鱟試劑用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢測碳酸氫鈉注射液的研究

1、    鱟試劑用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢測碳酸氫鈉注射液的研究        摘要目的：通過試驗以確定碳酸氫鈉注射液可用細(xì)菌內(nèi)毒素代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熱原檢查法。方法：用鱟試劑和家兔做對照試驗確定靈敏度。結(jié)果：用靈敏度為0.125 EU.ml1的鱟試劑進(jìn)行內(nèi)毒素檢查比家兔靈敏度高12倍。結(jié)論：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法可以代替熱原檢查法。關(guān)鍵詞碳酸氫鈉注射液；抑制/增強(qiáng)試驗；細(xì)菌內(nèi)毒素試驗；熱原試驗Study on BET in sodium bicarbonate injection with TALZ

2、hao Xiaomeng(Zhao XM)， Yang Jiejiao (Yang JJ)， Zhu Yongquan(Zhu YQ)(The Quality-inspection Section of the Pharmaceutical Department in Shenzhen Peoples hospital Shenzhen 518019)ABSTRACTOBJECTIVE:To determine whether bacterial endotoxins test(BET) can replace the pyrogen test for the sodium bicarbona

3、te injection.METHODS:The comparative experiment of tachypleus amebocyte lysate(TAL) and rabbits were studied to determine the sensitivity.RESULTS:The sensitivity of TAL test was 0.125 EU.ml1, 12 times higher than that of using rabbits.CONCLUSIONS:BET may replace pyrogen test.KEYWORDSsodium bicarbona

4、te injection, inhibition/strengthen test, bacterial endotoxins test, pyrogen test碳酸氫鈉注射液中國藥典1995年版二部、中國醫(yī)院制劑規(guī)范第2版均一直沿用家兔法進(jìn)行熱原檢查。針對醫(yī)院制劑快速檢驗的特點，開展熱原檢查法有一定困難。我們根據(jù)鱟試劑用于藥品中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測具有靈敏、快速、實用性強(qiáng)等優(yōu)點，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法對碳酸氫鈉注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行了檢測，并發(fā)現(xiàn)按細(xì)菌內(nèi)毒素理論限值計算，此試驗濃度進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時存在假陰性反應(yīng)。針對這一問題我們對碳酸氫鈉注射液能否用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行了考察，現(xiàn)介紹如下。1

5、實驗材料和用具鱟試劑(批號970702，標(biāo)示靈敏度0.125 EU.ml-1，廈門鱟試劑廠)，細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品(批號962，每支為7200 EU，中國藥品生物制品檢定所)，鱟試劑溶解水(BET，批號970624，每支為2 ml，廈門鱟試劑廠)，碳酸氫鈉注射液(批號970512，970612，970704，深圳市人民醫(yī)院制劑中心)，ZH2旋渦混合器(天津藥典儀器廠)，試驗用家兔(新西蘭種，廣州試驗動物場)，所用試驗用具均經(jīng)除熱原處理。2實驗方法與結(jié)果2.1供試品細(xì)菌內(nèi)毒素的理論限值計算按中國藥典1995年版，本品熱原注射劑量M=10 ml.kg-1，靜脈給藥時臨床無任何不良反應(yīng)，細(xì)菌內(nèi)毒素閾

6、劑量K=5 EU.kg-1，理論限值為L=K/M=0.5 EU.ml-1。2.2鱟試劑靈敏度復(fù)核和樣品對鱟試劑抑制/增強(qiáng)試驗2.2.1鱟試劑靈敏度復(fù)核按中國藥典1995年版二部方法進(jìn)行。鱟試劑：批號970702，b=0.125 EU.ml-1。2.2.2樣品對鱟試劑抑制/增強(qiáng)試驗取溶解好的細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品，用碳酸氫鈉注射液制成含內(nèi)毒素0.5，0.25，0.125，0.0625 EU.ml-1 4個濃度。每一步均在漩渦混合器上混合30 s，將鱟試劑20管排列成5列，其中4列分別加入供試品陽性對照0.1 ml，另一列為陰性對照與鱟試劑混合，于37水浴中60 min觀察。結(jié)果表明供試品在0.5，

7、0.25，0.125，0.0625，0.03125 EU.ml-1濃度下存在抑制作用，見表1。表1鱟試劑和供試品抑制/干擾試驗試管號內(nèi)毒素濃度/EU.ml-1反應(yīng)終點濃度c/EU.ml-1鱟敏1+-試度2+-劑試3+-靈驗4+-供擾1-試試2-品驗3-干4-2.3碳酸氫鈉注射液的最高非抑制濃度實驗 取碳酸氫鈉注射液樣品，稀釋成14，16，18，110，112的濃度，混合均勻取0.1 ml加入到含有0.5，0.25，0.125，0.0625 EU.ml-1細(xì)菌內(nèi)毒素的鱟試劑中，37水浴1 h觀察，結(jié)果見表2。經(jīng)實驗結(jié)果表明，碳酸氫鈉注射液濃度在16或以上時，對鱟試劑有抑制作用；在18以下時，沒有

8、抑制作用；故碳酸氫鈉注射液最高非抑制濃度為18，試驗濃度為110。試驗結(jié)果見表2。表2供試品的最高非抑制濃度試驗鱟試劑樣品批號稀釋倍數(shù)反應(yīng)終點濃度c/EU.ml-1對照溶解水970512原液12EU/ml14批號97061216970704189707021101122.4碳酸氫鈉注射液試驗濃度的干擾試驗 選取3批樣品進(jìn)行干擾試驗，用110的供試品將每支為10 EU細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制成0.5，0.25，0.125，0.0625 EU.ml-1 4個濃度，測試110試驗濃度下對鱟試驗的干擾情況。其結(jié)果表明，3批碳酸氫鈉注射液樣品對鱟試驗均未出現(xiàn)抑制或增強(qiáng)。2.5家兔法和鱟試驗法比較2.5.1

9、用鱟試劑溶解水，將國家標(biāo)準(zhǔn)品962，每支為7200 EU稀釋成適當(dāng)濃度，加至碳酸氫鈉注射液中，使之制成含內(nèi)毒素1.0，1.2，1.5 EU.ml-1的溶液，分別按熱原檢查法和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法對各種濃度的內(nèi)毒素溶液進(jìn)行檢查。試驗結(jié)果表明，樣品內(nèi)含1.0，1.2 EU.ml-1的內(nèi)毒素均未引起家兔反應(yīng)，內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品在劑量為1.5 EU.ml-1時可致家兔明顯發(fā)熱反應(yīng)，而這3種濃度下的鱟試驗法均為陽性反應(yīng)。結(jié)果見表3。通過試驗表明，細(xì)菌內(nèi)毒素法在內(nèi)毒素濃度為0.125 EU*ml-1時鱟試劑已凝集，按兩種方法產(chǎn)生實驗反應(yīng)時內(nèi)毒素濃度之比1.5/0.125=12，即確定內(nèi)毒素法靈敏度是熱原法的12倍。

10、表3熱原法和細(xì)菌內(nèi)毒素法的比較內(nèi)毒素濃度/EU*ml-1體重kg第一次測溫第二次測溫平均體溫注射后第一次測溫注射后第二次測溫注射后第三次測溫最高溫度溫差加入內(nèi)毒素濃度(EU.ml-1)樣品濃度(110)注：按家兔10 ml/kg劑量注射。實驗時室溫為26，室內(nèi)無任何干擾3討論3.1碳酸氫鈉注射液的PH為7.58.5左右。將原液或12溶液加入鱟試劑中后，出現(xiàn)白色混濁。通過抑制試驗表明，對鱟試劑的凝集反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)烈干擾，出現(xiàn)假陰性；在濃度18時，則無干擾。3.2碳酸氫鈉注射液按最大有效稀釋倍數(shù)D=L/計算應(yīng)稀釋4倍，但經(jīng)最高非抑制濃度試驗表明，在此濃度下仍有干擾，故加大稀釋倍數(shù)。通過抑制/增強(qiáng)試驗表明，將碳酸氫鈉注射液樣