi)皮細胞從組織塊中游走出來，但隨著原代培養(yǎng) 的進行，內(nèi)皮細胞不斷的被平滑肌細胞所覆蓋，又因在傳代過程中，內(nèi)皮細胞處于最底層而不 易被消化下來，所以內(nèi)皮細胞被淘汰，平滑肌細胞得到純化。另外，臍動脈為中動脈，內(nèi)膜中的 內(nèi)皮是單層扁平上皮，很薄，只由一層內(nèi)皮細胞組成，而中膜較厚，由1040層環(huán)行排

14、列的平 滑肌細胞組成，顯然，平滑肌細胞的數(shù)量占有絕對優(yōu)勢;而且參考相關(guān)資料和文獻6, 7,發(fā)現(xiàn) 內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)大多數(shù)用酶解法,沒有用貼法的，因此，不用擔心此方法培養(yǎng)平滑肌細胞矣被 內(nèi)皮細胞污染。鄂征組織培養(yǎng)IM.北京:北京出版社，2001: 29-30.|7） R. I弗雷謝尼著.章靜波，徐存拴譯.動物細胞培 本技術(shù)指南M.第4版.北京:科學(xué)出版社，2004: 450-451.實驗中發(fā)現(xiàn)，平滑肌細胞對溫度要求特別嚴格，培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度必須為（37±0. 5）9,而成纖 維細胞在（35±0. 5"就可以生長。另外，在原代培養(yǎng)中組織塊的密度要盡量大，因為組織塊 之間可以

15、產(chǎn)生微量的相互作用;而且所用的眼科剪必須鋒利，以減少對組織塊的機械損傷，還 可以保持組織塊周圍的整齊，利于細胞游走出來。在原代培養(yǎng)換液時，為避免將組織塊晃動下 來，可以先將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，換液完成后再將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)。在傳代時，必須把胰蛋白酶的溫度 控制在379,使其活性最大，保證最大程度地把細胞消化下來。06江西醫(yī)藥平滑肌細胞培養(yǎng)的綜述2.1平滑肌細胞培養(yǎng)技術(shù)有文獻認為組織塊+酶消化法，能夠縮短培養(yǎng)時間，更易獲得大量較純的原代細胞，方法是:將 剪碎的平滑肌組織塊用0.1%膠原酶379消化0.5Ih后，再接種于培養(yǎng)瓶壁上,379培養(yǎng) 箱中靜直24h,待組織塊貼壁牢固后，再補加含胎牛血清的培養(yǎng)液,3

16、7£繼續(xù)靜直培養(yǎng)。此 種方法細胞游出貼壁時間比傳統(tǒng)組織塊法短12d,可能是由于組織塊被膠原酶消化后其細 胞間質(zhì)變得疏松，細胞容易掙脫間質(zhì)束縛而萌出的緣故61 (唐槐靜,段勝仲，等.胎兒動脈平滑 肌細胞培養(yǎng)方法的研究湖北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,1999,20(2):89)2.2平滑肌細胞的生物學(xué)特性2.2.1平滑肌細胞生長過程:不同種類的平滑肌細胞培養(yǎng)具有相似的生長過程。貼塊法培養(yǎng) 的平滑肌細胞,37d開始以垂直方向從組織塊邊緣遷移萌出;67d細胞進入對數(shù)生長 期;7lOd當組織塊中大部分細胞萌出后，組織塊便自行脫離，其周圍細胞密度更加增大，部 分區(qū)域細胞相互接觸交替生長，出現(xiàn)“峰-谷”結(jié)構(gòu)(峰

17、:即多層細胞丘，可達810層,谷:即稀 疏排列的單層細胞處，甚至無細胞處),這是平滑肌細胞的特征性生長表現(xiàn)；1014d細胞相互 融合。傳代細胞的生長特性與原代細胞基本相同，細胞傳代的間隔期一般為69d,傳代開始 時細胞呈圓形，不透明，邊緣清楚，而后逐漸伸展貼壁，透明度增高，周界不清,呈典型“峰-谷” 樣生長。酶消化法培養(yǎng)的平滑肌細胞，培養(yǎng)Id后，大部分細胞巳貼壁，棧液后繼續(xù)培養(yǎng)3d,貼壁細胞完 全伸展，多數(shù)呈長梭型，細胞伸出較長的突起相互接觸,部分區(qū)域可見典型的“峰-谷”結(jié)構(gòu)，培 養(yǎng)79d細胞鋪滿瓶底。培養(yǎng)細胞達鋪滿狀態(tài)所需時間與細胞活力和細胞接種密度有關(guān)，細 胞活力愈大，接種密度愈大,達到鋪

18、滿狀態(tài)所需時間愈短78。2.2.2平滑肌細胞形態(tài)學(xué)特征:許多研究證實，體外培養(yǎng)的平滑肌細胞具有與體內(nèi)平滑肌細胞 相同的形態(tài)學(xué)特征。倒直顯微錯下觀察細胞形態(tài)，未貼壁前細胞呈圓形或橢圓形,胞質(zhì)密度高, 不透明，胞核多為卵圓形，有多個核仁，貼壁后細胞胞質(zhì)透明，彼此融合在一起,細胞呈梭形或 多角形，核居中央，呈橢圓形。透射電機下觀寮，細胞呈不規(guī)則形態(tài)，核呈鋸齒狀，胞漿內(nèi)含平滑 肌細胞特征性結(jié)構(gòu)肌絲和密體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，游離核糖體豐富,基膜下有密斑。掃描電機下 可見細胞呈帶狀，平行排列,細胞周邊常發(fā)出許多絲狀突起與相鄰細胞的絲狀突起交織成網(wǎng) 狀。此外，在細胞表面還可見許多疏密不等的小泡，可能為平滑肌細

19、胞收縮運動時胞漿外突的 形態(tài)表現(xiàn)9,1002動脈平滑肌細胞培養(yǎng)的幾個問題組織塊大小邊緣密度翻面時間觀寮時間對原代細胞萌發(fā)的影響對于貼塊法的原代培養(yǎng)來源，由于細胞并非直接獲得，而是從組織塊邊緣長出，其中有一 “突破過程”，且細胞萌發(fā)后尚需一宦的細胞密度才能便其存活、增殖，故組織塊大小、邊緣、 密度均影響細胞萌出與否及細胞存活、增殖。公認的方法是將血管剪成1 nim2大小組織塊 (l3o張映娜等認為組織塊0.52 mm2范圍內(nèi)，大小影響不大(可調(diào)整翻瓶時間以保證組 織塊貼壁)4。但如組織塊超過2 mm2將增加細胞萌出的阻力。而組織塊邊緣整齊、光滑、 密度亦對細胞生長起看重要作用。組織塊邊緣過度受損或毛糙不平及組織塊密度過稀或重査將使 細胞很難萌出。作者認為剝除內(nèi)膜、外膜時用力適中,避免機械拉傷，將橇于夾過處切去，剪切 時力求一次剪斷。切組織塊時不要離開培養(yǎng)液操作,保持邊緣濕潤，組織塊密度以中瓶(100 ml)鋪放取自68只150250 g大鼠胸主動脈剪碎組織為宜，而小瓶(70 ml)則以34貝為 佳，且相同重量的大鼠，以月齡較小者為優(yōu)。翻面時間一般認為36 h,具體時間應(yīng)根據(jù)上述影 響