高效液相色譜法標準操作規(guī)程

1、2.目的：建立高效液相色譜法標準操作規(guī)程 范圍：適用于原輔、成品的高效液相色譜法檢測。 責任人；QC負責實施，QC主管負責監(jiān)督。程序：檢驗依據(jù)中華人民共和國藥典2005年版二部附錄P28 檢驗規(guī)程題 U高效液相色譜法標準操作規(guī)程編碼SOP-ZL-QC-002-00制訂人日期審核人日期批準人日期頒發(fā)部門頒發(fā)日期分發(fā)部門質(zhì)量管理部生效日期變更記載：申請日期：批準日期：變更摘要：3.4.4.14.24. 2.2對儀器的一般要求 所用的儀器為高效液相色譜儀，儀器應定期檢定并符合有關 規(guī)定4. 2. 2.1色譜柱 最常用的色譜柱填充劑為化學鍵合硅膠。反相色譜系統(tǒng)使用非極性填 充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠

2、最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅 膠（如St基硅烷鍵合相和氨基硅烷鍵合相等）也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充常 用的填充劑有硅膠等。離子交換填充劑用于離子交換色譜；凝膠或高分子多孔微球等填 充劑用于分子排阻色譜等；手性鍵合填充劑用于對映異構(gòu)體的拆分分析。填充柱的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳 量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響待測物的保留行為和分離效果。孔徑在 15nin以下的填料適合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物則應 選擇孔徑在30nin以上的填料。以硅膠為載體的一般鍵合固定相填充劑適用PH28的流

3、動相。當PH大于8時，可使載體硅膠溶解；當PH小于2時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統(tǒng)中需使用PH大于8的流動相時，應選用耐堿的填充劑，如采 用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠、包覆聚合物填充劑、有機一無機朵 化填充劑或非硅膠填充劑等，當需使用PH小于2的流動相時，應選用耐酸的填充劑， 如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷 、鍵合硅膠、有機一無機雜化填充劑等。4. 2. 2. 2檢測器 最常用的檢測器為紫外檢測器，其他常見的檢測器有二極管陣列檢測器 (DAD)、熒光檢測器、示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、電化學檢測器和質(zhì)譜檢測 n

4、o d*- 祜寸0紫外、二極管陣列、熒光、電化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與待測溶 液的濃度有關，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關；示差折光檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器為通用型 檢測器，對所有的化合物均有響應；蒸發(fā)光散射檢測器對結(jié)構(gòu)類似的化合物，其響應值 兒乎僅與待測物的質(zhì)量有關；二極管陣列檢測器可以同時記錄待測物在規(guī)定波長范ffl內(nèi) 的吸收光譜，故可用于待測物的光譜鑒定和色譜峰的純度檢査。紫外、熒光、電化學和示差折光檢測器的響應值與待測溶液的濃度在一定范ffl內(nèi)呈 線性關系，但蒸發(fā)光散射檢測器響應值與待測溶液的濃度通常并不呈線性關系，必要時 需對響應值進行數(shù)學轉(zhuǎn)換后進行計算。不同的檢測器，對流動相的

5、要求不同。如采用紫外檢測器，所用流動相應至少符合 紫外一可見分光光度法項下對溶劑的要求；采用低波長檢測器時，還應考慮有機相中有 機溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機溶劑。蒸發(fā)光散射檢測器和質(zhì)譜檢測器通常 不允許使用含不揮發(fā)鹽組分的流動相。4. 2. 2. 3流動相由于G鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展狀態(tài)，故對于十八烷基硅烷鍵合 硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動相中有機溶劑的比例通常應不低于5%,否則G鏈 的隨機卷曲將導致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組成、檢測器類型不得改變外，其余 如色譜柱內(nèi)徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組

6、成的比例、 柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應具體的色譜系統(tǒng)并達到系統(tǒng) 適用性試驗的要求。但對某些品種，必須用特定牌號的填充劑方能滿足分離要求者，可 在該品種項下注明。4. 2. 3系統(tǒng)適用性試驗色譜系統(tǒng)的適用性試驗通常包括理論板數(shù)、分離度、重復性和拖尾因子等四個指 標。其中，分離度和重復性是系統(tǒng)適用性試驗中更具實用意義的參數(shù)。按各品種項下要求對色譜系統(tǒng)進行適用性試驗，即用規(guī)定的對照品對色譜系統(tǒng)進 行試驗，應符合要求。如達不到要求，可對色譜分離條件作適當?shù)恼{(diào)整。4. 2. 3.1色譜柱的理論板數(shù)（n）在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下 規(guī)定的內(nèi)標物質(zhì)溶液，記錄色譜

7、圖，量出供試品主成分峰或內(nèi)標物質(zhì)峰的保留時間ta（以分鐘或長度計，下同，但應取相同單位）和半高峰寬（耳，），按n=5.54 tn “（嘰匕計算色譜柱的理論板數(shù)。4. 2. 3. 2分離度（R） 無論是定性鑒別還是定量分析，均要求待測峰與其他峰、內(nèi)標峰 或特定的雜質(zhì)對照峰之間有較好的分離度。分離度的計算公式為：2 （ti； txi）R=W,+W：式中ta：為相鄰兩峰中后一峰的保留時間；切為相鄰兩峰中前一峰的保留時間；%和Wc為此相鄰兩峰的峰寬。除另有規(guī)定外，定量分析時分離度應大于1.5。4. 2. 3. 3 ®復性 取各品種項下的對照溶液，連續(xù)進樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積 測量值的

8、相對標準偏差應不大于2.0%。也可按各品種校正因子測定項下，配制相當于 80%、100%和120%的對照品品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標溶液，配成3種不同濃度的溶液, 分別至少進樣2次，計算平均校正因子。其相對標準偏差應不大于2.0%4. 2. 3. 4拖尾因子（T）為保證分離效果和測量精度，應檢查待測峰的拖尾因子是否符 合各品種項下的規(guī)定。拖尾因子計算公式為：Wo, 05hT=2d：其中：Wo皿為5%峰高處的峰寬；di為峰頂點至峰前沿之間的距離。除另有規(guī)定外，峰高法定量時T應在0.951.05之間。峰面積法測定時，T值偏 離過大，也會影響小峰的檢測和定量的旌確度。4. 2.4測定法4. 2.4.1

9、內(nèi)標法加校正因子測定供試品中某個雜質(zhì)或主成分含量按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和和內(nèi)標物質(zhì)，分別配成溶液，精 密量取各溶液，配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測 量對照品和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：As/csAr/Cr式中As為內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高;校正因子f=Ar為對照品的峰面積或峰；Cs為內(nèi)標物質(zhì)溶液的濃度：G為對照品溶液的濃度。再取各品種項下含有內(nèi)標物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供 試品中待測成分（或其雜質(zhì)）和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算含量：Ax含量（CX）=fX : A s/c S式中 Ax為供試品（或雜質(zhì)）

10、的峰面積或峰高:CX為供試品（或雜質(zhì)）溶液的濃度；A S為內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高：C S為內(nèi)標物質(zhì)的濃度；f為校正因子。當配制校正因子測定用的對照溶液和含有內(nèi)標物質(zhì)的供試品溶液，使用等量同一濃 度的內(nèi)標物質(zhì)溶液時，CS二C S,則配制內(nèi)標物質(zhì)溶液不必精密稱（量）取。Ax4. 2. 4. 2外標法測定供試品中某個朵質(zhì)或主成分含量按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量） 取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對 照品溶液和供試品溶液中待測成分的峰面積或峰高，按下式計算含量：含量（CX）=5 Ar式中各符號意義同上。由于微量注射器不易精確控制進樣量，當采用外標法測定供試品

11、中某雜質(zhì)或主成 分含量時，以定量環(huán)或自動進樣器進樣為好。4. 2. 4. 3加校正因子的主成分自身對照法測定朵質(zhì)含量時，可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按 各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取雜質(zhì)對照品和待測成分對照品各適量，配制測定雜 質(zhì)校正因子的溶液，進樣，記錄色譜圖，按上述（1）法計算雜質(zhì)的校正因子。此校正 W子可直接載入各品種項下，用于校正雜質(zhì)的實測峰面積。這些需作校正計算的雜質(zhì)， 通常以主成分為參照采用相對保留時間定位，其數(shù)值一并載入各品種項下。測定朵質(zhì)含量時，按各品種項下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限 度相當?shù)娜芤鹤鳛閷φ杖芤?，進樣，調(diào)節(jié)檢測靈敏度（以噪聲

12、水平可接受為限）或進樣 量（以柱子不過載為限），使對照溶液的主成分色譜峰的峰高約達滿量程的10%25%或 其峰面積能準確積分通常含量低于0.5%的雜質(zhì)，峰面積的相對標準偏差（RSD ）應小 于10%：含量在0. 5%2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應小于5%；含量大于2%的雜質(zhì)，峰面 積的RSD應小于2%。然后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進樣。供試品溶液 的記錄時間，除另有規(guī)定外，應為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜 圖上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，依 法訃算各雜質(zhì)含量。4. 2. 4. 4不加校正因子的主成分自身對照法當沒有雜質(zhì)對照品時，也可采用不加校正W子的主成分自身對照法。同上述（3）法配 制對照溶液并調(diào)節(jié)檢測靈敏度后，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進樣，前者的記 錄時間，除另有規(guī)定外，應為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上 過雜質(zhì)的峰面積并與對照溶液主成分的峰面積比較，計算雜質(zhì)含量。若供試品所含的部分雜質(zhì)未與溶劑峰完全分離，則按規(guī)定先記錄供試品溶液的色譜圖1, 再記錄等體積純?nèi)軇┑纳V圖2。色譜圖1上雜質(zhì)峰的總面積（包括溶劑峰），減去色譜 圖2上的溶劑峰面積，