豬凋亡相關因子(FAS)ELISA試劑盒使用說明書

1、豬凋亡相關因子（FAS）ELISA試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用產品編號：E0030p預期應用ELISA法定量測定豬血清、血漿、細胞培養(yǎng)物上清或其它相關液體中FAS含量。實驗原理本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中FAS水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入FAS抗原、生物素化的抗豬FAS抗體、HRP標記的親和素，經過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的FAS呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。 試劑盒組成及試劑配制 1. 酶聯板

2、：一塊（96孔） 2. 標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為3000 pg/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成3000 pg/mL，1500 pg/mL ，750 pg/mL，375 pg/mL，187 pg/mL，93 pg/mL，46 pg/mL，其原液直接作為最高標準濃度，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/mL，臨用前15分鐘內配制。如配制1500 pg/mL標準品：取0.5ml 3管中，混勻即可，其余濃度以此類推。3. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。4. 檢測稀釋液A：1×10ml

3、/瓶。5. 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。6. 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。7. 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。8. 底物溶液：1×10ml/瓶。 9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 標本的采集及保存 1細胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將

4、標本保存于-20，且應避免反復凍融。2血清：標本請于室溫放置2小時或4過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20保存，但應避免反復凍融。3血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20保存，但應避免反復凍融。注：標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。操作步驟各試劑在使用前平衡至室溫。實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，應在試管中將樣品用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試

5、劑盒的檢測范圍。1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00ul，余孔分別加標準品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37反應120分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制），37,60分鐘。3. 溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。 4. 每孔

6、加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul，37，60分鐘。5. 溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。6. 依序每孔加底物溶液90ul，37避光顯色（30分鐘內）（此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）。7. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。8. 用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內進行檢測。注：1 每

7、次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。 2為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜。3. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8保存。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配置使用，不要一次用完。請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。4. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1

8、-2分鐘，根據需要，重復此過程數次。自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。特異性 本試劑盒可同時檢測重組或天然的豬FAS，且與其它相關蛋白無交叉反應。計算 以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。 注意事項1 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。2 一次加樣時間最好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。3 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。4 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請最后乘以稀釋倍數。5在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。6底物請避光保存。檢測范圍：46 pg/mL -3000 pg/mL說明 1試劑