Skp2、p27在骨肉瘤中的表達(dá)及其臨床意義

1、Skp2、p27在骨肉瘤中的表達(dá)及其臨床意義                作者：張勁松，楊述華，陳述偉，吳強(qiáng)【摘要】  目的 探討骨肉瘤中Skp2和p27蛋白的表達(dá)與患者臨床病理和預(yù)后的關(guān)系以及兩種蛋白之間的相關(guān)性。方法 用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)16例骨軟骨瘤和48例骨肉瘤組織中Skp2和p27蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 Skp2蛋白在骨軟骨瘤中的表達(dá)均為陰性，而在骨肉瘤中的表達(dá)陽(yáng)性率為43.75%（21/48），后者的陽(yáng)性率顯著高于前者(P0.01

2、)。Skp2蛋白表達(dá)與臨床分期、肺轉(zhuǎn)移及分化程度顯著正相關(guān)(P0.05)。p27蛋白在骨軟骨瘤、骨肉瘤中陽(yáng)性率分別為81.25%(13/16)、47.92%(23/48)，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。p27蛋白表達(dá)與臨床分期、肺轉(zhuǎn)移及分化程度呈負(fù)相關(guān)(P0.05)。Skp2蛋白在骨肉瘤中表達(dá)與p27蛋白呈負(fù)相關(guān)(P0.05)。結(jié)論 Skp2可能通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期抑制因子p27蛋白的降解而參與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展，聯(lián)合檢測(cè)Skp2及p27蛋白的表達(dá)對(duì)骨肉瘤患者的早期診斷，判定惡性程度及預(yù)后具有指導(dǎo)意義。 【關(guān)鍵詞】  骨肉瘤；Skp2；p27；細(xì)胞周期Expression of

3、 Skp2 and p27 in Osteosarcoma and Their Clinical SignificanceAbstract：Objective  To investigate the expression of Skp2 and p27 and their association with clinical, histologic characteristics in osteosarcoma, the correlation between expression of Skp2 and p27 in osteosarcoma. Methods  Skp2

4、protein and p27 protein were examined by using immunohistochemical SP staining method in 48 cases of osteosarcoma and 16 cases of osteochondroma. Results  Negative expression of Skp2 was detected in all osteochondroma. In contrast, it was detected in 43.75%(21/48)of osteosarcoma. Positive expre

5、ssion of Skp2 was detected significantly more frequently in osteosarcoma than that of osteochondroma. Skp2 protein expression in osteosarcoma was positively associated with the clinical stage and differentiation. The positive rate of p27 protein in osteochondroma and osteosarcoma were 75%(12/16) 、47

6、.92% (23/48), significant difference was found between these two groups. p27 protein expression in osteosarcoma was negatively associated with the clinical stage and differentiation. Skp2 was inversely associated with expression of p27 in osteosarcoma. Conclusion  Skp2 expression might play an

7、important role in the development and progression of osteosarcoma via cyclindepended kinase inhibitor p27 proteolysis, and the combined examination of Skp2 and p27 expression might be a guide for early diagnosis and a determinant of malignancy and prognosis of osteosarcoma.Key words：Osteosarcoma；Skp

8、2；p27；Cell cycle0  引言   Skp2是新近發(fā)現(xiàn)的一種癌基因，能對(duì)多種靶蛋白進(jìn)行降解而與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)。p27是公認(rèn)的抑癌基因，控制細(xì)胞周期G1S的轉(zhuǎn)換。近年來(lái)研究表明，腫瘤中Skp2表達(dá)增高常伴隨p27表達(dá)降低。而且在Skp2和p27同時(shí)異常表達(dá)時(shí)，患者預(yù)后更差。許多研究結(jié)果表明，Skp2基因在很多惡性腫瘤中都有過(guò)表達(dá), 而Skp2在骨肉瘤中的表達(dá)情況國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)骨肉瘤中Skp2和p27蛋白的表達(dá)水平，以探討它們?cè)谀[瘤中的表達(dá)特點(diǎn)以及兩種蛋白異常表達(dá)與臨床病理及患者預(yù)后的關(guān)系。1  材料和方

9、法1.1  資料 取自2000年1月2005年6月華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理確診為骨肉瘤的石蠟包埋標(biāo)本48例。其中男27例，女21例，年齡730歲，平均14歲。其中有肺轉(zhuǎn)移者16例，無(wú)肺轉(zhuǎn)移者32例。根據(jù)臨床資料，按Enneking外科分期分為：期8例；a期12例；b期22例；期6例。采用16例骨軟骨瘤石蠟包埋組織作為對(duì)照組，來(lái)源同前。其中男14例，女6例，年齡1035歲，平均19歲。兩組病例術(shù)前均未接受放療、化療及非甾體類抗炎藥。所取標(biāo)本的病例經(jīng)臨床、X片、病理確診。1.2  主要試劑 鼠抗人Skp2單克隆抗體，鼠抗人p27單克

10、隆抗體，均為美國(guó)Zymed公司產(chǎn)品，工作濃度為150。免疫組織化學(xué)染色試劑盒(SP盒)購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。1.3  實(shí)驗(yàn)方法 采用免疫組化SP法，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每例石蠟標(biāo)本4m厚連續(xù)切片，脫蠟至水，微波修復(fù)抗原，3過(guò)氧化氫處理10min以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，正常羊血清處理15min以減少非特異性背景，一抗4孵育過(guò)夜，生物素標(biāo)記的二抗處理15min，鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶復(fù)合物處理15min，DAB顯色， 自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗做陰性對(duì)照，用乳腺癌做陽(yáng)性對(duì)照。1.4  結(jié)果判斷 S

11、kp2陽(yáng)性染色呈棕黃色，主要定位于細(xì)胞核，偶可見(jiàn)細(xì)胞漿著色。p27蛋白陽(yáng)性染色呈棕黃色，定位于細(xì)胞核。隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野至少計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。Skp2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5%為陰性(-)，5%25%為陽(yáng)性(+)，25%為強(qiáng)陽(yáng)性(+)。p27陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%為陰性(-)，10%50%為陽(yáng)性(+)， 50%為強(qiáng)陽(yáng)性(+) 。1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用chisquare方法進(jìn)行2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，所有數(shù)據(jù)均利用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。2  結(jié)果2.1  Skp2在骨軟骨瘤、骨肉瘤中的表達(dá) 

12、;  Skp2蛋白在16例骨軟骨瘤中表達(dá)陰性（見(jiàn)圖1）。在48例骨肉瘤中，21例Skp2表達(dá)陽(yáng)性，Skp2的表達(dá)陽(yáng)性率為43.75（見(jiàn)圖2），表達(dá)明顯高于骨軟骨瘤（P0.01）。在骨肉瘤中，Skp2蛋白在不同年齡、性別及組織類型組中表達(dá)無(wú)顯著性差異(P0.05)，在不同病理分級(jí)、臨床分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組中，中低度分化組、b期組及有肺轉(zhuǎn)移組分別明顯高于高分化組(P0.05)、 a期組(P0.05)及無(wú)肺轉(zhuǎn)移組(P0.05)，見(jiàn)表1。2.2  p27在骨軟骨瘤、骨肉瘤中的表達(dá)   p27蛋白在骨軟骨瘤（見(jiàn)圖3）、骨肉瘤（見(jiàn)圖4）中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為81.25、4

13、7.92%，骨肉瘤中p27蛋白的表達(dá)水平明顯低于骨軟骨瘤（P0.05）。在骨肉瘤中，p27蛋白在不同年齡、性別及組織類型中的表達(dá)無(wú)顯著性差異（P0.05），而在不同病理分級(jí)、臨床分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組中，低分化組、b期組及有肺轉(zhuǎn)移組分別明顯低于高分化組(P0.05)、Ia期組(P0.05)及無(wú)肺轉(zhuǎn)移組(P0.05)，見(jiàn)表1。表1  Skp2和p27在骨肉瘤中的表達(dá)及其與臨床指標(biāo)的關(guān)系（略）         2.3  Skp2和p27在骨肉瘤中表達(dá)的相互關(guān)系   在骨肉瘤中Skp2陰

14、性(-)組中，p27表達(dá)陽(yáng)性率為66.67（18/27）；Skp2陽(yáng)性組(+)中，p27表達(dá)陽(yáng)性率為23.81（5/21）；對(duì)Skp2和p27的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩者在骨肉瘤中表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)（2=8.694，r=-0.426），（P0.01）。3  討論   Skp2作為一種Fbox蛋白在細(xì)胞周期的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，在真核細(xì)胞中，通過(guò)泛素蛋白酶降解途徑降解泛素化的蛋白質(zhì)來(lái)嚴(yán)格調(diào)控細(xì)胞周期有序進(jìn)行。其中SCF(Skp1cullinFbox蛋白)復(fù)合體起到了完成泛素化降解過(guò)程必須參與的泛素連接酶E3的作用。作為Fbox蛋白成員之一的Skp2，在SCF復(fù)合體中對(duì)蛋白底

15、物起著特異識(shí)別作用。Skp2的主要功能是作為SCF復(fù)合體的底物識(shí)別亞基，特異性識(shí)別磷酸化的底物并介導(dǎo)其泛素化降解。研究1發(fā)現(xiàn)Skp2是一種癌基因，與腫瘤的增殖、分化有關(guān)，在結(jié)、直腸癌，肺癌，前列腺癌，胃癌，乳腺癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)。Signoretti等研究發(fā)現(xiàn),在人乳腺癌中, Skp2 的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度顯著相關(guān), 分化程度好的腫瘤Skp2低表達(dá), 而惡性程度高的腫瘤Skp2高表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)Skp2高表達(dá)的水平與腫瘤高分期、病理分型有關(guān)，惡性程度越高, 侵襲性越強(qiáng), Skp2 表達(dá)水平越高。Shigemasa等發(fā)現(xiàn)Skp2在卵巢腺瘤和潛在惡性病變中幾乎缺如，而在47.3%的卵巢腺癌

16、中有表達(dá)。半定量PCR發(fā)現(xiàn)Skp2 mRNA在所有卵巢腺癌中大幅度增高。Log rank檢驗(yàn)顯示Skp2過(guò)度表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)。目前，尚未見(jiàn)Skp2在骨肉瘤組織中表達(dá)水平的報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，Skp2在骨肉瘤中的表達(dá)明顯高于骨軟骨瘤，提示Skp2參與骨組織的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程。Skp2表達(dá)與臨床分期、腫瘤分化程度及肺轉(zhuǎn)移正相關(guān)，提示該基因表達(dá)上調(diào)可能與骨肉瘤的惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。   目前已發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞周期調(diào)控因子，如E2F、cyclinD1、cyclinE、cyclinA、cyclinB、CDC25B、p21w、p27wkip1、p53都是通過(guò)Skp2泛素蛋白

17、酶體途徑的底物。其中最受人們關(guān)注的p27是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的G1期檢查點(diǎn)相關(guān)基因，負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，被認(rèn)為是一種候選的抑癌基因，p27異常表達(dá)與許多惡性腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。在有絲分裂因子的刺激下，p27羧基端的Thr187先被CDK2磷酸化，該羧基端再與Skp2的LRR結(jié)構(gòu)域結(jié)合而進(jìn)入泛素化降解。在纖維母細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)Skp2使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，在這些細(xì)胞中p27蛋白水平下降。p27(T187A)突變的靜止細(xì)胞中，p27不能被磷酸化和降解，因而抑制細(xì)胞進(jìn)入S期，表明Skp2通過(guò)調(diào)節(jié)p27的降解在G1S期轉(zhuǎn)變中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Masuda等在人胃癌中研究Skp2的臨床和生物學(xué)意義表明Skp2的mR

18、NA表達(dá)與p27蛋白呈負(fù)相關(guān)。Mantel Cox法顯示, Skp2 mRNA表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴浸潤(rùn)和組織浸潤(rùn)深度都是胃癌的預(yù)后因子, 表明Skp2 mRNA高表達(dá)雖與胃癌預(yù)后有關(guān), 但可能不是其獨(dú)立預(yù)后因子；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Skp2的胃癌細(xì)胞p27蛋白呈低表達(dá), 癌細(xì)胞生長(zhǎng)速率顯著增高，抵抗放線菌素D的凋亡誘導(dǎo), 侵襲力明顯增高。本研究發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤中Skp2蛋白表達(dá)與p27蛋白表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.426，P0.01)。提示Skp2蛋白在骨肉瘤中過(guò)表達(dá)促進(jìn)了p27蛋白的降解，使p27水平降低，促進(jìn)細(xì)胞由G1期進(jìn)展至S期，從而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展和增殖。   Skp

19、2在惡性腫瘤中的表達(dá)及相關(guān)性，使之有可能成為腫瘤治療的靶分子。Stewart等認(rèn)為西卡前列腺素能夠阻斷Skp2 mRNA傳遞信號(hào)，從而降低Skp2的表達(dá)，最終阻止p27在G1后期的降解，故抑制Fbox蛋白基因的表達(dá)，可有效抑制細(xì)胞分裂。通過(guò)轉(zhuǎn)染的反義寡核苷酸減少Skp2的表達(dá), 可抑制培養(yǎng)基上非小細(xì)胞肺癌癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，說(shuō)明Skp2有可能成為肺癌潛在的特異性治療靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)Skp2在骨肉瘤中表達(dá)增高，并與腫瘤的增殖、預(yù)后關(guān)系密切，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，其能否作為骨肉瘤治療的新靶點(diǎn)和愈后指標(biāo)可進(jìn)行更深入的研究。隨著Skp2和其他細(xì)胞周期調(diào)控蛋白、癌基因、抑癌基因關(guān)系的深入研究及

20、其調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步闡明，將為骨肉瘤的診治提供更充分的理論依據(jù)。以Skp2為靶點(diǎn)的抗癌治療有望成為骨肉瘤治療的一個(gè)新的突破口?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1Gstaiger M, Jordan R，Lim M, et alSkp2 is oncogenic and overexpressed in human cancersJ Proc Nati Acad Sci USA, 2001, 98(9):5043 5048.2Signoretti S, Di Marcotullio L, Richardason A, et al. Oncogenic role of the ubiquitin liga

21、se subunit Skp2 in human breast cancerJ. J Clin Invest, 2002, 110(5):633641.3Shigemasa K, Gu L, OBrein TJ, et al. Skp2 overexpression is a prognostic factor in patients with ovarianJ. Cancer Res, 2003, 9(5):17561763.4Ezoe S，Matsumura I，Nakata S，et alGATA2estrogen receptor chimera regulates cytokinedependent growth of hematopoietic cells through accumulation of p21(WAF1)and p27(Kip1)proteinsJ. Blood,2002,100(10):35123520.5Carrano AC，Pagano M Role of the Fbox protein Skp2 in adhesiondependent cell cycle progressionJJ Cell Biol，2001，153(7):13811390.6Malek NP，Sundberg H，Mc Grew S，et alA Mou